一種通過培養葛根細胞制備黃酮的方法

專利名稱：一種通過培養葛根細胞制備黃酮的方法
技術領域：
本發明涉及細胞工程領域，具體的說是涉及一種通過培養葛根細胞制備黃酮的方法。
背景技術：
黃酮是植物經光合作用產生的一大類化合物，其結構母核是以C6-C3-C6為骨架的
2-苯基色原酮。它的存在形式有兩種，一種是游離的苷元，另一種是與糖等結合的苷。黃酮類化合物在植物界分布很廣泛，如銀杏葉、山碴、沙棘、薔薇果、拘祀、杜仲、茶葉、葛根等。到目前為止，已發現有500多種植物中有黃酮類和異黃酮類物質，它們包括黃烷酮、異黃烷酮、黃酮醇、黃烷酮醇、雙黃酮及其衍生物。黃酮類物質主要作用有:抗腫瘤，延緩衰老、增強心血管功能、治療慢性前列腺炎、增強免疫力、調解內分泌系統、護肝、抗炎、抗過敏、抑菌、抗病毒等。葛根為豆科植物野葛或甘葛藤的干燥根，甘葛藤又習稱為粉葛，葛根是最常用的稱呼。從成分分析結果看，葛根的葛根素及總黃酮含量顯著高于本屬其它植物，活性物質主要為大豆素、大豆甙、葛根素、葛根素-7-木糖甙等，是提取黃酮的較優選擇。目前提取黃酮的方法有很多，如熱水提取法、堿液提取法、丙酮提取法、乙醇浸提法、微波萃取法、超聲波法等，但是這些方法的共性是將含黃酮植物粉碎處理后直接進行提取，黃酮收率因工藝和原材料的差別而不穩定，而且提取不夠完全，容易造成黃酮成分的損失，整體收率都不高。如文獻《葛根總黃酮的提取研究》(李增富，吳榮峰，應用化工第37卷第11期)，其收率為 167.974mg/100g 葛根粉，即 0.17%。利用植物細胞、組織或器官培養來獲得對人類有用的次生代謝物已經成為當今植物生物技術領域的研究熱點之一，其最大優點就是生產完全在人工控制條件下進行，可以通過改變培養條件和選擇優良培養體系得到超整株植物收率的代謝產物。然而影響植物細胞培養的因素很多，如培養基成分，植物本身的特性，培養條件，環境條件，生物因素，內部因素等，尤其是培養基成分則是關鍵之關鍵，其不僅影響機體的生長還影響機體的次生代謝產物合成。因此，提供一種通過培養葛根細胞制備黃酮的方法對于開拓黃酮制備新途徑具有重要意義。

發明內容
有鑒于此，本發明的目的在于提供一種通過培養葛根細胞制備黃酮的方法，使得該方法能夠提高從葛根中獲取黃酮的收率。為了實現上述目的，本發明提供如下技術方案:—種通過培養葛根細胞制備黃酮的方法，將葛根愈傷組織細胞接種在培養基上在23-27°C溫度、800-12001x光照強度下，以每天8_12小時光照時間培養15-20天，然后分離
獲得黃酮；所述培養基由NH4NO3、KNO3、MgSO4 *7H20,CaCl2.2Η20,KH2PO4,FeSO4.7Η20、EDTA-Na2、K1、CoCl2.6Η20、H3BO3> Na2MoO2.2Η20、MnSO4.H2O, CuSO4.5Η20、ZnSO4.7Η20、6_ (芐胺基)嘌呤、2，4 一二氯苯氧乙酸、蔗糖、瓊脂組成，pH值為5.8。其中，所述葛根愈傷組織細胞可通過本領域常規的植物組織培養和愈傷組織培養操作制備獲得，即通過將葛根外植體進行培養，然后進行愈傷組織培養后獲得，所述葛根外植體取自根部。本發明所述葛根愈傷組織細胞由浙江工商大學生物工程實驗室提供。本發明針對現有提取黃酮收率不高的缺陷，通過細胞培養技術手段，優化培養條件和選擇優良培養體系對葛根細胞進行培養，促使其分泌次生代謝物黃酮，收率得到提升。作為優選，所 述培養基由以下方法制備獲得:以質量百分濃度計，配制由8.25% 的 NH4NO3>9.50% 的 KNO3> 1.85% 的 MgSO4.7H20和余量水組成的第一溶液；配制由2.51%的CaCl2.2H20和余量水組成的第二溶液；配制由0.85%的KH2PO4和余量水組成的第三溶液；配制由0.139%的FeSO4.7H20、0.187%的EDTA-Na2和余量水組成的第四溶液；配制由0.00415% 的 KI,0.00012% 的 CoCl2.6Η20、0.031% 的 Η3Β03、0.00125% 的Na2MoO2.2Η20、0.0845% 的 MnSO4.Η20、0.00012% 的 CuSO4.5Η20、0.043% 的 ZnSO4.7Η20 和余量水組成的第五溶液；配制由0.5%的肌醇、0.0025%的煙酸、0.0025%的鹽酸吡哆醇、0.0005%的鹽酸硫氨素、0.01%的甘氨酸和余量水組成的第六溶液；分別取第一溶液、第二溶液、第三溶液、第四溶液、第五溶液和第六溶液各20mL，然后加入6-(芐胺基)嘌呤、2，4 一二氯苯氧乙酸、蔗糖以及瓊脂定容至IOOOmL,其中6-(芐胺基)嘌呤濃度為10_6M，2，4 — 二氯苯氧乙酸濃度為1.5X10_5M，蔗糖質量百分濃度為3%，瓊脂質量百分濃度為0.75%，然后調pH值為5.8高壓滅菌后即得培養基。需要說明的是，本發明所述培養基并不局限于配制成IOOOmL,本領域技術人員通過參考本發明所述培養基配制比例，能夠輕易的擴大或縮小所述培養基的規格，這也在本發明保護范圍內。在本發明培養葛根細胞的過程中，作為優選，所述光照強度為10001X，所述光照時間為10小時，所述溫度為25°C，所述培養時間為16-19天。在本發明所述方法的最后，從培養基中提取分離黃酮屬于本領域常規技術手段，如采用乙醇進行浸提提取分離。作為優選，本發明所述分離提取獲得黃酮具體為:步驟1、收集培養基中的愈傷組織細胞烘干、粉碎，然后以愈傷組織細胞:50-75%乙醇為lg:15-35mL的質量體積比，向愈傷組織細胞中加入乙醇并振蕩20_60min，然后過濾，獲得濾液和濾渣，濾液備用，濾渣進行步驟2 ；步驟2、以濾渣:50-75%乙醇為lg: 15_35mL的質量體積比，向濾渣中加入乙醇并振蕩20-60min，然后過濾，獲得濾液和濾洛，濾液備用，濾洛重復本步驟1_3次；步驟3、合并步驟I和步驟2所獲得的所有濾液、濃縮并烘干，即得黃酮。其中，作為優選，步驟I和步驟2所述質量體積比為lg:20mL，步驟I和步驟2所述乙醇體積百分數為60%，步驟I和步驟2所述振蕩時間為40min。根據現有技術的記載(見背景技術)，現有提取葛根總黃酮的收率為0.17%，而經過本發明所述方法獲得的黃酮，其收率將近0.5%，相對于現有技術明顯得到提高。同時，本發明還調整培養基部分組分以及用量，結果顯示，調整后的培養方法獲得的黃酮收率為0.36%，表明隨意調整培養基成分易使得黃酮收率降低。由以上技術方案可知，本發明通過優化培養條件和選擇優良培養體系，以培養葛根細胞的生物技術手段來制備黃酮，收率明顯高于現有乙醇浸提法、水提取法等常規方法的黃酮收率，開拓了制備黃酮的新途徑。


圖1所示為不同培養基黃酮收率對比試驗折線圖；其中，折線A代表本發明培養基的黃酮收率，折線B代表對照培養基的黃酮收率，橫坐標表示時間(天)，縱坐標表示黃酮收率(％)。
具體實施方式
本發明實施例公開了一種通過培養葛根細胞制備黃酮的方法。本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文所述的產品及方法進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。按照本發明所述方法，將葛根愈傷組織細胞接種在培養基上在23_27°C溫度、800-12001x光照強度下，以每天8-12小時光照時間培養15-20天，然后分離獲得黃酮；所述培養基由NH4NO3、KNO3、MgSO4 *7H20,CaCl2.2Η20,KH2PO4,FeSO4.7Η20、EDTA-Na2、K1、CoCl2.6Η20、Η3Β03、Na2MoO2.2Η20、MnSO4.H2O, CuSO4.5Η20、ZnSO4.7Η20、6_ (芐胺基)嘌呤、2，4 一二氯苯氧乙酸、蔗糖、瓊脂組成，pH值為5.8。其中，葛根愈傷組織細胞可采用常規細胞培養方法進行制備，如切取葛根根部外植體接種到MS培養基中進行植物組織培養，然后將切口處的愈傷組織接種到誘導愈傷組織的培養基上進行培養獲得愈傷組織細胞，所述誘導愈傷組織的培養基一般由MS培養基、6-BA、NAA組成，屬本領域公知。為了進一步理解本發明，下面結合實施例對本發明提供的一種通過培養葛根細胞制備黃酮的方法進行詳細說明。實施例1:通過培養葛根細胞制備黃酮1、配制培養基(質量百分濃度)配制由8.25% 的 ΝΗ4Ν03、9.50% 的 ΚΝ03、1.85% 的 MgSO4.7Η20 和余量水組成的第一溶液；配制由2.51%的CaCl2.2Η20和余量水組成的第二溶液；配制由0.85%的KH2PO4和余量水組成的第三溶液；配制由0.139%的FeSO4.7Η20、0.187%的EDTA-Na2和余量水組成的第四溶液；配制由0.00415% 的 KI,0.00012% 的 CoCl2.6Η20、0.031% 的 Η3Β03、0.00125% 的Na2MoO2.2Η20、0.0845% 的 MnSO4.Η20、0.00012% 的 CuSO4.5Η20、0.043% 的 ZnSO4.7Η20 和余量水組成的第五溶液；配制由0.5%的肌醇、0.0025%的煙酸、0.0025%的鹽酸吡哆醇、0.0005%的鹽酸硫氨素、0.01%的甘氨酸和余量水組成的第六溶液；
分別取第一溶液、第二溶液、第三溶液、第四溶液、第五溶液和第六溶液各20mL，然后加入6-(芐胺基)嘌呤(即6BA)、2，4 一二氯苯氧乙酸(即2，4 一 D)、蔗糖以及瓊脂定容至IOOOmL,其中6-(芐胺基)嘌呤濃度為10_6M，2，4 — 二氯苯氧乙酸濃度為1.5X10_5M，蔗糖質量百分濃度為3% (即30g/1000mL培養基)，瓊脂質量百分濃度為0.75% (即7.5g/1000mL培養基)，然后調PH值為5.8，分裝到三角燒瓶中，121 °C、0.1Mpa到0.15Mpa下滅菌15min，冷卻凝固后即得培養基。2、制備方法葛根愈傷組織 細胞由浙江工商大學生物工程實驗室提供。將葛根愈傷組織細胞接種在滅菌后的培養基上，并在25°C溫度、lOOOlx光照強度下，以每天10小時光照時間(上午8時至下午6時)培養16天；收集培養基中的愈傷組織細胞烘干、粉碎，然后以愈傷組織細胞:60%乙醇為lg:20mL的質量體積比，向愈傷組織細胞中加入乙醇并振蕩40min，然后過濾，獲得濾液和濾渣，濾液備用，濾渣進行如下步驟；以濾渣:60%乙醇為lg:20mL的質量體積比，向濾渣中加入乙醇并振蕩40min，然后過濾，獲得濾液和濾渣，濾液備用，此步獲得的濾渣按照此步處理方式重復加乙醇振蕩2次；合并前述個步驟中所獲得的所有濾液、濃縮并烘干，即得黃酮，收率為0.43%。實施例2:通過培養葛根細胞制備黃酮1、配制培養基(質量百分濃度)配制由 8.25% 的 ΝΗ4Ν03、9.50% 的 ΚΝ03、1.85% 的 MgSO4.7Η20 和余量水組成的第一溶液；配制由2.51%的CaCl2.2Η20和余量水組成的第二溶液；配制由0.85%的KH2PO4和余量水組成的第三溶液；配制由0.139%的FeSO4.7Η20、0.187%的EDTA-Na2和余量水組成的第四溶液；配制由0.00415% 的 KI,0.00012% 的 CoCl2.6Η20、0.031% 的 Η3Β03、0.00125% 的Na2MoO2.2Η20、0.0845% 的 MnSO4.Η20、0.00012% 的 CuSO4.5Η20、0.043% 的 ZnSO4.7Η20 和余量水組成的第五溶液；配制由0.5%的肌醇、0.0025%的煙酸、0.0025%的鹽酸吡哆醇、0.0005%的鹽酸硫氨素、0.01%的甘氨酸和余量水組成的第六溶液；分別取第一溶液、第二溶液、第三溶液、第四溶液、第五溶液和第六溶液各20mL，然后加入6-(芐胺基)嘌呤(即6BA)、2，4 一二氯苯氧乙酸(即2，4 一 D)、蔗糖以及瓊脂定容至IOOOmL,其中6-(芐胺基)嘌呤濃度為10_6M，2，4 — 二氯苯氧乙酸濃度為1.5X10_5M，蔗糖質量百分濃度為3% (即30g/1000mL培養基)，瓊脂質量百分濃度為0.75% (即7.5g/1000mL培養基)，然后調PH值為5.8，分裝到三角燒瓶中，121 °C、0.1Mpa到0.15Mpa下滅菌15min，冷卻凝固后即得培養基。2、制備方法葛根愈傷組織細胞由浙江工商大學生物工程實驗室提供。將葛根愈傷組織細胞接種在滅菌后的培養基上，并在26°C溫度、IIOOIx光照強度下，以每天11小時光照時間(上午8時至下午7時)培養17天；
收集培養基中的愈傷組織細胞烘干、粉碎，然后以愈傷組織細胞:65%乙醇為lg:25mL的質量體積比，向愈傷組織細胞中加入乙醇并振蕩60min，然后過濾，獲得濾液和濾渣，濾液備用，濾渣進行如下步驟；以濾渣:65%乙醇為lg:25mL的質量體積比，向濾渣中加入乙醇并振蕩60min，然后過濾，獲得濾液和濾渣，濾液備用，此步獲得的濾渣按照此步處理方式重復加乙醇振蕩3次；合并前述個步驟中所獲得的所有濾液、濃縮并烘干，即得黃酮，收率為0.47%。實施例3:通過培養葛根細胞制備黃酮1、配制培養基(質量百分濃度)
配制由8.25% 的 ΝΗ4Ν03、9.50% 的 ΚΝ03、1.85% 的 MgSO4.7Η20 和余量水組成的第一溶液；配制由2.51%的CaCl2.2Η20和余量水組成的第二溶液；配制由0.85%的KH2PO4和余量水組成的第三溶液；配制由0.139%的FeSO4.7Η20、0.187%的EDTA-Na2和余量水組成的第四溶液；配制由0.00415% 的 KI,0.00012% 的 CoCl2.6Η20、0.031% 的 Η3Β03、0.00125% 的Na2MoO2.2Η20、0.0845% 的 MnSO4.Η20、0.00012% 的 CuSO4.5Η20、0.043% 的 ZnSO4.7Η20 和余量水組成的第五溶液；配制由0.5%的肌醇、0.0025%的煙酸、0.0025%的鹽酸吡哆醇、0.0005%的鹽酸硫氨素、0.01%的甘氨酸和余量水組成的第六溶液；分別取第一溶液、第二溶液、第三溶液、第四溶液、第五溶液和第六溶液各20mL，然后加入6-(芐胺基)嘌呤(即6BA)、2，4- 二氯苯氧乙酸(即2，4 一 D)、蔗糖以及瓊脂定容至IOOOmL,其中6-(芐胺基)嘌呤濃度為10_6M，2，4 — 二氯苯氧乙酸濃度為1.5X10_5M，蔗糖質量百分濃度為3% (即30g/1000mL培養基)，瓊脂質量百分濃度為0.75% (即7.5g/1000mL培養基)，然后調PH值為5.8，分裝到三角燒瓶中，121 °C、0.1Mpa到0.15Mpa下滅菌15min，冷卻凝固后即得培養基。2、制備方法葛根愈傷組織細胞由浙江工商大學生物工程實驗室提供。將葛根愈傷組織細胞接種在滅菌后的培養基上，并在27°C溫度、12001x光照強度下，以每天12小時光照時間(上午8時至下午8時)培養18天；收集培養基中的愈傷組織細胞烘干、粉碎，然后以愈傷組織細胞:70%乙醇為lg:30mL的質量體積比，向愈傷組織細胞中加入乙醇并振蕩50min，然后過濾，獲得濾液和濾渣，濾液備用，濾渣進行如下步驟；以濾渣:70%乙醇為lg:30mL的質量體積比，向濾渣中加入乙醇并振蕩50min，然后過濾，獲得濾液和濾渣，濾液備用，此步獲得的濾渣按照此步處理方式重復加乙醇振蕩I次；合并前述個步驟中所獲得的所有濾液、濃縮并烘干，即得黃酮，收率為0.47%。實施例4:通過培養葛根細胞制備黃酮1、配制培養基(質量百分濃度)配制由 8.25% 的 ΝΗ4Ν03、9.50% 的 ΚΝ03、1.85% 的 MgSO4.7Η20 和余量水組成的第一溶液；配制由2.51%的CaCl2.2H20和余量水組成的第二溶液；配制由0.85%的KH2PO4和余量水組成的第三溶液；配制由0.139%的FeSO4.7H20、0.187%的EDTA-Na2和余量水組成的第四溶液；配制由0.00415% 的 KI,0.00012% 的 CoCl2.6Η20、0.031% 的 Η3Β03、0.00125% 的Na2MoO2.2Η20、0.0845% 的 MnSO4.Η20、0.00012% 的 CuSO4.5Η20、0.043% 的 ZnSO4.7Η20 和余量水組成的第五溶液；配制由0.5%的肌醇、0.0025%的煙酸、0.0025%的鹽酸吡哆醇、0.0005%的鹽酸硫氨素、0.01%的甘氨酸和余量水組成的第六溶液；分別取第一溶液、第二溶液、第三溶液、第四溶液、第五溶液和第六溶液各20mL，然后加入6-(芐胺基)嘌呤(即6BA)、2，4 一二氯苯氧乙酸(即2，4 一 D)、蔗糖以及瓊脂定容至IOOOmL,其中6-(芐胺基)嘌呤濃度為10_6M，2，4 — 二氯苯氧乙酸濃度為1.5X10_5M，蔗糖質量百分濃度為3% (即30g/1000mL培養基)，瓊脂質量百分濃度為0.75% (即7.5g/1000mL培養基)，然后調PH值為5.8，分裝到三角燒瓶中，121 °C、0.1Mpa到0.15Mpa下滅菌15min，冷卻凝固后即得培養基。2、制備方法葛根愈傷組織細胞由浙江工商大學生物工程實驗室提供。

將葛根愈傷組織細胞接種在滅菌后的培養基上，并在26°C溫度、IOOOIx光照強度下，以每天10小時光照時間(上午8時至下午6時)培養19天；收集培養基中的愈傷組織細胞烘干、粉碎，然后以愈傷組織細胞:75%乙醇為lg:35mL的質量體積比，向愈傷組織細胞中加入乙醇并振蕩40min，然后過濾，獲得濾液和濾渣，濾液備用，濾渣進行如下步驟；以濾渣:75%乙醇為lg:35mL的質量體積比，向濾渣中加入乙醇并振蕩40min，然后過濾，獲得濾液和濾渣，濾液備用，此步獲得的濾渣按照此步處理方式重復加乙醇振蕩2次；合并前述個步驟中所獲得的所有濾液、濃縮并烘干，即得黃酮，收率為0.48%。實施例5:通過培養葛根細胞制備黃酮1、配制培養基(質量百分濃度)配制由8.25% 的 ΝΗ4Ν03、9.50% 的 ΚΝ03、1.85% 的 MgSO4.7Η20 和余量水組成的第一溶液；配制由2.51%的CaCl2.2Η20和余量水組成的第二溶液；配制由0.85%的KH2PO4和余量水組成的第三溶液；配制由0.139%的FeSO4.7Η20、0.187%的EDTA-Na2和余量水組成的第四溶液；配制由0.00415% 的 KI,0.00012% 的 CoCl2.6Η20、0.031% 的 Η3Β03、0.00125% 的Na2MoO2.2Η20、0.0845% 的 MnSO4.Η20、0.00012% 的 CuSO4.5Η20、0.043% 的 ZnSO4.7Η20 和余量水組成的第五溶液；配制由0.5%的肌醇、0.0025%的煙酸、0.0025%的鹽酸吡哆醇、0.0005%的鹽酸硫氨素、0.01%的甘氨酸和余量水組成的第六溶液；分別取第一溶液、第二溶液、第三溶液、第四溶液、第五溶液和第六溶液各20mL，然后加入6-(芐胺基)嘌呤(即6BA)、2，4 一二氯苯氧乙酸(即2，4 一 D)、蔗糖以及瓊脂定容至IOOOmL,其中6-(芐胺基)嘌呤濃度為10_6M，2，4 — 二氯苯氧乙酸濃度為1.5X10_5M，蔗糖質量百分濃度為3% (即30g/1000mL培養基)，瓊脂質量百分濃度為0.75% (即7.5g/1000mL培養基)，然后調PH值為5.8，分裝到三角燒瓶中，121 °C、0.1Mpa到0.15Mpa下滅菌15min，冷卻凝固后即得培養基。2、制備方法葛根愈傷組織細胞由浙江工商大學生物工程實驗室提供。將葛根愈傷組織 細胞接種在滅菌后的培養基上，并在23°C溫度、8001x光照強度下，以每天8小時光照時間(上午8時至下午4時)培養20天；收集培養基中的愈傷組織細胞烘干、粉碎，然后以愈傷組織細胞:50%乙醇為lg:15mL的質量體積比，向愈傷組織細胞中加入乙醇并振蕩20min，然后過濾，獲得濾液和濾渣，濾液備用，濾渣進行如下步驟；以濾渣:50%乙醇為lg:15mL的質量體積比，向濾渣中加入乙醇并振蕩20min，然后過濾，獲得濾液和濾渣，濾液備用，此步獲得的濾渣按照此步處理方式重復加乙醇振蕩3次；合并前述個步驟中所獲得的所有濾液、濃縮并烘干，即得黃酮，收率為0.46%。實施例6:通過培養葛根細胞制備黃酮1、配制培養基(質量百分濃度)配制由8.25% 的 NH4N03、9.50% 的 ΚΝ03、1.85% 的 MgSO4.7H20 和余量水組成的第一溶液；配制由2.51%的CaCl2.2H20和余量水組成的第二溶液；配制由0.85%的KH2PO4和余量水組成的第三溶液；配制由0.139%的FeSO4.7H20、0.187%的EDTA-Na2和余量水組成的第四溶液；配制由0.00415% 的 KI,0.00012% 的 CoCl2.6Η20、0.031% 的 Η3Β03、0.00125% 的Na2MoO2.2Η20、0.0845% 的 MnSO4.Η20、0.00012% 的 CuSO4.5Η20、0.043% 的 ZnSO4.7Η20 和余量水組成的第五溶液；配制由0.5%的肌醇、0.0025%的煙酸、0.0025%的鹽酸吡哆醇、0.0005%的鹽酸硫氨素、0.01%的甘氨酸和余量水組成的第六溶液；分別取第一溶液、第二溶液、第三溶液、第四溶液、第五溶液和第六溶液各20mL，然后加入6-(芐胺基)嘌呤(即6BA)、2，4 一二氯苯氧乙酸(即2，4 一 D)、蔗糖以及瓊脂定容至IOOOmL,其中6-(芐胺基)嘌呤濃度為10_6M，2，4 — 二氯苯氧乙酸濃度為1.5X10_5M，蔗糖質量百分濃度為3% (即30g/1000mL培養基)，瓊脂質量百分濃度為0.75% (即7.5g/1000mL培養基)，然后調PH值為5.8，分裝到三角燒瓶中，121 °C、0.1Mpa到0.15Mpa下滅菌15min，冷卻凝固后即得培養基。2、制備方法葛根愈傷組織細胞由浙江工商大學生物工程實驗室提供。將葛根愈傷組織細胞接種在滅菌后的培養基上，并在24°C溫度、9001x光照強度下，以每天9小時光照時間(上午8時至下午5時)培養15天；收集培養基中的愈傷組織細胞烘干、粉碎，然后以愈傷組織細胞:55%乙醇為lg:20mL的質量體積比，向愈傷組織細胞中加入乙醇并振蕩30min，然后過濾，獲得濾液和濾渣，濾液備用，濾渣進行如下步驟；以濾渣:55%乙醇為lg:20mL的質量體積比，向濾渣中加入乙醇并振蕩30min，然后過濾，獲得濾液和濾渣，濾液備用，此步獲得的濾渣按照此步處理方式重復加乙醇振蕩2次；合并前述個步驟中所獲得的所有濾液、濃縮并烘干，即得黃酮，收率為0.40%。實施例7:對比試驗調整本發明所述培養基成分中的蔗糖更換為常規碳源-葡萄糖，同時調整MnSO4 -H2O質量百分濃度為0.1115%、鹽酸硫氨素質量百分濃度為0.0025%,并且去掉6_(芐胺基)嘌呤、2，4 一二氯苯氧乙酸，一次配方作為對照培養基進行黃酮的制備，制備方法參照實施例1，結果見表I和圖1。表I不同培養基黃酮收率對比試驗結果
權利要求
1.一種通過培養葛根細胞制備黃酮的方法，其特征在于，將葛根愈傷組織細胞接種在滅菌后的培養基上，并在23-27°C溫度、800-12001X光照強度下，以每天8-12小時光照時間培養15-20天，然后分離提取獲得黃酮；所述培養基由 NH4N03、KNO3> MgSO4.7H20、CaCl2.2H20、KH2PO4, FeSO4.7H20、EDTA-Na2,K1、CoCl2.6H20、H3BO3' Na2MoO2.2H20、MnSO4.H2O, CuSO4.5H20、ZnSO4.7H20、6_ (芐胺基)嘌呤、2，4 一二氯苯氧乙酸、蔗糖、瓊脂組成，pH值為5.8。
2.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述培養基由以下方法制備獲得: 以質量百分濃度計，配制由8.25%的NH4NO3^9.50%的ΚΝ03、1.85%的MgSO4.7H20和余量水組成的第一溶液； 配制由2.51%的CaCl2.2H20和余量水組成的第二溶液； 配制由0.85%的KH2PO4和余量水組成的第三溶液； 配制由0.139%的FeSO4.7H20、0.187%的EDTA-Na2和余量水組成的第四溶液；配制由 0.00415% 的 KI,0.00012% 的 CoCl2.6Η20、0.031% 的 Η3Β03、0.00125% 的Na2MoO2.2Η20、0.0845% 的 MnSO4.Η20、0.00012% 的 CuSO4.5Η20、0.043% 的 ZnSO4.7Η20 和余量水組成的第五溶液； 配制由0.5%的肌醇、0.0025%的煙酸、0.0025%的鹽酸吡哆醇、0.0005%的鹽酸硫氨素、0.01%的甘氨酸和余量水組成的第六溶液； 分別取第一溶液、第二溶液、第三溶液、第四溶液、第五溶液和第六溶液各20mL，然后加入6-(芐胺基)嘌 呤、2，4 一二氯苯氧乙酸、蔗糖以及瓊脂定容至IOOOmL,其中6-(芐胺基)嘌呤濃度為10_6M，2，4 一二氯苯氧乙酸濃度為1.5X10_5M，蔗糖質量百分濃度為3%，瓊脂質量百分濃度為0.75%，然后調pH值為5.8高壓滅菌后即得培養基。
3.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述葛根愈傷組織細胞通過將葛根外植體進行培養，然后進行愈傷組織培養后獲得。
4.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述光照強度為ΙΟΟΟΙχ。
5.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述光照時間為10小時。
6.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述溫度為25°C。
7.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述培養時間為16-19天。
8.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述分離提取獲得黃酮具體為: 步驟1、收集培養基中的愈傷組織細胞烘干、粉碎，然后以愈傷組織細胞:50-75%乙醇為lg:15-35mL的質量體積比，向愈傷組織細胞中加入乙醇并振蕩20_60min，然后過濾，獲得濾液和濾渣，濾液備用，濾渣進行步驟2 ； 步驟2、以濾渣:50-75%乙醇為lg: 15-35mL的質量體積比，向濾渣中加入乙醇并振蕩20-60min，然后過濾，獲得濾液和濾洛，濾液備用，濾洛重復本步驟1_3次； 步驟3、合并步驟I和步驟2所獲得的所有濾液、濃縮并烘干，即得黃酮。
9.根據權利要求8所述方法，其特征在于，步驟I和步驟2所述質量體積比為lg:20mL。
10.根據權利要求8所述方法，其特征在于，步驟I和步驟2所述乙醇體積百分數為 60%。
全文摘要
本發明涉及細胞工程領域，具體公開了一種通過培養葛根細胞制備黃酮的方法。該方法將葛根愈傷組織細胞接種在培養基上在23-27℃溫度、800-1200lx光照強度下，以每天8-12小時光照時間培養15-20天，然后分離獲得黃酮。本發明通過優化培養條件和選擇優良培養體系，以培養葛根細胞的生物技術手段來制備黃酮，收率明顯高于現有乙醇浸提法、水提取法等常規方法的黃酮收率，開拓了制備黃酮的新途徑。
文檔編號A61P39/06GK103146637SQ201310045809
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月1日 優先權日2013年2月1日
發明者周天瓊, 周正兵, 高留根 申請人:杭州華締投資管理有限公司