用于犬呼吸道疾病綜合征的組合物的制作方法

用于犬呼吸道疾病綜合征的組合物的制作方法
【專利摘要】本發明提供一個包括犬流感病毒和犬呼吸道冠狀病毒的組合物。其還可以進一步包括支氣管炎博德特氏菌(Bordetella?bronchiseptica)，百日咳桿菌粘附素(pertactin)，犬副流感病毒(canine?parainfluenza?virus)和犬腺病毒血清型2型(canine?adenovirus?serotype2)。該組合物可以有效的治療或者預防包括犬傳染性呼吸道疾病綜合征在內的犬呼吸道疾病。
【專利說明】用于犬呼吸道疾病綜合征的組合物
【技術領域】
[0001]本發明涉及免疫學領域，特別是免疫原性和疫苗的組合物。其涉及用于防治包括犬傳染性呼吸道疾病綜合征(CIRDC)在內的犬呼吸道疾病的組合物。本發明還涉及在犬體內接種疫苗、治療、或者預防犬呼吸道疾病的方法。
【背景技術】
[0002]犬傳染性呼吸道疾病綜合征(CIRDC)是一種傳染性極強的疾病，常見于住在擁擠的條件下，如領養中心和登機或培訓犬舍的狗。許多狗僅僅表現出輕微的咳嗽，然后在很短的時間內就恢復了。但是在某些情況下，可能會發展成嚴重的支氣管肺炎。
[0003]CIRDC的發病機理被認為是多因素的，涉及一些病毒和細菌。已知的CIRDC病原體的傳染原包括犬呼吸道冠狀病毒(CRCoV) (Erles等，Virology, 310(2): 216-223，2003)、犬流感病毒(CIV) (Crawford 等，Science, 310 (5747): 482-485，2005)、犬副流感病毒(CPIV) (Binn 等，Exp.Biol.Med.，126:140-145，1967)、犬腺病毒 2 型(CAV-2) (Ditchfield等，Can.Vet.J., 3:238-247，1962)、犬支原體(Chalker 等，Microbiology, 150:3491-3497，2004)，和細菌支氣管炎博德特氏菌(Bemis 等，Lab.Anim.Sc1.，29:48-52，1977)。
[0004]CRCoV可以引發高度傳染性呼吸道疾病，其通過犬類和犬類的直接接觸、呼吸道分泌物的懸浮微粒、以及和污染的環境和人接觸而傳播。患病輕微的狗的癥狀包括咳嗽、打噴嚏、鼻涕。一些狗有亞臨床感染，并沒有任何臨床癥狀，但是他們可以傳播病毒從而使其他狗感染。一些感染了 CRCoV的狗會發展成為肺炎，特別是如果還同時感染了其他的呼吸道病原體。
[0005]有關CIV，從大約1956年開始，馬流感病毒被認為是馬中主要的呼吸道病原體。馬流感病毒可以引發嚴重的疾病癥 狀，并經常繼發細菌感染。兩種馬流感病毒的亞型已經別確定，命名為亞型-1 (原型為A/Equine/Prague/1/56 (H7N7))和亞型_2 (原型為A/Equine/Miami/1/63 (H3N8))。目前，主要的病毒亞型是亞型_2，H3N8菌株。H3N8馬流感病毒可以感染犬類，一些情況下致死率高達36%。一種解釋是馬流感病毒全部或部分種間轉移至犬類，會產生一種新的與急性呼吸道疾病有關的犬類特殊流感病毒(Crawford等，2005)。
[0006]CPIV引起的疾病通常在上呼吸道。單獨由CPIV引發的疾病是十分輕微的或者表現為亞臨床，如果并發感染其他呼吸道病原體則癥狀將會變得越發嚴重。
[0007]CAV-2導致呼吸系統疾病，嚴重的情況下，可以包括肺炎和支氣管肺炎。
[0008]據報道，支氣管炎博德特氏菌(B.Bixmchis印tica)是呼吸道疾病氣管支氣管炎或“犬舍咳”中的主要病原。它使狗易受其他呼吸劑的影響，并且經常和它們同時存在。犬舍咳通常發生在上呼吸道，特點是流鼻涕和咳嗽。至目前為止，一些疫苗可以用于治療由支氣管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)引發的氣管支氣管炎，包括Nobivac⑧、Bronch1-Shield ⑧ Bronchicine ? CAe> Vanguard ⑩ B、Univac2> Recombitek (g) KC2、NaramuneTM-2和Kennel-JecTM2。然而，大多數現有的商業疫苗需要繁瑣的鼻腔給藥以及加入佐劑，這可能會導致有害的副作用，如燒灼和刺激。Viera Scheibner等，Nexus Dec2000(Vol8，Nol)。亞單位疫苗，如那些涉及使用支氣管炎博德特氏菌的p68蛋白(百日咳桿菌粘附素)，已經被研究，但是至今沒有被包括在任何商業犬類疫苗中，可能是因為免疫原性不足，不良反應，和/或制劑的穩定性。
[0009]CIRDC的病理學表明其涉及肺損傷，在某些情況下，導致支氣管肺炎，但是其與犬舍咳(主要病原:支氣管炎博德特氏菌B.bronchiseptica)不同，犬舍咳主要涉及上呼吸道變化。犬舍咳是一種相比于CIRDC更加輕微的綜合病癥，并且不具有在CIRDC中指出的廣泛的病變。CIRDC也以增加的嚴重程度和死亡率為特征。
[0010]CIRDC很少致命，但是會延遲救援中心的狗被領養，打亂狗舍的訓練安排，導致相當大的治療費用和福利問題。疫苗可以用于治療一些與CIRDC有關的傳染原。但是，盡管使用這些疫苗，CIRDC仍然在世界范圍內盛行，其可能是因為缺乏相對于與CIRDC有關的所有的病原體的有效疫苗。
[0011]因此，仍然需要可以安全使用于犬類的免疫原型組合物，在提供相對于引發CIRDC的病原長期有效的免疫保護的同時，并沒有有害的副作用或者在和其他疫苗一起使用時并不干擾其他抗原。本發明將滿足這些和其他相關的需要。

【發明內容】

[0012]本發明主要涉及可以提供用于治療或者預防CIRDC的抗原的免疫原性組合物。在一個實施例中，免疫原性組合物包括犬流感病毒(CIV)和犬呼吸道冠狀病毒(CRCoV)。在另一個實施例中，該免疫原性組合物進一步包括支氣管炎博德特氏菌。在另一個實施例中，該免疫原性組合物進一步包括單獨的百日咳桿菌粘附素抗原。在另一實施例中，該免疫原性組合物包括P68百日咳桿菌粘附素抗原。在另一個實施例中，百日咳桿菌粘附素抗原是一種重組蛋白。在又一個實施例中，百日咳桿菌粘附素抗原在大約I μ g至大約30 μ g之間。在另一個實施例中，所述的百日咳桿菌粘附素抗原通過將百日咳桿菌粘附素抗原包涵體溶解在尿素中以及任選的通過色譜柱純化而制備得到。所述的百日咳桿菌粘附素抗原是可溶的，并且優選地基本沒有聚集體·。在另一個實施例中，支氣管炎博德特氏菌是疫苗或者細菌提取物。
[0013]在一個實施例中，免疫原性組合物包括CIV、CRCoV、支氣管炎博德特氏菌、以及選自犬副流感病毒(CPIV)和犬腺病毒2型(CAV-2)中的一種或兩種抗原。在另一個實施例中，所述的免疫原性組合物進一步包括P68百日咳桿菌粘附素抗原。在另一個實施例中，支氣管炎博德特氏菌是疫苗或者細菌提取物。
[0014]另一個實施例中提供的免疫原性組合物包括CIV、CRCoV、包含支氣管炎博德特氏菌的支氣管炎博德特氏菌組分，單獨的百日咳桿菌粘附素抗原，以及選自犬副流感病毒(CPIV)和犬腺病毒2型(CAV-2)中的一種或兩種抗原。在一個進一步的實施例中，該免疫原性組合物同時包括CPIV和CAV-2。
[0015]在另一實施例中，上述實施例中的任一種免疫原性組合物進一步包括單獨的Bsp22抗原。
[0016]在另一個實施例中，上述實施例中的任一種免疫原性組合物是無佐劑的。在另一個實施例中，上述實施例中的任一種免疫原性組合物包括佐劑。
[0017]在另一個實施例中，上述實施例中的任一種免疫原性組合物不含有非呼吸道抗原。
[0018]在又一個實施例中，上述實施例中的任一種免疫原性組合物誘導在犬體內對于犬呼吸道病原體的免疫應答。在另一個實施例中，所述的犬呼吸道病原體是CIV、CRCoV、CPIV、CAV-2、支氣管炎博德特氏菌和犬支原體(Mycoplasma cynos)中的至少一種。
[0019]本發明的另一個實施例中提供了將上述實施例中的任一種免疫原性組合物用于治療或者預防犬類對于犬呼吸道病原體的感染。在另一個實施例中，所述的犬呼吸道病原體是CIV、CRCoV、CPIV、CAV-2、支氣管炎博德特氏菌、和犬支原體中的至少一種。在另一個實施例中，所述的組合物在約6個月或更長的時間內預防所述的感染。在另一個實施例中，所述的組合物在約I年的時間內預防所述的感染。在另一個實施例中，本發明提供了將上述實施例中的任一種免疫原性組合物用于制造藥物的用途，該藥物用于治療或者預防在犬體內感染犬呼吸道病原體。 [0020]本發明的另一個實施例中提供了上述實施例中的任一種免疫原性組合物，其中所述的組合物在犬體內治療或者預防犬傳染性呼吸道疾病綜合征(CIRDC)。本發明的另外一個實施例中提供了一種在犬體內治療或者預防CIRDC的方法，包括給所述犬類用上述實施例中的任一種免疫原性組合物。在另一個實施例中，所述組合物可以在約6個月或更長的時間內預防CIRCD。在另一個實施例中，所述組合物可以在約I年的時間內預防CIRCD。另一個實施例提供了將上述實施例中的任一種免疫原性組合物用于制造藥物的用途，該藥物用于在犬體內治療或者預防CIRDC。
[0021]附圖簡要說明
[0022]圖1.抗CRCoV的血清中和抗體反應。
[0023]當狗被用鹽水、加入佐劑的氫氧化鋁(AlOH)或加入佐劑的Emulsigen?組分進行疫苗接種時，測量血清中和相對于犬呼吸道冠狀病毒(CRCoV)的抗體反應。
[0024]圖2.攻擊后自鼻中流出的病毒。狗被用鹽水、加入佐劑的氫氧化鋁(AlOH)或加入佐劑的Emulsigen ?組分進行疫苗接種，接著用CRCoV進行攻擊，測量從鼻道中流出的CRCoV。
[0025]圖3.在攻擊后第4日對于CRCoV組織病毒為陽性的動物百分比。用鹽水、加入佐劑的氫氧化鋁(AlOH)或加入佐劑的Emulsigen?組分進行疫苗接種，接著用CRCoV進行攻擊，評估呼吸道組織中對于CRCoV呈陽性的狗的數量。
【具體實施方式】
[0026]下面的定義用于本公開。其取代任何包含在本發明引用的每個單獨的參考文獻中相矛盾的定義。沒有定義的詞具有本領域技術人員通用的意思。進一步，除非本文中特別提及，單數的名詞包括復數的情況，復數的名詞包括單數的情況。
[0027]“大約”和“將近”，當與可測量的數值變量關聯使用時是指變量的指示值和所有變量值在指示值的實驗誤差內(如在平均值的95%置信區間內)或在指示值的10%(或大于10%)以內。如果“大約”用于指以周記的時間間隔，“大約3周”是17至25日，“大約2周至大約4周”是10-40天。
[0028]“佐劑”指的是可以作為免疫反應中非特異性刺激物的任何物質。參見下面關于佐劑的進一步描述。[0029]本發明中所用的術語“動物”，包括可以被犬呼吸道疾病綜合癥感染的任何動物，包括馴養的和野生的哺乳動物。
[0030]“抗體”，是指包括抗原結合位點的任何多肽，不考慮其來源、生產方法和其他特征。其指的是免疫球蛋白分子或者其中可以與抗原特異性結合從而對抗原產生免疫反應的片段。免疫球蛋白是具有“恒定”及“可變”區的“輕”及“重”多肽鏈組成的血清蛋白，且基于恒定區的組成而分為若干類(例如IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)。對于給定抗原“特異性”的抗體指的是抗體的可變區可以特異性地識別和結合特殊的抗原。該術語包括，但是不限于:多克隆抗體、單克隆抗體、單一特異性抗體、多特異性抗體(polyspecific antibody)、人源化抗體、四聚體抗體、多特異性抗體(multispecific antibody)、單鏈(single chain)抗體、特定域(domain-specific)抗體、單域抗體、域缺失(domain-deleted)抗體、融合蛋白、ScFc融合蛋白、單鏈(single-chain)抗體、嵌合抗體、合成抗體、重組抗體、雜合抗體、突變抗體以及⑶R移植抗體。抗體可以是來自天然來源或者重組來源的完整的免疫球蛋白，也可以是完整的免疫球蛋白的免疫反應性部分。“抗體”可以被轉換成與抗原結合的蛋白，其包括但不限于抗體片段，其中包括但是不限于{&1^妯’)2、？&13’片段{￥片段、單鏈Fv(ScFv)、Fd片段、dAb片段、雙抗體、CDR3多肽、受約束的FR3-CDR3-FR4多肽、納米抗體、二價的納米抗體、小型模塊化免疫制藥(SMIPs)、低分子抗體(minibody),以及上面所提及的片段、其化學或者遺傳操作的配對、和保留抗原結合功能的其他抗體片段。通常情況下，這樣的片段包括結合抗原的域。如本領域技術人員所知的，該分子可以被設計(如種系的(germlined))以減少其免疫原性，提高親和力，改變其特異性，或者用于其他目的。
[0031]“抗原”或者“免疫原”是指包括一個或多個抗原決定基的分子，在其暴露于受檢者后將誘發對于該抗原具有特異性的免疫反應。抗原決定基是抗原的特異性部位，其與T-細胞受體或者特異性抗體結合，且通常含有大約3個氨基酸殘基至大約20個氨基酸殘基。術語抗原是指亞單元抗原-從與抗原性質相關的整個有機體中抗原分離和離散-以及被殺死的、減毒的或者滅活 的細菌、病毒、真菌、寄生蟲或其他微生物。術語抗原還指抗體，如抗個體基因型抗體或其片段，可以模擬抗原或者抗原決定簇(抗原決定基)的合成肽模擬表位。術語抗原還指在體內表達抗原或者抗原決定簇的寡核苷酸或者多核苷酸，如在DNA免疫中的應用。
[0032]本文中所用的“抗原性”是指蛋白質或者多肽免疫特異性結合為了防御蛋白或者多肽而增加的抗體的能力。
[0033]術語“支氣管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica) ”或者“支氣管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica) ”是指,支氣管炎博德特氏菌的減毒活細胞、支氣管炎博德特氏菌的滅活全細胞提取物(疫苗)或者支氣管炎博德特氏菌的細胞細菌提取物。
[0034]“緩沖液”是指一種化學系統，其可以防止另一種化學物質的濃度變化。質子供體和受系統起緩沖作用，防止氫離子濃度(PH)明顯改變。一個緩沖液的例子是含有弱酸和它的鹽(共軛堿)或者弱堿和它的鹽(共軛酸)的混合物。
[0035]本文中所用的“犬類”包括通常被稱作的狗，但是還包括犬科家族的其他成員。
[0036]本文中所用的術語“細胞系”或“宿主細胞”是指病毒可以復制或者被供養的原核或者真核細胞。
[0037]本文中所用的術語“培養”，是指在沒有其他種類或者類型存在的情況下生長的細胞或微生物的群體。
[0038]“劑量”是指給予受檢者的疫苗或者免疫原性組合物。“第一劑量”或者“初給劑量(priming dose) ”是指在第O日所給予的組合物的劑量。“第二劑量”或者“第三劑量”或者“年劑量”是指該組合物在給予第一次劑量以后所給予的量，其可能為但是不要求與第一次劑量相同的疫苗或免疫原性組合物。
[0039]“抗原決定基”是指抗原上的特異性位置，其可以與T-細胞受體或特異性抗體結合，通常包括大約3個至大約20個氨基酸殘基。
[0040]本發明中所用的“賦形劑”是指非抗原的疫苗或免疫原性組合物的非活性載體組分。
[0041]“片段”是指蛋白質或者基因被截斷的部分。“功能性片段”和“生物活性片段”是指保留有全長蛋白質或者基因的生物性能的片段。
[0042]“同源性”或“百分比同源性”是指候選序列的核苷酸或氨基酸殘基的百分比，其與在對其序列和引入空隙后比較器序列的殘基相同或相似，如果必要，為了獲得最大的百分比序列同源性，也可以考慮作為序列同源性的一部分進行保守的取代。
[0043]“同系物”或者“物種同系物”，包括在具有相當含量多核苷酸序列同源性，并具有相同或相近的生物功能和/或性能的2個或更多不同的物種中發現的基因。代表物種同系物的優選的多核苷酸序列在相當嚴格的條件下發生雜交，如在實施例中所描述的，并且具有相同或者相似的生物活性和/或性能。另一方面，代表物種同系物的多核苷酸共享大于約60%的序列同源性，大于約70%的序列同源性，大于約80%的序列同源性，大于約90%的序列同源性，大于約95%的序列同源性，大于約96%的序列同源性，大于約97%的序列同源性，大于約98%的序列同源性，大于約99%的序列同源性。
[0044]“同一性”或“百 分比同一性”是指與在序列和引入的空隙排序后的比較器序列中的殘基相同的候選序列的核苷酸或氨基酸的百分比，如果必要，為了獲得最大百分比的序列同一性，不考慮任何作為序列同一性部分的保守的代替。
[0045]本發明中所用的“免疫反應”,在受試者中是指對于抗原的體液免疫反應、細胞免疫反應、或體液和細胞免疫反應的發展。“體液免疫反應”是指通過抗體介導的免疫反應。“細胞免疫反應”是指由T-淋巴細胞或其他白血球或兩者介導的免疫反應,且包括由活性T-細胞，白血球細胞，或者兩者所產生的細胞因子、趨勢因子即類似分子的產生。可使用此項技術中已知的標準免疫檢定及中和檢定確定免疫反應。
[0046]本發明中所用的“免疫原性”是指蛋白或者多肽由抗原特異性引發的產生免疫反應的能力。
[0047]“免疫原性組合物”是指制備含有免疫原，包括例如蛋白質，多肽，全細胞，滅活、亞基或者減毒的病毒、或者多糖、或他們的組合物，給藥刺激受體相對于免疫原性組合物中一種或多種發生體液和細胞免疫系統。“免疫”是指將免疫原性組合物給藥，從而刺激宿主中對于抗體的免疫或免疫原性反應的過程。優選的宿主是哺乳動物，如狗。優選地，免疫原性組合物是疫苗。
[0048]本文中所用的“免疫保護量”是指有效誘發受體免疫原性反應的抗原的量，該免疫反應能夠預防或者改善疾病的信號或者癥狀，包括不利健康影響或并發癥。可以誘發體液免疫或者細胞調節免疫或者兩者。動物對于組合物的免疫原性反應可通過測量抗體滴度、淋巴增殖檢定來間接評估或者通過監控野生型菌株攻擊之后的病癥和癥狀來直接評估。由組合物或者疫苗賦予的保護性免疫可通過測量，例如攻擊微生物脫落物的減少，受檢者的死亡率、發病率、溫度值、整體身體情況、及整體健康和表現的臨床病癥的減少。免疫反應包括，但是不限于，細胞和/或體液免疫的誘發。可以有效治療的組合物或者疫苗的量是變化的，其與所用的特定生物，或者進行治療或者免疫的動物的條件有關，可以由獸醫決定。
[0049]本文中所用的“鼻內”給藥，是指通過或經由鼻將諸如疫苗或其組合物的物質引入受檢者的身體，其包括主要經鼻粘膜運輸該物質。
[0050]本文中所用的“分離的”，是指從其自然存在的環境中取出，無論是單獨或者在異源宿主細胞中，或者染色體，或者載體(如質粒，噬菌體等)。“分離的細菌”、“分離的厭氧菌”、“分離的細菌菌株”、“分離的病毒”、“分離的病毒株”、和類似物，是指組合物，在其中只有細菌或者病毒，沒有其他微生物，如當從其自然存在的環境中分離后進行培養。“分離的”，當用于描述任何特別定義的物質，如多核苷酸或多肽，是指從最初的細胞環境中分離出來的物質，其中如多肽或者核酸等物質通常被發現。如本文中所用，僅通過示例的方式，用本發明中多核苷酸構建的重組細胞系利用了“分離的”核酸。可選地，如果特殊的蛋白質或者特異的免疫原性片段被聲稱或者使用作為疫苗或者其他組合物，其會被認為是分離的，因為它已經被識別，分離并且與其在自然中存在相比較在一定程度上純化。如果蛋白質或者特異性免疫原性片段在重組細菌或者真核細胞表達載體(其可以生成抗體)中生成，其被認為作為分離的蛋白或者核酸存在。例如，用多核苷酸構建的重組細胞系利用“分離的”核酸。
[0051]“藥劑”是指可以用于預防、治療或者改善醫療條件，或者用于預防某些生理情況或者突發病癥的試劑。
[0052]本文中所用的“單克隆抗體”，是指由單一系的雜交瘤細胞生產的抗體，都指向在一個特殊抗原上的抗原決定基。用于制備單克隆抗體的抗原能夠作為一個分離的病原體的蛋白質或者整個病原體被提供。“雜交瘤”是一個克隆細胞系，包括由骨髓瘤細胞和特異性抗體產生細胞融和形成的雜交·細胞。一般情況下，單克隆抗體是鼠源。但是，單克隆抗體也指對于相對于特殊的抗原決定基的抗體的克隆群體，該抗原由噬菌體展示技術或者等效于噬菌體展示或者非鼠源雜交細胞的方法生成。
[0053]本文中所用的“口服(oral)”或者“口服(peroral) ”施藥是指通過或經由口將諸如疫苗或者其他組合物的物質引入受檢者身體，并且包括吞咽或經由口腔黏膜(例如，舌下或者頰內吸收)輸運或者兩者。氣管內也是一種口服(oral)或者口服(peroral)施藥的方式。
[0054]本文中所用的“ 口鼻”施藥是指通過或經由鼻及口將諸如組合物或者疫苗的物質引入受檢者身體，如通過在鼻內置放一或多滴進行。口鼻施藥包括與口服及鼻內施藥相關的輸送過程。
[0055]本文所用的“非經腸施藥”是指通過或經由不包括消化道的途徑將諸如組合物或者疫苗的物質引入受檢者的身體。非經腸施藥包括皮下施藥、肌肉內施藥、動脈內施藥和靜脈內施藥。出于該公開的目的，非經腸施藥不包括主要包括口、鼻、氣管及肺中的黏膜組織輸送物質的施藥途徑。
[0056]本文中所用的術語“病原體”或者“病源微生物”是指微生物，例如，CPIV、CAV-2、CRCoV或者支氣管炎博德特氏菌，其能夠誘發或者引發疾病、生病、或者其宿主動物的非正常狀態。
[0057]本文中所用的“百日咳桿菌粘附素”是指支氣管炎博德特氏菌的外膜蛋白。百日咳桿菌粘附素優選的來自支氣管炎博德特氏菌，最優選的是“P68”，由基因，pmA編碼。百日咳桿菌粘附素可以從支氣管炎博德特氏菌的天然形式分離出來，或者其可以重組產生。序列和百日咳桿菌粘附素的例子由美國專利N0.7736658提供，其內容被引入本發明作為參考。百日咳桿菌粘附素的抗原包括蛋白的脂化形式。
[0058]“藥物可接受”是指在合理醫學判斷范疇內德物質，其適用于與受檢體組織接觸而無不適當的毒性、刺激、過敏性反應極其類似情況，其等同具有合理的利益與風險比例，且對于其所欲的用途有效。
[0059]本文中所用的“多克隆抗體”是指相對于特殊病原體或者抗原的抗體的混合群。一般來說，群體包含多種抗體組，每一組指向病原體或者抗原的特殊抗原決定基。為了制作多克隆抗體，整個病原體，或者分離的抗原，通過接種或者感染被引入宿主內，誘導宿主產生相對于病原體或者抗原的抗體。
[0060]本文中所用的術語“多核苷酸”是指包括共價結合在一條鏈上的核苷酸單體的有機聚合物分子。DNA(脫氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)是具有不同的生物功能的多核苷酸的例子。
[0061]本文中所用的術語“多肽”，是指在包括在一個鏈中鍵合的兩個或更多氨基酸的有機聚合分子。
[0062]本文中所用的“預防感染”是指預防或者阻止可以引發確定的疾病的細菌或者病毒的復制，阻止細菌或者病毒的傳輸，預防細菌或者病毒在宿主中建立起來，或者減輕由感染引發的疾病的癥狀。 如果減少了細菌或者病毒的負載，則治療被認為是有效的。
[0063]本文中所用的“保護(protection) ”，“保護(protecting) ”，“保護性免疫”及類似詞語，相對于疫苗或者他組合物，是指疫苗或者組合物可以預防或者減少由生物體(從中可以得到所用的疫苗或者組合物)所引發的疾病的癥狀。術語“保護(protection) ”，“保護(protecting) ”，及類似詞語，是指疫苗或者組合物可以被用于“治療”疾病，或者已經存在于受檢體的疾病的一種或多種癥狀。
[0064]本文中所用的“吸入”施藥，是指通過或者經由霧化(噴霧的)的物質吸入將諸如疫苗或者其他組合物的物質引入到受檢體的身體。在吸入施藥中，主要的運輸機理包括通過氣管、支氣管和肺的黏膜吸收噴霧化的物質，其不同于鼻內或者口服施藥。
[0065]術語“特異性結合(specificbinding) “特異性結合(specific binds) ” 以類似詞語，是指形成在生理或者測定條件下可計量的并且具有選擇性的復合物的兩個或者更多分子。抗體或者其他抑制劑被認為特異性結合到蛋白上，如果在適當選擇的條件下，這種結合基本上不可抑制，而同時的非特異性結合可以抑制。特異性結合具有高親合性的特點，對化合物或者蛋白質具有選擇性。非特異性結合通常親合力較低。例如，與IgG抗體結合，通常具有至少大約10_7M或更高、或至少10_8M或更高、或至少10_9M或更高、或至少KTkiM或更高、或至少IO-11M或更高、或至少KT12M或更高的親合力。例如，當結合抗原的結構域對一個特殊的不由許多抗原所攜帶的抗原決定基具有特異性時，該術語也適用，在該種情況下，攜帶抗原結合結構域的抗體通常不結合其他抗原。[0066]本文中所用的“特異性免疫原性片段”是指由對該序列具有特異性的抗體或者T細胞識別序列的一部分。
[0067]本文中所用的“受檢體”，是指具有免疫系統的任何動物，包括哺乳動物，例如狗。
[0068]本文中所用的“基本相同”，是指在一定程度上至少大約90%、至少大約95%，至少大約96%，至少大約97%，至少大約98%，或者至少大于99%序列同一性。
[0069]本文中所用的“亞單元疫苗”或者“亞單元組合物”，是指包括一種或多種抗原的疫苗或者組合物類型，但是并不必須在疫苗或者組合物中具有所有的抗原，其源自目標病原體的抗原或者與其同源，如病毒、細菌、寄生蟲或者真菌。在完整的病原體細胞中，或者治病的顆粒、或者該細胞或者顆粒的溶胞產物中基本不存在該組合物或者疫苗。亞單元疫苗或者亞單元組合物可以由來自病原體或者其類似物的至少部分純化、或者基本上純化的免疫原性多肽制備。在亞單元疫苗或者亞單元組合物中得到單個抗原或者多個抗原的方法包括標準純化技術、重組生產、或者化學合成。“亞單元疫苗”或者“亞單元組合物”是指包括病毒、細菌或者其他免疫原的定義的抗原成分的疫苗或者組合物。[0070]"TCID50"是指“組織培養感染劑量”，其定義為感染50%的制定接種細胞培養物時所需的病毒稀釋度。可使用各種方法測定TCID5tl,包括Spearman-Karber法,其用于整個說明書中。關于 Spearman-Karber 發的描述，參見 B.ff.Mahy&H.0.Kangro, Virology MethodsManual 25-46(1996)。
[0071]本文中所用的“治療劑”是指可以輔助治療病毒、細菌、寄生蟲或者真菌的感染、治療或者由此造成的條件的分子、化合物、病毒或者治療，優選減毒或死亡的病毒，或者亞單元或者化合物。
[0072]本文中所用的“治療有效量”是指可在接受抗原或者疫苗或者組合物的受檢體(如狗)中誘發免疫反應的抗原或者疫苗的量，該量足以改善或者預防包括諸如病毒、細菌、寄生蟲或者真菌的病原體感染所引發的不利健康影響或其他并發癥的疾病的病癥或者癥狀。可誘發體液免疫或者細胞介導免疫或者體液與細胞介導免疫兩者。動物對于抗原，疫苗或者組合物的免疫原性反應能夠經由測量抗體滴定，淋巴細胞增殖檢定來間接評估，或者通過監控野生型菌株攻毒之后的病癥即癥狀來直接評估。疫苗或者組合物所賦予的保護性免疫可通過測量，攻擊微生物脫落物的減少，和/或諸如受檢者的死亡率、發病率、溫度值、整體身體情況、健康和表現的臨床病癥的減少。疫苗或者組合物的治療有效量是變化的，與所用的特殊的免疫原或者受檢體的條件有關，其可以有本領域技術人員決定。
[0073]本文中所用的“治療(treat) ”或者“治療(treating) ”是指逆轉、減輕、抑制進程、或者預防該術語所應用的紊亂、病狀或者疾病，或者預防該紊亂、病狀或者疾病的一種或多種癥狀。
[0074]本文中所用的“治療法(treatment) ”是指以上所以所定義的“治療”的行為。
[0075]本文中所用的“疫苗”或者“疫苗組合物”，是指從病毒、或者細菌中選擇出來的免疫原性組合物，其或為該活性、衰減、或者死亡、或者亞單位的疫苗，或者其組合物。將疫苗施藥給受檢體導致免疫反應。疫苗可以通過已知的施藥路線被直接引入受檢體，包括非經腸、口入或者類似方式。該術語意味著可以預防或者減弱感染、或者預防或者減弱一個或多個感染癥狀的組合物。疫苗組合物相對于病原體的預防效果通常通過在受檢體中引發免疫反應完成。通常來講，取消或者減少感染的發病率，改善病癥或病狀，或者加速受感染的受檢體的微生物的消除，都對該疫苗組合物的預防效果具有指示作用。本發明中的疫苗組合物對于由犬呼吸道疾病綜合癥引發的感染提供預防效果。
[0076]本文中所用的“獸醫學可接受的”是指在合理的醫學判斷的范圍內，該物質適用于與獸醫的受檢體組織接觸，沒有不適當的毒性、刺激性、過敏性反應及類似情況，其等同具有合理的利益與風險比率，對于其所欲的用途有效。
[0077]本文中所用的“獸醫學可接受的載體”，是指不干擾活性成分的生物活性效力的載體介質，對于施藥的獸醫學受檢體是無毒的。
[0078]抗原、免疫原性組合物、疫苗
[0079]本公開提供了包括一種或多種病毒和細菌的免疫原性組合物和疫苗。本公開提供了包括一種或多種病毒和細菌，或適用于施藥給犬類治療CIRDC的亞單元的免疫原性組合物和疫苗。
[0080]這里描述的犬呼吸道冠狀病毒(CRCoV)可以被定性為一種患有傳染性呼吸道疾病的狗的呼吸道中出現的冠狀病毒。CRCoV系統發育上最接近牛冠狀病毒(BCoV)，人冠狀病毒(HCoV)菌株0C43和血凝性腦脊髓病毒(HEV);腸犬冠狀病毒(CCoV)僅是CRCoV的遠親。適用于本發明的CRCoV的代表性例子包括確定為CRCoV菌株4182 (Erles等，VirusRes.，124:78-87, 2007)的菌株。
[0081]本發明中包含的流感病毒抗原可是是任何確認的來自鳥類或者哺乳動物的流感病毒株，包括但是不限于，具有H3亞型血凝素和NS亞型神經氨酸酶，或者H3N8亞型的流感病毒，更通常被稱作H3N8病毒。流感可能是哺乳動物或者鳥類起源，包括但是不限于豬，馬或者犬類起源。犬流感抗體被用于一個實施例中。馬流感抗原被用于一個實施例中。具有H3亞型或NS亞型糖蛋白的菌株被用于一個實施例中。具有H3亞型和NS亞型的糖蛋白被用于一個實施例中。
[0082]本發明中包含的流感抗原從野生和家養的狗、馬、豬和家禽中分離得到。選擇用于樣品采集的動物應該展示急性和/或亞急性的臨床癥狀，其可以包括從輕度到嚴重的呼吸道癥狀和發燒。動物也可以表現出厭食和嗜睡的癥狀。使用本領域公知的病毒分離方法，其包括:接種哺乳動物或者禽類細胞培養，與從臨場樣品中的鼻或咽部粘液樣品(通過擦拭鼻道或者咽喉采集，或者通過采集如脾、肺、扁桃體、肝、肺洗滌液的組織采集)接種含胚卵。可以在細胞培養中觀察到病毒的細胞病變效應。可以測試尿囊液或者細胞裂解液凝聚人、雞、伙計或豚鼠的紅細胞的能力，作為流感病毒存在的推定證據。
[0083]適用于本發明的流感病毒株的一個代表性示例包括確認為A/Canine/lowa/9Al/B5/08/D12的菌株，其于2006年6月29日馬納薩斯大學大道(UniversityBoulevard) 10801的美國典型培養物保藏中心(ATCC)作為PAT-7694進行保藏，遵守國際承認的用于專利程序的微生物保存的布達佩斯條約。CIV抗原的代表性菌株為一種商業疫苗中的CIV病毒菌株，Vanguard? CIV (Pfizer，Inc)。本發明還包括包含確認為馬流感菌株A/Equine/2/Miami/l/63的疫苗。該菌株保藏于ATCC，保藏號為VR317，遵守國際承認的用于專利程序的微生物保存的布達佩斯條約。
[0084]用于本發明的流感病毒的其他示例為A/canine/lowa/13628/2005、A/Equine/Kentucky/1998> A/Equine/Kentucky/15/2002、A/Equine/Ohio/1/2003> A/Equine/Kentucky/1/1994、A/Equine/Massachusett s/213/2003 > A/Equine/Wisconsin/2003、A/Equine/NewYork/1999 和 A/Equine/Newmarket/A2/1993。其他優選的菌株和 / 或分離的 CIV包括美國專利 Nos.7959929 (特別是已經確認為 Jacksonville/2005, Miami/2005, FL/242/03和Florida/43/04的菌株和HA序列)，7384642，7572620和7468，187中報道的，其內容包括所有的序列，特別是HA序列，以及菌株，在此引入作為參考，如同其完全包括在本發明的記載中。除此之外，適用于本發明的CIV菌株包括Colorado CIV分離菌(如在Barrell等，J.Vet.1ntern.Med.，24 (6)，1524-1527 (2010)所描述的)，保藏號為 ADW41784。
[0085]本發明中包含的犬副流感病毒(CPIV)可被表征為是已知是與犬舍咳有關的致病因素的病毒中的一種。CPIV抗原的代表性菌株是商業疫苗中的一種減毒的CPI病毒株，VanguarcL? Plus 5(Pfizer)。CPIV抗原的另外一個代表性菌株是具有“NL-CP1-5，，(National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA)標記的減毒的 CPI 病毒株。
[0086]本發明中包含的犬類2型病毒(CAV-2)可被表征為已知是與犬舍咳有緣的致病因素的病毒的一種。CAV-2抗體中代表性的菌株是商業疫苗中一種減毒的CAV-2病毒株，Vanguard K Plus 5 (Pfizer) ? CAV-2抗原中代表性的菌株標記為“Manhattan”菌株(National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA)的減毒 CAV-2 菌株。
[0087]本發明中包含的犬支原體(Μ.cynos)如在 Chalker 等，Microbiology, 150:3491-3497，2004中描述的，且僅為通常伴有呼吸道疾病的支原體種類。對于M.Cynos的免疫原性組合物如在US2007/0098739中所描述的，通過引用并入本文。
[0088]本發明中包含的支氣管炎博德特氏菌組分可被表征為與犬舍咳有關的細菌致病因素。本發明中包含的免疫原性組合物和疫苗可能是活的減毒支氣管炎博德特氏菌、支氣管炎博德特氏菌疫 苗或細菌提取物中的一種或多種。此外，優選的組合物還包括一個分離的支氣管炎博德特氏菌亞單元抗原。
[0089]在實施例中支氣管炎博德特氏菌通過將全細胞超聲純化通過色譜柱(如同專利申請號FR2571618，申請日1984年10月12日的專利中提供的)制備。支氣管炎博德特氏菌的另外一個代表性示例是細菌提取物BronChiCineTMCAe (Pfizer)，其利用從支氣管炎博德特氏菌細胞中提取的抗原物質制備。支氣管炎博德特氏菌的另一個實施例是活的減毒支氣管炎博德特氏菌菌株B-C2，存在于Nobivac⑧，和/或活的從Intra-Trac⑧、Bronch1-Shield ?、Naramune?、Recombitek Univac 和 / 或 Kennel-Jec? 的支氣管炎/支氣管敗血癥(bronchiseptica)菌株。
[0090]此外，亞單元也是優選存在的(例如，補充的)，與支氣管炎博德特氏菌組分組合。亞單元的代表性示例為分離的百日咳桿菌粘附素抗原，優選地，支氣管炎博德特氏菌P68抗原，特別是重組的支氣管炎博德特氏菌p68抗原，其可以由p68-特異性單克隆抗體Bord2-7識別(如在US7736658中描述的，其通過引用并入本發明)，在一個優選的實施例中，具有US7736658中所述的氨基酸序列或者具有其同源性。
[0091]重組的支氣管炎博德特氏菌p68抗原優選在可溶的形式中制備，從而在加工過程中使類似天然的結構被保存或者恢復。因此，本發明的一個方面是提供重組P68，其基本沒有(小于大約80%，90%，95%，甚至99%)聚合體，。在另一個實施例中，重組p68用尿素溶解，優選大于0.1M、0.5M、1M、2M、3M或6M的尿素溶液。此后，p68抗原能夠被純化，如通過色譜柱。Surinder 等，J.Bioscience and Bioengineering, v.99 (4), pgs303-310 (2005)中描述了這樣一個溶解過程。
[0092]本發明中所用的百日咳桿菌粘附素抗原還包括脂化形式。脂化蛋白的生產的示例由 Erdile 等，Infection and Immunity, (1993) ν.61 (I)，ρ.81-90 提供，其通過引入并入本發明。其所公開的方法可以用于制備翻譯后修飾的百日咳桿菌粘附素蛋白，其包含一個附屬的脂質部分。
[0093]此外，另一個實施例中，免疫原性組合物包括支氣管炎博德特氏菌和分離的Bsp22抗原。在另一個實施例中，免疫原性組合物包括支氣管炎博德特氏菌，一個分離的百日咳桿菌粘附素抗原，和分離的Bsp22抗原。Bsp22抗原能夠如Medhekar等，MolecularMicrobiology (2009) 71(2), 492-504中描述的方法制備。優選地，分離的Bsp22抗原與支氣管炎博德特氏菌提取物和分離的百日咳桿菌粘附素，特別是重組的P68，協作(例如，附加地)存在。
[0094]“Bsp22”還包括抗原的脂化形式。生產脂化蛋白的示例在Erdile等，Infectionand Immunity, (1993) v.61 (I)，p.81-90中提供,通過引入并入本發明。該公開的方法能夠用于制備翻譯后修飾的Bsp22蛋白，其包含一個附屬的脂質部分。
[0095]本發明中包含的病毒是可以在細胞、細胞系、宿主細胞中繁殖。所述的細胞、細胞系、宿主細胞可能是例如，但是不限于，哺乳動物細胞和非哺乳動物細胞，包括昆蟲和植物細胞。
[0096]本發明包含的病毒可以繁殖的細胞、細胞系和宿主細胞是已知的，并且是本領域技術人員可以獲得的。
[0097]在另一個實施例中，本發明中所描述的免疫原性組合物不包括非呼吸道的抗原。因此，本發明的一個實施例中提供了一種組合物，條件是其不包括非呼吸道抗原。非呼吸道抗原不能引起受檢體的呼吸道疾病。非呼吸道抗原的非限制性示例包括狂犬病毒、犬細小病毒、腸犬類冠狀病毒、鉤端螺旋體病種(Leptospira species)和萊姆病螺旋體(Borreliaburgdorferi)。
`[0098]本發明包含的細菌能夠使用本領域技術人員已知的各種培養基進行培養和繁殖，包括肉湯(液體)和瓊脂(固體；半固體)培養基。一些細菌也可以在哺乳動物細胞或者非哺乳動物細胞中培養和繁殖。
[0099]本發明中包含的病毒和細菌能夠是在用于免疫原性組合物或者疫苗之前減毒或者滅活的。減毒和滅活的方法是本領域技術人員公知的。減毒的方法包括，但是不限于，在合適的細胞系(病毒或者細菌)上在細胞培養中連續傳代，在肉湯培養中連續傳代(細菌)，紫外線輻射(病毒和一些細菌)，化學突變(病毒和細菌)。用于病毒或者細菌的滅活的方法包括，但是不限于，用福爾馬林、β_丙內酯(BPL)或者二乙烯亞胺(BEI)治療，或者其他本領域技術人員已知的方法。
[0100]福爾馬林滅活的能夠通過將含有微生物的懸浮液與37%的甲醛混合至甲醛的最終濃度為0.5%實現。微生物-甲醛混合物室溫下通過不斷攪拌大約24小時混合。滅活的微生物混合物通過測試在合適的細胞系或者肉湯培養基中的生長檢測剩余活的微生物。
[0101]對于某些抗原，由BEI滅活通過將含有本發明中微生物的懸浮液與0.1M BEI (在
0.175Ν NaOH中2-溴-乙胺)混合至BEI的最終濃度為ImM實現。對于其他抗原，BEI的最終濃度為2mM。本領域技術人員指導使用的適當濃度。病毒-BEI的混合溶液通過在室溫下連續攪拌大約48h進行混合，然后加入1.0M硫代硫酸鈉至最終濃度為0.1mM。將混合液繼續攪拌2h。含有滅活的微生物的混合物通過檢測在適當的細胞系或肉湯培養基中的生長檢測剩余的獲得病毒。
[0102]本發明包含的免疫原性組合物和疫苗能夠包括一種或多種獸醫學上可接受的載體。如本文中所用，“獸醫學上可接受的載體”包括任何和所有的溶劑、分散介質、涂料、佐齊?、穩定劑、稀釋劑、防腐劑、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑、吸附延遲劑等。稀釋劑包括水、鹽水、葡萄糖、乙醇、甘油等。等滲劑包括氯化鈉、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇、和乳糖，和其他本領域技術人員已知的。穩定劑包括白蛋白、和其他本領域技術人員已知的。防腐劑包括硫柳汞，和其他本領域技術人員已知的。
[0103]佐劑是可以代謝的，涉及包含這些可以由目標物種，如植物油基佐劑，代謝的組分的佐劑。代謝的佐劑能夠是可代謝的油。可代謝的油是通常發生在植物和動物中的脂肪和油脂，通常包含大量的三酰基甘油的混合物，也成為甘油三酯或中性脂肪。這些非極性的，不溶于水的物質是脂肪酸和甘油三酯。根據其三個脂肪酸殘基或者側鏈的識別和位置，三酰基甘油是不同的。
[0104]佐劑也能夠是不可代謝的，涉及這些包含不能被將該乳液施藥給的動物受檢體的身體代謝的組分的佐劑。適用于本發明的組合物的不可代謝的油包括烷烴、烯烴、炔烴和其相應的酸和醇、 醚和他們的酯，以及它們的混合物。優選地，個別的油的化合物是輕質烴化合物，例如，這些具有6-30個碳原子的組分。油能夠從石油產品中合成制備或者純化。優選的用于這里描述的組合物的不可代謝的油包括例如礦物油、石蠟油、環烷烴。術語“礦物油”是指不可代謝的佐劑，其是通過蒸餾技術從凡士林中得到的液態烴的混合物。該術語與“液化石蠟”、“液體石蠟”和“白礦油”是同義的的。該術語還旨在包括“輕質礦物油”，例如，與從蒸餾凡士林得到的類似的油，但是其具有相對于白礦油稍低的比重。礦物油可以通過各種商業來源獲得，例如，J.Τ.Baker (Phillipsburg, PA), USB Corporation (Cleveland, OH)。輕質礦物油從DRAKEOL ?品牌商業可得的。
[0105]佐劑包括，但是不限于，Emulsigen ?佐劑系統(MVP實驗室；Ralston, NE)，RIBI佐劑系統(Ribi Inc.;Hamilton, MT),明礬、氫氧化鋁凝膠、水包油型乳劑、油包水型乳劑、例如、弗式完全和不完全佐劑、Block 共聚物(CytRx; Atlanta, GA)、AF-M (Chiron; EmeryviIIe，CA), AMPHIGEN? 佐劑、皂角苷、奎爾 A、QS-21 (Cambridge Biotech Inc.; Cambridge, MA), GP1-0100 (Galeu Pharmaceuticals, Inc.; Birmingham, AL)或者其他阜角苷組分、單憐酸酯A、AVridine脂胺佐劑、來自大腸桿菌的不耐熱腸毒素(重組或者其他)、霍亂毒素、胞壁酰二肽、角鯊烯/據丙二醇與環氧乙烷的加聚物的嵌段共聚物/表面活性劑(SP-油)，硫化β環糊精(sulpholipobeta-cyclodextrin) (SL-Q))、含有免疫調控劑的脂體(如CpG或聚1:C)、胞壁酰二肽(MDP)、ISC0MATRIX(Quil A/磷酸酰膽堿)、CpG/DEAE-葡萄糖/礦物油(TXO)、CpG、三萜類化合物(例如、奎爾A或者其他純化的或者部分純化的皂角苷制備)、甾酮(如膽固醇)、免疫調節劑(例如、二甲基二(十八烷基)溴化銨-DDA)、聚合物(如、聚丙烯酸、如Bay R1005 (R))和Th2興奮劑(例如，糖脂，如Bay RlOOi (R))，以及它們的組合物，包括其他本領域技術人員已知的佐劑。
[0106]可以使用的各種組合物的非限制性實施例包括三萜類加上留酮(例如，奎爾A/膽固醇，也稱作QAC)，三萜類化合物加上留酮、免疫調節劑和聚合物(例如，Quil A/cholesterol/DDA/CARBOPOL,?，也稱作QCDC)，三萜類混合物加上留酮、免疫調節劑、聚合物和 Th2 興奮劑(例如，Quil A/cholesterol/DDA/CARBOPOL K 和 Bay R1005 ?,也稱作QCDCR)。
[0107]本發明上下文中用的佐劑和添加劑的用量和濃度能夠很容易地由本領域技術人員決定。在一個實施例中，本發明設計了包含從大約20 μ g至大約2000 μ g佐劑的免疫原性組合物和疫苗。在另一個實施例中，包含了從大約100 μ g至大約2500 μ g，或從大約250 μ g至大約1000 μ g，或從大約350 μ g至大約750 μ g的佐劑。在另外一個實施例中，包含了用量為大約500μ g/2ml劑量免疫原性組合物或疫苗的佐劑。
[0108]免疫原性組合物和疫苗還包括抗生素。該抗生素包括，但是不限于，選自氨基糖苷類、碳青霉烯類、頭孢菌素類、糖肽、大環內酯類、青霉素類、多肽喹諾酮類、磺胺類和四環素類抗生素。在一個實施例中，本發明設計了包含從大約I μ g/ml至大約60 μ g/ml抗生素的免疫原性組合物和疫苗。在另一個實施例中，免疫原性組合物和疫苗包括從大約5 μ g/ml至大約55 μ g/ml、或從大約10 μ g/ml至大約50 μ g/ml、或從大約15 μ g/ml至大約45 μ g/ml、或從大約20 μ g/ml至大約40 μ g/ml、或從大約25 μ g/ml至大約35 μ g/ml的抗生素。在又一個實施例中，免疫原性組合物和疫苗中包括少于大約30 μ g/ml的抗生素。
[0109]本發明中包含的免疫原性組合物和疫苗能夠包括一種或多種為病毒、或者細菌、或者病毒或細菌的蛋白質編碼的多核苷酸分子。DNA或者RNA分子能夠用于免疫原性組合物或者疫苗。DNA或者RNA分子可以在不存在其他藥物的情況下施藥，或者其可以與促進細胞攝取(例如，脂質體或者陽離子脂質體)的試劑一起被施藥。免疫原性組合物或疫苗中總的多核苷酸在大約0.1 μ g/ml至大約5.0mg/ml之間。在另一個實施例中，免疫原性組合物或疫苗中總的多核苷酸能夠在大約I μ g/ml至大約4.0mg/ml之間、或在大約10 μ g/ml至大約3.0mg/ml之間、或在大約100 μ g/ml至大約2.0mg/ml之間。利用核酸(DNA或者RNA)的疫苗和疫苗接種程序在現有技術中已經記載，例如，U.S.Pat.N0.5703055, U.S.Pat.N0.5580859，和U.S.Pat.N0.5589466，其全`都通過引用并入本發明。
[0110]除了上述的病毒或者細菌，本發明中包含的免疫原性組合物和疫苗包括其他添加的抗原。抗原能夠是以制備的微生物的全部或部分滅活的形式、或者以通過基因工程技術或者化學合成獲得的抗原分子的形式。其他適用于本發明的抗原包括，但是不限于，來自于如犬瘟熱病毒、犬皰疹病毒、犬流感病毒、狂犬病毒的致病性病毒，如支氣管炎博德特氏菌、布拉迪斯拉發鉤端螺旋體、犬鉤端螺旋體、流感傷寒型鉤端螺旋體、黃疸出血螺旋體、波摩那鉤端螺旋體、牛哈德焦鉤端螺旋體、葉啉單胞菌屬、擬桿菌屬、疏螺旋體屬、鏈球菌屬的病原性病毒，包括馬鏈球菌獸瘟亞種、埃里克體屬、支原體屬，包括宜諾斯支原體和犬小孢子菌。抗原還來自于致病性真菌，如假絲酵母，原生動物，如隱孢子蟲、犬新孢子蟲、剛地弓心蟲、艾美球蟲屬、八倍蟲屬、賈第蟲屬、利什曼原蟲屬，或寄生蟲，如絳蟲、黃蠅、棘球絳蟲和并殖吸蟲屬。
[0111]形式，劑暈和施藥途徑
[0112]本發明中包含的免疫原性組合物和疫苗能施藥給動物，從而誘發對CIRDC有效的免疫反應。因此，本發明提供了通過施藥給動物治療有效量的這里所描述的免疫原性組合物或疫苗從而刺激有效的免疫反應的方法。
[0113]這里描述的免疫原性組合物和疫苗能夠施藥給動物，從而使動物受檢體接種對于CIRDC的疫苗。免疫原性組合物和疫苗能夠施藥給動物從而預防或者治療動物的CIRDC。因此，這里描述的是給動物接種對于CIRCD的疫苗、和預防或者治療CIRCD的方法，包括施藥給動物治療有效量的這里描述的免疫原性組合物或者疫苗。
[0114]本發明包含的免疫原性組合物和疫苗能夠根據施藥途徑的需要以各種形式制備。例如，免疫原性組合物好疫苗能夠以適用于注射用的無菌水溶液或分散體的的形式制備，或者用冷凍干燥技術以凍干形式制備。凍干的免疫原性組合物和疫苗通常保持在大約4°C，能夠在一個穩定的溶液，如鹽水或HEPES中，存在或者不存在佐劑，進行重組。免疫原性組合物和疫苗還能夠以懸浮液或者乳液的形式制備。
[0115]本發明包含的免疫原性組合物和疫苗包括治療有效量的一種或多種上面描述的微生物。純化的病毒和/或微生物能夠直接用于免疫原性組合物或者疫苗，或者能夠是進一步減毒或者滅活的。通常，免疫原性組合物或疫苗包含在大約I X IO2至大約I X IO12之間的病毒或者細菌微粒，或在大約I X IO3至大約I X IO11之間的微粒，或在大約I X IO4至大約I X 101°之間的微粒，或在大約I X IO5至大約I X IO9之間的微粒，或在大約IXlO6至大約IX IO8之間的微粒。在可以有效的提供保護效力的免疫原性組合物或者疫苗中微生物的準確含量可以由本領域技術人員決定。
[0116]百日咳桿菌粘附素抗原在大約I μ g至大約30 μ g之間。更具體的，所述的百日咳桿菌粘附素在大約5 μ g至大約20 μ g之間,更具體,在大約7 μ g至大約15 μ g之間，再更具體，為大約51^、101^、151^或者20 μ g。
[0117]免疫原性組合物和疫苗通常含有獸醫學上可接受的載體，為在大約0.5ml至大約5ml之間的體積。在另一個實施例中，載體的體積在大約Iml至大約4ml之間的，或者在大約2ml至大約3ml之間。在另一個實施例中，載體的體積為大約1ml，或者為大約2ml，或者為大約5ml。適用于免疫原性組合物和疫苗的獸醫學可接受的載體能夠是上面描述的任意一種。
[0118]本領域技術人員能 夠很容易的確定在施藥前病毒或者細菌是否需要減毒或者滅活。在本發明的另一個實施例中，病毒或者細菌可以不經過附加的減毒直接施藥給動物。治療有效量的微生物量是變化的，取決于所用的特殊的微生物、動物的條件和/或感染的程度，可以由本領域技術人員確定。
[0119]根據本發明的方法，可以單劑量給動物施藥，或者，選擇地，2次或多次疫苗接種在大約2至大約10周的間隔內發生。可以要求刺激方案，給藥方案能夠被調整從而提供最佳的免疫。本領域技術人員能夠容易地確定最佳的給藥方案。
[0120]免疫原性組合物和疫苗能夠直接給藥進入血液、肌肉、內部器官中，或者在皮下。非經腸施藥的適合方法包括靜脈內、動脈內、肌肉內、和皮下給藥。用于非經腸施藥的合適的裝置包括針(包括微針)型注射器和無針注射器。
[0121]不經腸的制劑通常是含有賦形劑，如鹽、碳水化合物、蛋白質和緩沖溶液(優選pH從大約3至大約9，或從大約4至大約8，或從大約5至大約7.5，或從大約6至大約7.5，或從大約7至大約7.5)的水溶液，但是，在一些應用中，其能夠更合適的表現為無菌非水溶液或者干燥的形式，其用于與合適的賦形劑，如無菌、無熱源的水或鹽水，配合。
[0122]不經腸的制劑的制備在無菌條件下，例如，通過冷凍干燥，能夠容易的用本領域技術人員已經的標準制藥技術完成。[0123]用于不經腸溶液制備的物質的溶解性能夠通過使用本領域技術人員一直的合適的制劑技術提高，例如摻入溶解性增強劑，包括緩沖液、鹽、表面活性劑、脂質體、環糊精等
坐寸ο
[0124]用于非經腸施藥的組合物能夠配制成直接或者改性釋放。改性釋放制劑包括延遲、持續、脈沖、控制、針對性、和編程釋放。因此，免疫原性組合物和疫苗能夠配制成固體、半固體、或者觸變性液體，用于作為注入站，提供改性釋放該免疫原性組合物和疫苗。
[0125]免疫原性組合物或疫苗施藥的其他方法包括通過微針或者無針(例如，Powderject?, Bioject? 等)注射釋放。 [0126]在使用皮下或者肌肉內注射的情況，優選等滲制劑。一般來說，用于等滲性的添加劑能夠包括氯化鈉、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。在特定的情況下，等滲溶液，如磷酸鹽緩沖鹽水，被使用。制劑能夠進一步包括穩定劑，如明膠和白蛋白。在一些實施例中，血管收縮劑被加入配方中。根據本發明的藥物制劑一般在無菌和無熱原的條件下提供。但是，本領域技術人員已知的用于藥物可接受的載體的制劑是由美國農業部頒布的法規批準的藥物載體，或者由外國等效的政府機構，如加拿大、墨西哥、或者任何一個歐洲國家，用于犬類疫苗、多肽(抗原)亞單元免疫原性組合物和疫苗、重組病毒載體疫苗、和DNA疫苗。因此，用于商業生產免疫原性組合物或疫苗的藥物可接受的載體是已經由或者即將由美國或者外國相應的政府機構批準的載體。免疫原性組合物和疫苗能夠進一步用藥物可接受的佐劑混合。在某些免疫原性組合物和疫苗的制劑中，免疫原性組合物或疫苗和其他犬類免疫原性組合物或者疫苗結合生成多價的產物，其可以保護犬類免受由其他犬類病原體引發的多種疾病。
[0127]這里描述的免疫原性組合物能夠預防犬呼吸道病原體感染或者能夠在大約3個月或更長的時期內預防犬類感染CIRCD。組合物能夠預防所述的犬呼吸道病原體的感染，或者預防在大約6個月或更長的時期內預防犬類感染CIRCD。組合物能夠預防所述的犬呼吸道病原體的感染，或者預防在大約I年或更長的時期內預防犬類感染CIRCD。
[0128]檢測和診斷的方法
[0129]誘發動物免疫反應的程度和性質，能夠使用各種技術評估。例如，通過從被接種的動物中采集血清，然后檢測針對免疫原的抗體存在或者不存在。檢測淋巴組織中響應T-淋巴細胞(CTLs)，其表示誘發了細胞免疫反應，能夠通過檢測如T細胞增殖完成。相關的技術在本領域中已經報道。
[0130]試劑盒
[0131]因為需要將免疫原性組合物或者疫苗與附加的組合物或者化合物結合施藥-如，出于治療特殊疾病或者病癥的目的-以下包括在在本發明的范圍內，免疫原性組合物或者疫苗能夠便利的包含在或者合并在，適用于將組合物給藥或者同時給藥的試劑盒的形式。
[0132]因此，本發明包含的試劑盒能夠包括一種或多種獨立的藥物組合物，其中至少一種是根據本發明的免疫原性組合物或者疫苗，和用于分別保持所述組合物的工具，如容器、分瓶，或者分割的鋁箔包。該試劑盒的一個實例為注射器和針頭，及類似物。本發明的試劑盒特別適用于給予不同劑型，例如，口服或者非經腸，適用于按照不同劑量間隔給予單獨的組合物，或者用于滴定彼此獨立的成分。為了協助使用本發明中包含的組合物，試劑盒通常包括服藥說明。[0133]本發明包含的另外一個試劑盒能夠包括一種或多種用于檢測受感染動物的試劑。試劑盒能夠包括用于分析樣品中全部微生物、多肽、抗原決定基或者多核苷酸序列存在的試劑。病毒、細菌、多肽、或者多核苷酸序列的出現能使用抗體、PCR、雜交、和其他本領域中已知的檢測方法確定。
[0134]本發明包含的另外一個試劑盒能夠提供用于檢測對于特殊抗原決定基的抗體的試劑。該試劑用于分析樣品中抗體的存在，其為本領域技術人員熟知并可利用的。抗體的存在能夠用本領域技術人員已知的標準檢測方法確定。
[0135]在某些實施例中，試劑盒能夠包括一組打印的說明書、或者標示該試劑盒用于檢測受感染動物的標簽。
[0136]技述
[0137]抗體能夠是單克隆抗體、多克隆抗體、或者重組體。能夠制備對于免疫原或其一部分的抗體。例如，基于免疫原氨基酸序列合成的多肽，或者通過克隆技術制備的重組體，或者天然基因產物和/或其部分，能夠被分離并且用作免疫原。免疫原能夠被用于通過本領域技術人員熟知的標準抗體生產技術生產抗體。抗體片段也能通過本領域技術人員熟知的方法從抗體中制備出來，包括F(ab' )2和Fv片段。
[0138]在抗體的生產中，篩選所需的抗體能夠能過通過本領域中已知的免疫學的標準方法完成。一般情況下，ELISAs和Western印記是免疫檢測的優選類型。兩種檢測方法都是本領域技術人員熟知的。多克隆抗體和單克隆抗體都能過用于檢測。抗體能夠與固體支撐物結合、與可檢測的部分共軛、或者按照本領域熟知的同時結合和共軛。將抗體與固體支撐物結合也是本領域中熟知的。設計用于本發明中的可檢測部分能夠包括，但是不限于，熒光的，金屬的，酶的和放射性的標記物，如生物素，金，鐵蛋白，堿性磷酸酶，β -半乳糖苷酶，過氧化物酶，脲酶，熒光素，若丹明，氚，14C,和碘化。
[0139]本發明通過以下實施例進一步說明，但是不僅限于該實施例。
[0140]實施例
[0141]實施例1.評估含有CRCoV的疫苗
[0142]本公開中使用了 60只8-9周齡的健康狀況大致良好的小獵犬。所有動物抵達后接受體檢，并且在第2研究日或者第I日再次體檢。動物每日被觀察一次其大體的健康情況，從到達第8研究日至第39研究日。從第I研究日開始至接種前采集鼓膜溫度。在每次疫苗接種前的第O研究日和第21日用SST管采集用于血清學的血樣(大約5mL)。
[0143]CRCoV疫苗菌株來自菌株CRCoV.669，其根據國際承認用于專利程序的微生物保存布達佩斯條約保存在ATCC，保存號為PTA-11444。CIV疫苗菌株來自用于在Vanguard ?疫苗系(Pfizer)制備疫苗的病毒種子。抗原在病毒的最高通道(Master See Virus+5)制備。疫苗組合物含有包括Quil A(20 μ g)、膽固醇(20 μ g)、二甲基二(十八烷基)溴化銨(DDA ;10 μ g)和Carbopol.⑩(聚丙烯酸，0.05%體積/體積)的佐劑。CRCoV抗原按目標每劑量1.3相對抗原單元(RAU)配制。實驗疫苗進行滅菌。
[0144]異源CRCoV分離體(“Max”菌株；通道I)用于作為攻擊材料。病毒儲存材料在HRT18G細胞上被繁殖和滴定，被確定具有107_ 1TCID5cZmL的滴度。攻擊材料經測試并確認是令人滿意的無菌，沒有支原體或者犬類/貓的體外試劑。
[0145]在第21日一只動物被進行接種；其余動物在第22研究日進行接種。動物根據如表1所示的實驗設計皮下接種適當的疫苗或者安慰劑。第一次接種被施藥在右肩區域(第O研究日)，第二次接種施藥在左肩區域(第22研究日)。
[0146]表1.實驗設計
[0147]
【權利要求】
1.一種免疫原性組合物，其包括犬流感病毒(CIV)和犬呼吸道冠狀病毒(CRCoV)。
2.如權利要求1所述的免疫原性組合物,其還包括支氣管炎博德特氏菌。
3.如權利要求2所述的免疫原性組合物，其還包括p68百日咳桿菌粘附素抗原。
4.如權利要求2所述的免疫原性組合物，所述的支氣管炎博德特氏菌是一種細菌或細菌提取物。
5.如權利要求2所述的免疫原性組合物，還包括選自犬副流感病毒(CPIV)和犬腺病毒2型(CAV-2)中的一種或兩種抗原。
6.如權利要求5所述的免疫原性組合物，所述的一種或兩種抗原是CPIV和CAV-2。
7.如權利要求2至6所述的免疫原性組合物，還包括分離的Bsp22抗原。
8.如上述權利要求中任一項所述的免疫原性組合物，所述的組合物是沒有佐劑的。
9.如權利要求1至7中任一項所述的免疫原性組合物，還包括佐劑。
10.如上述權利要求中任一項所述的免疫原性組合物，所述組合物不含有非呼吸道抗原。
11.如上述權利要求中任一所述的免疫原性組合物，所述組合物誘發犬類對于犬呼吸道病原體的免疫反應。
12.如權利要求11所述的免疫原性組合物，所述犬呼吸道病原體為CIV、CRCoV、CPIV、CAV-2、支氣管炎博德特氏菌和·犬支原體(Mcynos)中的至少一種。
13.權利要求1至10中任一項所述的免疫原性組合物的用途，其用于治療或者預防犬類感染犬呼吸道病原體。
14.如權利要求13所述的用途，所述的犬呼吸道病原體為CIV、CRCoV、CPIV、CAV-2、支氣管炎博德特氏菌和犬支原體(M.cynos)中的至少一種。
15.如權利要求13或14所述的用途，所述組合物在大約6個月或更長的時間內預防所述感染。
16.如權利要求13或14所述的用途，所述組合物在大約I年的時間內預防所述感染。
17.權利要求1至10中任一項所述的免疫原性組合物在制造用于治療或者預防犬類感染犬呼吸道病原體的藥物中的用途。
18.如權利要求1至10中任一項所述的免疫原性組合物，所述組合物在犬類中治療或者預防犬傳染性呼吸道疾病綜合征(CIRDC)。
19.在犬類中治療或者預防CIRDC的方法，包括將權利要求1至10中任一項所述的免疫原性組合物施藥給所述犬類。
20.如權利要求19所述的方法，所述組合物在大約6個月或更長的時間內預防CIRDC。
21.如權利要求19所述的方法，所述組合物在大約I年的時間內預防CIRDC。
22.權利要求1至10中任一項所述的免疫原性組合物在制造用于在犬類中治療或者預防CIRDC的藥物中的用途。
【文檔編號】A61K39/10GK103596588SQ201280014795
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年2月3日 優先權日:2011年2月4日
【發明者】O.Y.阿布德爾馬吉德, J.M.布里克, S.L.希爾茲 申請人:佐蒂斯有限責任公司