專利名稱：一種金槍魚碎肉蛋白抗氧化肽及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種金槍魚碎肉蛋白抗氧化肽，本發明還涉及該金槍魚碎肉蛋白抗氧化肽的制備方法，本發明還涉及該金槍魚碎肉蛋白抗氧化肽的用途。
背景技術：
抗氧化劑是一類可以阻止氧氣不良影響，幫助捕獲并中和自由基，從而祛除自由基對人體損害和保護食品免受氧化損傷變質的一類物質。抗氧化劑按照來源分為天然抗氧化劑和化學合成抗氧化劑兩類。化學合成抗氧化劑(如丁基羥基茴香醚(BHA)、二丁基羥基甲苯(BHT)和特丁基對苯二酚(TBHQ)等)由于價格便宜、活性好，因而被廣泛地應用到食品工業中阻止或延緩食品氧化變質、提高食品穩定性和延長食品貯存期。然而，世界衛生組織(FA0/WH0)、歐共體兒童保護組織(HACSG)、英國生物工業協會(BIBRA)、日本、美國的政府和組織的研究表明，合成抗氧化劑具有諸多副作用，如對人體的肝、脾、肺均有不利影響，會誘發惡性腫瘤等。所以美國食品藥品管理局(FDA)建議在一般認為安全的物質中刪去BHT ；日本有關衛生部門經研究曾做出禁止使用BHA的結論；對于TBHQ，雖然美國等少數國家批準了它在某些油脂中的使用，但歐盟、日本等國家認為它的毒理試驗資料不完善，尚未批準使用。因此，基于食品安全的考慮，化學合成抗氧化劑的應用受到了較大影響。事實也證明，在人們長期食用的食品中，天然抗氧化劑成分的毒性遠遠低于人工合成的抗氧化劑毒性。因此，近年來從自然界中尋求天然抗氧化劑的研究引起了各國科學家的高度重視。目前，世界各國已從多種植物、動物組織中提取得到了多種抗氧化活性顯著的物質，如茶葉中的茶多酚、大豆中的異黃酮、河蟹及蝦外殼中的蝦青素，枸杞中的多糖，蔬菜水果中的類胡蘿卜素和抗壞血酸等物質。而已有的研究揭示，多肽類物質也具有顯著的抗氧化活性，如存在于肌肉組織中的肌肽不僅可以有效抑制脂肪氧化，而且在肉制品貯藏時有護色作用；谷胱甘肽(GSH)亦具有抗氧化作用和整合解毒作用，并具有顯著的抗氧化作用；而以生物蛋白為原料，采用酶解技術得到的蛋白酶解物及其組成多肽也具有顯著的抗氧化活性，如Suetsuma等從酪蛋白的酶解產物中得到的純度較高的六肽Tyr-Phe-Tyr-Pro-Glu-Leu具有顯著的自由基清除作用；Chen Hua-Ming等從大豆酶解物中制備的五肽Leu-Leu-Pro-His-His具有很強的抗氧化活性；Ali Bougatef等從沙丁魚蛋白酶解物中制備的三肽Leu-His-Tyr亦顯示出顯著的自由基清除活性；Seung_Jae Lee等從鴨皮酶解物中制備的八肽His-Thr-Val-Gln-Cys-Met-Phe-Gln亦顯示出顯著的自由基清除活性；陳寧等從胡桃酶解物中制備的四肽Ala-Asp-Ala-Phe表現出與谷胱甘肽(GSH)類似的抗氧化活性；王勇剛研究發現魚精多肽中的二肽Pro-Arg可顯著清除羥自由基，而且還可有效降低MRC-5 (胚肺細胞)胞內自由基的含量，從而保護細胞避免氧化損傷。
發明內容
本發明所要解決的第一個技術問題是針對上述的技術現狀提供一種金槍魚碎肉蛋白抗氧化肽，該抗氧化肽安全無毒副作用，抗氧化活性強和易于消化吸收，可清除自由基和抑制脂質過氧化作用。本發明所要解決的第二個技術問題是提供一種金槍魚碎肉蛋白抗氧化肽的制備方法，工藝科學合理、易操作。本發明所要解決的第三個技術問題是提供一種金槍魚碎肉蛋白抗氧化肽的應用。本發明為解決上述第一個技術問題所采取的技術方案為:一種金槍魚碎肉蛋白抗氧化肽，其特征在于該抗氧化肽的氨基酸序列為Tyr-Glu-Asn-Gly-Gly SEQ ID NO:1,HR-ES1-MS 檢測給出分子離子峰539.2096 Da[M+H] +。本發明為解決上述第二個技術問題所采取的技術方案為:一種金槍魚碎肉蛋白抗氧化肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟:
1)以脫脂金槍魚碎肉作為原料，按固液比Ig:15mL 25mL加入磷酸鹽緩沖液(pH
5.5 6.5)，用HCl或NaOH調節pH到5.0 7.0，得混合液；
2)將混合液溫度升至55V 65 1:攪拌預熱10 min 15 min，按照脫脂魚肉質量的1.0 % 1.2 %加入木瓜蛋白酶，酶解溫度為55 V 65 °C，酶解時間I h 3 h，得酶解產物；
3 )將制備的脫脂魚肉蛋白酶解產物先經滅酶處理得金槍魚碎肉蛋白酶解液，再將酶解液依次經脫鹽、超濾和層析，得到抗氧化肽。作為改進，所述步驟I)中的脫脂金槍魚碎肉的制備過程為:將洗凈除雜的金槍魚碎肉按照固液比I g:l mL 2 mL放入磷酸鹽緩沖液(pH 5.5飛.5)中，用高速組織搗碎機將其處理成勻漿，然后按照體積比1:2 4放入乙醚中脫脂20 25 h，用冷凍離心機在3 5°C溫度下以4000 5000 rpm離`心10 15 min除去乙醚,收集固形物即得到脫脂金槍魚碎肉。作為優選,所述步驟2)中的木瓜蛋白酶的酶活力>1.5X IO6 U/go作為改進，所述步驟3)中的滅酶處理為:將金槍魚碎肉蛋白酶解產物升溫至90V ~ 100°C，并于此溫度保持10 mirTl5min后，冷卻至15 V ~ 25 °C，然后離心，得金槍魚碎肉蛋白酶解液。再改進，所述步驟3)的脫鹽、超濾和層析的具體過程為:
脫鹽:將得到的金槍魚碎肉蛋白酶解液制成濃度為15 mg/ mL 20 mg/mL溶液，加入到大孔樹脂層析柱進行脫鹽，然后用質量濃度45飛5%乙醇進行洗脫，得脫鹽金槍魚碎肉蛋白酶解液。脫鹽酶解液于40 °C以下低壓旋蒸除去乙醇后，冷凍干燥得脫鹽酶解物干粉；超濾:將脫鹽后的酶解物干粉溶于pH 5.5飛.5的磷酸鹽緩沖液配成8 12 mg/mL的溶液，于0.1 0.15 MPa的工作壓力和20 25 °C的工作溫度下采用超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于I kDa部分，得超濾酶解液；
層析:將上述超濾酶解液用pH 5.5飛.5的磷酸鹽緩沖液配成8 12 mg/mL的溶液，經過陰離子交換樹脂分離，用水、0.09 0.11 mol/L,0.45^0.55 mol/L和0.9 1.1 mol/L NaCl溶液進行洗脫，根據280 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，DPPH自由基清除活性最高組分為離子交換層析酶解物；將上述離子交換層析酶解物用PH 5.5飛.5磷酸鹽緩沖液配成8 12 mg/mL的溶液，經過凝膠柱層析分離，用pH 5.5飛.5磷酸鹽緩沖液進行洗脫，根據280 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，DPPH自由基清除活性最高組分為凝膠層析酶解液，將上述凝膠層析酶解液用PH 5.5飛.5磷酸鹽緩沖液配成45飛5 μ g/mL的溶液，利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)進行純化，根據抗氧化活性得I個高活性抗氧化肽Tyr-Glu-Asn-Gly-Gly SEQ ID NO:1。優選，所述大孔樹脂為DlOl。再優選，所述陰離子交換樹脂為DEAE-52纖維素，所述凝膠為葡聚糖凝膠G_25 ;所述反相高效液相色譜條件為:進樣量19 21 μ g;色譜柱為Zorbax C18;柱溫為25 °CV流動相:A為含0.1%三氟乙酸的水，B為含0.1%三氟乙酸的乙腈；梯度洗脫:0-55 min乙腈濃度從O至50%,每5 min增加5% ;洗脫速度1.0 mL/min ;紫外檢測波長280 nm。最后，所述金槍魚碎肉為鰹魚QKa tsuwonus pelami51)碎肉。本發明為解決上述第三個技術問題所采取的技術方案為:一種金槍魚碎肉蛋白抗氧化肽的應用，其特征在于Tyr-Glu-Asn-Gly-Gly SEQ ID NO:1對DPPH自由基、羥基自由基、ABTS自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用；同時，Tyr-Glu-Asn-Gly-GlySEQ ID NO:1亦顯示出良好的脂質過氧化抑制作用；Tyr-Glu-Asn-Gly-Gly SEQ ID NO:1具有安全無毒副作用、抗氧化活性強和易于消化吸收等優點，可以作為藥品、保健食品和食品添加劑進行應用。 與現有技術相比，本發明的優點在于:本發明工藝科學合理，選用木瓜蛋白酶作為酶解用酶，通過生物酶解法同時融合大孔樹脂脫鹽、超濾分級和色譜精制，酶解過程易監控，同時制得的抗氧化肽具有較高的活性；與化學合成的抗氧化劑相比較，本發明制得的抗氧化肽具有安全無毒副作用、抗氧化活性強和易于消化吸收等優點，可以作為藥品、保健食品和食品添加劑等。
圖1是本發明的陰離子交換樹脂DEAE-52纖維素層析圖2分離各組分的DPPH自由基清除活性圖3是本發明的葡聚糖凝膠G-25層析圖(A)和所分離各組分的DPPH自由基清除活性圖(B)；
圖4是本發明的葡聚糖凝膠G-25制備酶解物(F43)的RP-HPLC分析圖5是本發明的Tyr-Glu-Asn-Gly-Gly SEQ ID NO:1的反相高效液相色譜(RP-HPLC)；
圖 6 是本發明的 Tyr-Glu-Asn-Gly-Gly SEQ ID NO:1 的高分辨質譜(HR-ES1-MS)圖。
具體實施例方式以下結合附實施例對本發明作進一步詳細描述。實施例:
以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。實施例:參照圖1至圖6，一種金槍魚碎肉蛋白抗氧化肽的制備方法，制備工藝流程如下:金槍魚碎肉〃脫脂〃酶解〃酶解物〃大孔樹脂脫鹽〃超濾〃離子交換層析〃凝膠過濾層析〃高效液相色譜制備〃抗氧化肽。I)將洗凈除雜的金槍魚碎肉按照固液比I g:l mL放入磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)中，用高速組織搗碎機將其處理成勻漿，然后按照體積比1: 3放入乙醚中脫脂24 h，用冷凍離心機在4°C下以5000 rpm離心15 min除去乙醚，收集固形物，即為脫脂金槍魚碎肉；
2)將脫脂金槍魚碎肉按固液比Ig:20mL加入磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)，用0.1 mol/LHCl或0.1 mol/L NaOH調節pH到6.0，得混合液；
3)將混合液溫度升至601:攪拌預熱10 min，按照脫脂魚肉質量的1.2 %加入木瓜蛋白酶，酶解溫度為60 °C，酶解時間2 h，得酶解產物；
4)將步驟3)所得的酶解產物先經滅酶處理得酶解液，再將酶解液依次經脫鹽、超濾和層析，得到抗氧化肽，利用氨基酸序列分析和質譜測定其結構，具體過程為:
①滅酶:酶解產物升溫至90V 95°C，并于此溫度保持10 mirTl5min后，冷卻至15V 25 °C，然后離心，得酶解液；
②脫鹽:將得到的酶解液制成濃度為15mg/ mL 20 mg/mL溶液，加入到DlOl大孔樹脂層析柱進行脫鹽，然后用50%乙醇進行洗脫得洗脫液，洗脫液于40 V以下低壓旋蒸除去乙醇后進行冷凍干燥，得脫鹽酶解物干粉；
③超濾:將上述脫鹽酶解物干粉溶于磷酸鹽緩沖液(pH6.0)配成10 mg/mL的溶液，于
0.1 0.15 MPa的工作壓力和20 25 °C的工作溫度下采用超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于I kDa部分，得超濾酶解液；
④陰離子交換層析:將上述超濾酶解液用磷酸鹽緩沖液(pH6.0)配成10 mg/mL的溶液，經過DEAE-52纖維素 陰離子交換樹脂分離，用水、0.1 mol/L、0.5 mol/L和1.0 mol/LNaCl溶液進行洗脫，根據280nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，DPPH自由基清除活性最高組分為離子交換酶解液(F4)(圖1、2)；
⑤凝膠色譜層析:將所述離子交換酶解液(F4)用磷酸鹽緩沖液(pH6.0)配成10 mg/mL的溶液，經過葡聚糖凝膠G-25柱層析分離，用磷酸鹽緩沖液進行洗脫，根據280nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，DPPH自由基清除活性最高組分為凝膠層析酶解液(F43)(圖3)。⑥高效液相色譜精制:將上述凝膠層析酶解液用磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)配成50μ g/mL的溶液，利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)進行純化(條件:進樣量20 μ g ;色譜柱為Zorbax C18 (250 mm X 4.6 mm, 5 μ m);柱溫為室溫；流動相:A水(含0.1%三氟乙酸)和B乙腈(含0.1%三氟乙酸);梯度洗脫:0-55 min乙腈濃度從O至50%，每5 min增加5% ；洗脫速度1.0 ml/min;紫外檢測波長280 nm)，根據抗氧化活性得I個高活性抗氧化肽(見圖4)。⑦結構檢測:收集活性最高的I個抗氧化肽經檢測為單一峰(見圖5)，利用蛋白/多肽序列分析儀測定氨基酸序列為Tyr-Glu-Asn-Gly-Gly SEQ ID NO:1, HR-ES1-MS檢測給出分子離子峰539.2096 Da (見圖6)。將上述制得的金槍魚碎肉醇溶蛋白抗氧化肽Tyr-Glu-Asn-Gly-Gly SEQ ID NO:I進行DPPH自由基清除實驗、羥基自由基清除實驗、ABTS自由基清除實驗、超氧陰離子自由基清除實驗和脂質過氧化抑制實驗。實驗結果表明=Tyr-Glu-Asn-Gly-Gly SEQ ID Ν0:1對 DPPH 自由基(EC501.21 mg/mL)、羥基自由基(EC5tl 0.11 mg/mL), ABTS (EC50 0.13 mg/mL)和超氧陰離子自由基均具有良好的清除作用；同時，Tyr-Glu-Asn-Gly-Gly SEQ IDNO:1亦顯示出良好的脂質過氧化抑制作用。盡管已結合優選的實施例描述了本發明，然其并非用以限定本發明，任何本領域技術人員，在不脫離本發明的精神和范圍的情況下，能夠對在這里列出的主題實施各種改變、同等物的置換和修改 ，因此本發明的保護范圍當視所提出的權利要求限定的范圍為準。SEQUENCE LISTING<110>浙江海洋學院
〈120〉一種金槍魚碎肉蛋白抗氧化肽及其制備方法和用途
〈130〉2012
〈160〉1
<170>PatentIn version 3.3
〈210〉I
〈211〉5
〈212〉PRT
<213>Thunnus sp.
〈400〉I
Tyr Glu Asn Gly GlyI權利要求
1.一種金槍魚碎肉蛋白抗氧化肽，其特征在于該抗氧化肽的氨基酸序列為Tyr-Glu-Asn-Gly-Gly SEQ ID NO:1。
2.根據權利要求1所述的金槍魚碎肉蛋白抗氧化肽，其特征在于:所述的抗氧化肽的HR-ES1-MS 檢測的分子離子峰為539.2096 Da [M+H] +。
3.—種金槍魚碎肉蛋白抗氧化肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟:O以脫脂金槍魚碎肉作為原料，加入緩沖液調節PH到5.0 7.0，得混合液；2)將混合液溫度升至55V 65 °C攪拌預熱，按照脫脂魚肉質量的0.8 % 1.2 %加入木瓜蛋白酶，酶解溫度為55 V 65 °C，酶解時間I h 3 h，得酶解產物；3)將得到的酶解產物先經滅酶處理得酶解液，再將酶解液依次經脫鹽、超濾和層析，得到抗氧化肽。
4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于所述步驟I)中的脫脂金槍魚碎肉的制備過程為:將洗凈除雜的金槍魚碎肉按照固液比I g:1 mL 2 mL放入緩沖液中，用高速組織搗碎機將其處理成勻漿，然后按照體積比1:2 4放入乙醚中脫脂20 25 h，用冷凍離心機在:T5°C溫度下以4000 5000 rpm離心10 15 min除去乙醚，收集固形物即得到脫脂金槍魚碎肉。
5.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于所述步驟2)中的木瓜蛋白酶的酶活力彡1.5 X IO6 U/g。
6.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于所述步驟3)中的滅酶處理為:將酶解產物升溫至90 °C 95°C ，并于此溫度保持10 mirTl5min后，冷卻至15 °C 25 °C，然后離心，得酶解液。
7.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于所述步驟3)的脫鹽、超濾和層析的具體過程為:脫鹽:將得到的酶解液制成濃度為15 mg/ mL 20 mg/mL溶液，加入到大孔樹脂層析柱進行脫鹽，然后用質量濃度45飛5%乙醇進行解析，40 °C以下低壓旋蒸除去乙醇，濃縮液進行冷凍干燥，得脫鹽酶解物干粉；超濾:將脫鹽后的酶解物干粉溶于PH 5.5飛.5的磷酸鹽緩沖液配成8 12 mg/mL的溶液，于0.1 0.15 MPa的工作壓力和20 25 °C的工作溫度下采用超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于I kDa部分，得超濾酶解液；層析:將上述超濾酶解液用PH 5.5飛.5的磷酸鹽緩沖液配成8 12 mg/mL的溶液，經過陰離子交換樹脂分離，用水、0.09 0.11 mol/L、0.45 0.55 mol/L和0.90 1.10 mol/L NaCl溶液進行洗脫，根據280nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，DPPH自由基清除活性最高組分為離子交換層析酶解液；將所述離子交換層析酶解液用PH 5.5飛.5磷酸鹽緩沖液配成8 12 mg/mL的溶液，經過凝膠柱層析分離，用磷酸鹽緩沖液進行洗脫，根據280nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，DPPH自由基清除活性最高組分為凝膠層析酶解液，將上述凝膠層析酶解液用PH 6.0磷酸鹽緩沖液配成45飛5 μ g/mL的溶液，利用反相高效液相色譜RP-HPLC進行純化。
8.根據權利要求7所述的制備方法，其特征在于所述大孔樹脂為DlOl;所述陰離子交換樹脂為DEAE-52纖維素，所述凝膠為葡聚糖凝膠G-25 ;所述反相高效液相色譜條件為:進樣量19 21 μ g ;色譜柱為Zorbax C18 ;柱溫為25 V ;流動相:A含0.1%三氟乙酸的水，B含0.1%三氟乙酸的乙腈；梯度洗脫:0-55 min乙腈濃度從O至50%，每5 min增加5% ;洗脫速度1.0 ml/min ;紫外檢測波長280 nm。
9.根據權利要求3所述的制備方法,其特征在于所述金槍魚碎肉為鰹魚Ofatswro/HAspel ami s )碎肉。
10.一種金槍魚碎肉蛋白抗氧化肽的應用，其特征在于Tyr-Glu-Asn-Gly-Gly SEQID N0:1對DPPH自由基、羥基自由基、ABTS自由基和超氧陰離子自由基的清除的應用；Tyr-Glu-Asn-Gly-Gly SEQ ID NO:1 對脂質過氧化抑制的應用；Tyr-Glu-Asn-Gly-GlySEQ ID NO:1作為藥品、 保健食品和食品添加劑的應用。
全文摘要
本發明公開了一種金槍魚碎肉蛋白抗氧化肽及其制備方法和用途，該抗氧化肽的氨基酸序列為Tyr-Glu-Asn-Gly-Gly，制備時以脫脂金槍魚碎肉作為原料，加入磷酸鹽緩沖液，調節pH到5.0~7.0，得混合液；將混合液攪拌預熱，加入木瓜蛋白酶，得酶解產物；將酶解產物先滅酶再依次經脫鹽、超濾和層析，得到抗氧化肽。本發明制備工藝科學合理，酶解過程易監控，制得的抗氧化肽具有安全無毒副作用、抗氧化活性強和易于消化吸收等優點，可以作為藥品、保健食品和食品添加劑等應用。
文檔編號A61P39/06GK103073621SQ20121055806
公開日2013年5月1日 申請日期2012年12月20日 優先權日2012年12月20日
發明者王斌, 羅紅宇, 李忠瑞, 胡發遠 申請人:浙江海洋學院