Gadd45g基因及其表達產物在誘導腫瘤細胞衰老中的應用的制作方法

Gadd45g基因及其表達產物在誘導腫瘤細胞衰老中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了GADD45G基因及其表達產物在誘導腫瘤細胞衰老中的應用。具體地，本發明提供了一種GADD45G基因、蛋白或其促進劑的用途，用于制備誘導腫瘤細胞尤其是肝癌細胞衰老的藥物組合物。此外，本發明還提供了GADD45G基因蛋白或其促進劑用于抑制JAK-STAT3信號通路從而進一步抑制腫瘤細胞生長或增殖。本發明方法揭示了GADD45G基因作為抑癌基因的作用機制，并能將該機制廣泛應用于腫瘤尤其是肝癌的治療。
【專利說明】GADD45G基因及其表達產物在誘導腫瘤細胞衰老中的應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及腫瘤治療領域。具體地，涉及GADD45G基因、蛋白或其促進劑通過誘導 腫瘤細胞衰老從而抑制腫瘤細胞生長中的應用。

【背景技術】
[0002] 原發性肝癌是一種惡性程度較高以及預后差的惡性腫瘤，其在全球死亡率和發 病率分別列所有腫瘤的第4位和第7位，尤其中國是肝癌的高發病地區。因其初期癥狀不 明顯，檢測出時病人已多處于晚期，而晚期因癌細胞擴散和轉移而導致預后不良，所以肝 癌的防治十分重要。研究表明，當體細胞發生遺傳改變時，往往能造成細胞衰老，從而抑制 腫瘤發生；因此，細胞衰老是機體保持穩態的一種調節機制。細胞發生惡性轉化需要克服細 胞衰老的阻礙。
[0003] 對于已發生轉化的細胞或腫瘤細胞而言，誘導細胞衰老相關機制的研究，對于腫 瘤臨床治療具有十分重要的意義。因此，本領域迫切需要開發一種能誘導腫瘤細胞衰老從 而抑制腫瘤生長或擴增的方法。


【發明內容】

[0004] 本發明提供了一種GADD45G基因、蛋白或其促進劑在誘導腫瘤細胞衰老從而抑制 腫瘤細胞生長或擴增的用途。
[0005] 本發明的第一方面，提供了一種GADD45G基因、蛋白或其促進劑的用途，用于制備 誘導腫瘤細胞衰老的藥物組合物。
[0006] 在另一優選例中，所述的腫瘤細胞來自以下腫瘤：肝癌、肺癌、胃癌、大腸癌、卵巢 癌、胰腺癌。
[0007] 在另一優選例中，所述的腫瘤細胞來自肝癌。
[0008] 在另一優選例中，所述的GADD45G基因核苷酸序列如SEQ ID NO. : 1所示，其編碼 的蛋白序列如SEQ ID NO. :2所示。
[0009] 在另一優選例中，所述的GADD45G來自哺乳動物，較佳地，來源于大鼠、小鼠、人， 更佳地，來源于人。
[0010] 在另一優選例中，所述的GADD45G基因、蛋白或其促進劑包括的GADD45G基因表達 產物、促進型miRNA、促進型轉錄調控因子、或促進型靶向小分子化合物。
[0011] 在另一優選例中，所述的GADD45G促進劑為MG-132。
[0012] 在另一優選例中，所述的藥物組合物包括所述GADD45G基因、蛋白或其促進劑以 及藥學上可接受的載體。
[0013] 本發明的第二方面，提供了一種用于誘導腫瘤細胞衰老的藥物組合物，所述的藥 物組合物包括GADD45G基因、蛋白或其促進劑以及藥學上可接受的鹽。
[0014] 在另一優選例中，所述的GADD45G促進劑包括的GADD45G基因表達產物、促進型 miRNA、促進型轉錄調控因子、或促進型靶向小分子化合物。
[0015] 在另一優選例中，所述的GADD45G促進劑為MG-132。
[0016] 本發明第三方面，提供了一種篩選制備誘導腫瘤細胞衰老的候選化合物的方法， 包括步驟：
[0017] (a)在測試組中，向細胞培養體系添加測試化合物，并觀察測試組中所述細胞 GADD45G的表達量和/或活性；在對照組中，向相同的培養體系不添加測試化合物，并觀察 對照組中所述細胞的GADD45G的表達量和/或活性；
[0018] 其中，如果測試組中的GADD45G的表達量和/或活性大于對照組，則說明該化合物 是對GADD45G有促進作用的用于誘導腫瘤細胞衰老的候選化合物。
[0019] 在另一優選例中，所述的步驟還包括：
[0020] (b)對（a)中獲得的候選化合物，還進一步測試其對JAK-STAT3的抑制作用。
[0021] 在另一優選例中，步驟（b)中還包括：在測試組中，向腫瘤細胞培養體系添加測試 化合物，并觀察所述的腫瘤細胞的生長情況和/或細胞量；在對照組中，向相同培養體系不 添加測試化合物，并觀察所述的腫瘤細胞的生長情況和/或細胞量；
[0022] 其中，若測試組中衰老的細胞比例顯著大于對照組，和/或若測試組中的細胞量 顯著少于對照組，則說明，該化合物是用于誘導腫瘤細胞衰老的候選化合物。
[0023] 本發明第三方面，提供了一種JAK-STAT3抑制劑的用途，用于制備誘導腫瘤細胞 衰老的藥物組合物。
[0024] 在另一優選例中，所述的腫瘤細胞來自肝癌、肺癌、胃癌、大腸癌、卵巢癌、胰腺癌。
[0025] 在另一優選例中，所述的腫瘤細胞來自肝癌。
[0026] 在另一優選例中，所述的JAK-STAT3來自哺乳動物，較佳地，來源于大鼠、小鼠、 人，更佳地，來源于人。
[0027] 在另一優選例中，所述的藥物組合物包括JAK-STAT3抑制劑以及藥學上可接受的 載體。
[0028] 在另一優選例中，所述的JAK-STAT3抑制劑包括GADD45G基因、蛋白或其促進劑和 /或shP2基因、蛋白或其促進劑。
[0029] 在另一優選例中，所述的GADD45G基因、蛋白或其促進劑包括的GADD45G基因表達 產物、促進型miRNA、促進型轉錄調控因子、或促進型靶向小分子化合物。
[0030] 本發明第三方面，提供了一種體外非治療性的誘導腫瘤細胞衰老的方法，向細胞 培養體系中加入GADD45G基因、蛋白或其促進劑，從而誘導腫瘤細胞的衰老。
[0031] 本發明第四方面，提供了一種誘導腫瘤細胞衰老從而治療腫瘤的方法，向所需要 的對象施用安全有效量的GADD45G基因、蛋白或其促進劑；和/或向所需要的對象施用安全 有效量的JAK-STAT3抑制劑。
[0032] 應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033] 圖1顯示了 GADD45G在肝癌中低表達。其中：圖IA的qRT-PCR結果顯示GADD45G 在人肝癌細胞系及永生化肝細胞系THLE-2中的表達情況。圖IBqRT-PCR結果顯示GADD45G 在DEN藥物誘導小鼠肝細胞性腫瘤模型中，癌及癌旁組織中的表達情況。圖IC qRT-PCR 結果顯不GADD45G在人肝癌臨床樣本的癌及癌芳組織中的表達情況。（***P〈0. 001)圖ID Western blotting結果顯示GADD45G在人肝癌臨床樣本的癌及癌旁組織中的表達情況。
[0034] 圖2顯示了 GADD45G與肝癌的分化呈負性相關：免疫組化評分顯示，臨床肝癌樣本 中GADD45G表達強弱與肝癌分化等級的相關性（**P〈0. 01)。
[0035] 圖3顯示了 GADD45G條件表達載體的建立。
[0036] 圖4顯示了過表達GADD45G誘導細胞衰老。其中，圖4A過表達GADD45G及對照組 的SA- β -gal染色結果。圖4B qRT-PCR結果顯示過表達GADD45G及對照組中IL-8的表達 情況。圖4C Annexin V/7-AAD染色檢測過表達GADD45G及對照組的細胞凋亡情況。圖4D BrdU染色檢測過表達GADD45G及對照組的細胞增殖情況。（*P〈0. 05, **P〈0. 01)
[0037] 圖5顯示了過表達GADD45G誘導Sk-H印1細胞衰老。其中，圖5A Dox誘導過表達 GADD45G及對照組Sk-H印1細胞的SA- β -gal染色結果。圖5BqRT-PCR結果顯示Dox誘導 過表達GADD45G及對照組中IL-6的表達情況。圖5C qRT-PCR結果顯示Dox誘導過表達 GADD45G及對照組中IL-8的表達情況。圖Western blotting檢測顯示Dox誘導過表達 GADD45G及對照組中衰老標志物γ -H2AX及GADD45G的表達情況。
[0038] 圖6顯示了 GADD45G在體內抑制腫瘤生長。其中，圖6A過表達GADD45G及對照組 Sk-H印1細胞在體內的腫瘤形成情況（*P〈0. 05)。圖6B過表達GADD45G及對照組Sk-H印1 細胞形成的腫瘤生長狀況（**P〈〇. 01)。圖6C H&E染色及免疫組織化學檢測過表達GADD45G 及對照組Sk-H印1細胞所形成的腫瘤中細胞增殖標志物Ki-67的表達情況。（X400)
[0039] 圖7顯示了在Sk-H印1細胞中GADD45G誘導細胞衰老不通過p53/p21或pl6/Rb通 路。其中，圖7A轉有SV40-LT及對照質粒的Sk-Hepl經doxorubicin處理24小時后，Western blotting檢測顯示p53及p21的表達情況。圖7BTet-GADD45G-Sk-H印1及對照細胞轉有 SV40-LT及對照質粒后，經Dox誘導表達4天后，SA- β -gal染色檢測各細胞衰老情況。圖 7C Western blotting 檢測顯示 siRNA 干擾 p21、p27、p53 或 Rb 后，Tet-GADD45G-Sk-H印 1 細胞中P21、p27、p53或Rb的表達情況。圖7D SA-P-gal染色檢測siRNA干擾p21、p27、 p53或Rb后，Dox誘導GADD45G表達的細胞的衰老比率情況。圖7E MTT檢測siRNA干擾 p21、p27、p53或Rb后，Dox誘導GADD45G表達的細胞的存活比率情況。
[0040] 圖8顯示了 GADD45G誘導肝癌細胞衰老不通過p53/p21或pl6/Rb通路。其中， 圖8A在LPC-H-Ras V12細胞中，Dox誘導GADD45G表達后細胞克隆形成情況（2000, 1000 和500個細胞每孔)。圖8B在LPC-H-Ras V12細胞中，Dox誘導GADD45G表達后SA-β -gal 染色檢測細胞衰老情況。圖8C在Tet-GADD45G-H印3B細胞中，siRNA干擾pl6后Dox誘導 GADD45G表達3天，SA- β -gal染色檢測細胞衰老情況。圖8D在Tet-GADD45G-H印3B細胞 中，siRNA 干擾 pl6 后 Dox 誘導 GADD45G 表達 3 天，Western blotting 檢測 pl6 及 GADD45G 的表達情況。
[0041] 圖9顯示了 GADD45G抑制Jak2, Tyk2和Stat3的活化。其中，圖9A Dox誘 導表達 GADD45G 后，Western blotting 檢測 Sk-H印 1、SMMC-7721 及 H印3B 細胞中 p-Stat3 (Tyr705)，Stat3 及 GADD45G 的表達情況。圖 9BTet-GADD45G-Sk-H印 1 細胞經 Dox 處 理不同時間后，Western blotting 檢測 p_Stat3 (Tyr705)、Stat3、p_Tyk2 (Tyrl054/1055)、 Tyk2、p-Jak2 (Tyrl007/1008)、Jak2 及 GADD45G 的表達情況。
[0042] 圖10顯示了 Na3V04能夠抑制GADD45G造成的細胞衰老。其中，圖10ATet-GADD45G Sk-H印1細胞經不同濃度的Na3V04 (100 μ Μ, 250 μ Μ, 500 μ Μ, 1000 μ Μ)處理0· 5小時后， Dox誘導GADD45G表達4天，SA-β -gal染色檢測細胞衰老情況。圖IOB Tet-GADD45G Sk-H印1 細胞經不同濃度的 Na3V04 (100 μ Μ, 250 μ Μ, 500 μ Μ, 1000 μ Μ)處理 0· 5 小時 后，Dox 誘導 GADD45G 表達 4 小時，Western blotting 檢測 p_Stat3(Tyr705)、Stat3、 p-Tyk2 (Tyrl054/1055)、Tyk2、p-Jak2 (Tyrl007/1008)、Jak2 及 GADD45G 的表達情況。
[0043] 圖11顯示了 Shp抑制劑介導GADD45G對JAK-Stat3通路的抑制。其中，圖IIA Dox 誘導 GADD45G 表達不同時間點后，Western blotting 檢測 p_Shp2 (Tyr580)、Shp2 及GADD45G表達情況。圖IlB Dox誘導GADD45G表達并用NSC-87877(10yM)處理4小 時后，Western blotting 檢測 p_Stat3 (Tyr705)、Stat3、p_Tyk2 (Tyrl054/1055)、Tyk2、 p-Jak2 (Tyrl007/1008)、Jak2 及 GADD45G 的表達情況。
[0044] 圖12顯示了敲除Shp2能夠抑制GADD45G介導的JAK-Stat3通路活性抑制。其 中，圖12A在Tet-GADD45G-Sk-H印1細胞中，siRNA干擾Shp2表達后，Dox誘導GADD45G表 達 4 小時，Western blotting 檢測 p_Stat3 (Tyr705)、Stat3、Shp2 及 GADD45G 的表達情況。 圖12B在Tet-GADD45G-Sk-H印1細胞中，siRNA干擾Shp2表達后，Dox誘導GADD45G表達4 天，SA-β -gal染色檢測細胞衰老情況。圖12C在Tet-GADD45G-Sk-H印1細胞中，siRNA干 擾Shp2表達后，Dox誘導GADD45G表達24小時，PI染色檢測細胞周期。（**P〈0. 01)
[0045] 圖13顯示了組成性活化Stat3能夠抑制GADD45G介導的細胞衰老和增殖抑 制。其中，圖13A Tet-GADD45G-Sk-H印1經轉導Ca-Stat3表達及對照質粒后，Dox誘導 GADD45G 表達 4 小時，Western blotting 檢測 p_Stat3(Tyr705)、Stat3 及 GADD45G 的表 達情況。圖13B Tet-GADD45G-Sk-H印1經轉導Ca-STAT3表達及對照質粒后，Dox誘導 GADD45G表達4天，SA-β-gal染色檢測細胞衰老情況。圖13C Tet-GADD45G-Sk-H印1經 轉導Ca-Stat3表達及對照質粒后，Dox誘導GADD45G表達4天，PI染色檢測細胞周期。圖 13D Tet-GADD45G-Sk-H印1經轉導Ca-Stat3表達及對照質粒后，Dox誘導GADD45G表達4 天，qRT-PCR檢測端粒酶hTERT的表達情況。（*P〈0. 05, **P〈0. 01)
[0046] 圖14顯示了組成性活化Stat3能夠在體內抵抗GADD45G介導的腫瘤生長抑制 作用。其中，圖14A穩定轉染Ca-Stat3或對照質粒的Tet-GADD45G-Sk-H印1皮下荷瘤， 經Dox誘導GADD45G的表達后腫瘤形成情況。圖14B穩定轉染Ca-Stat3或對照質粒的 Tet-GADD45G-Sk-H印1皮下荷瘤，經Dox誘導GADD45G的表達后腫瘤生長狀況。圖14C各組 荷瘤組織的H&E染色及免疫組化檢測各組荷瘤組織的p-Stat3、Ki-67的表達情況。（X400)

【具體實施方式】
[0047] 本發明人經過長期而深入的研究，意外地發現了 GADD45G基因對腫瘤細胞尤其是 肝癌細胞的抑制作用是通過誘導腫瘤細胞的衰老而得到的。促進GADD45G基因的表達和/ 或活性有助于誘導腫瘤細胞的衰老，從而抑制腫瘤細胞的生長。此外，本發明人還發現了 GADD45G基因通過shp2介導的JAK-STAT3通路的抑制，從而誘導腫瘤細胞的衰老。在此基 礎上，完成了本發明。
[0048] GADD45G
[0049] GADD45家族蛋白能夠誘導細胞的凋亡，控制細胞的命運。近年來的研究表明， GADD45家族GADD45A、GADD45B和GADD45G雖然蛋白同源性較高，但是功能仍然不近相同。
[0050] 在肝癌細胞H印G2中，體外實驗表明GADD45家族蛋白皆能抑制細胞增殖，提示其 作為抑癌基因在發生發展中起較為重要作用。
[0051] GADD45G在多種腫瘤中表達下調，機制涉及啟動子甲基化或轉錄后修飾改變。 GADD45G表達的下調與多種腫瘤發生發展密切相關，被認為是一潛在的抑癌基因。
[0052] 但是，目前GADD45G對肝癌的生物學效應以及其中的作用機制仍然不完全清楚。 本研究通過實驗發現,GADD45G對腫瘤的抑制作用是通過對腫瘤細胞衰老的誘導而完成的， 旨在探討GADD45G對肝癌細胞生長的影響及其體內、外生物學效應和相關機制。
[0053] 在本發明中，術語"本發明蛋白"、"本發明多肽"、"GADD45G蛋白"、"GADD45G多肽" 可互換使用，都指具有人蛋白GADD45G氨基酸序列的蛋白或多肽。應理解，所述術語還包括 GADD45G的活性片段和衍生物。
[0054] 在本發明中，術語"本發明基因"、"本發明多核苷酸"指編碼GADD45G蛋白或 其活性片段和衍生物的核苷酸序列，包括正義和反義核酸。人GADD45G基因位于染 色體9q22. I_q22. 2 ;其編碼序列長度為480bp。GADD45G基因的核酸序列如SEQ ID N0.:l(Genbank ID:NM_006705.3，CDS:lll-590)所示，Gene ID:10912,其編碼的蛋白序列 如 SEQ ID NO. :2,（Genbank ID:NP_006696. 1)所示：
[0055] 如本文所用，術語"分離的"是指物質從其原始環境中分離出來（如果是天然的物 質，原始環境即是天然環境）。如活體細胞內的天然狀態下的多核苷酸和多肽是沒有分離純 化的，但同樣的多核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化 的。
[0056] 如本文所用，"分離的GADD45G蛋白或多肽"是指GADD45G蛋白基本上不含天然與 其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術 純化GADD45G蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產生單一的主帶。在本 發明中，GADD45G蛋白包括融合蛋白和非融合蛋白。
[0057] 本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多 肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
[0058] 本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA 或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。
[0059] 編碼GADD45G的成熟多肽的多核苷酸包括：只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多 肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列（和任選的附加編碼序列）以及 非編碼序列。術語"編碼多肽的多核苷酸"可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還 包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
[0060] 本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的氨基酸序列的多 肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或 非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本 領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、 缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼多肽的功能。
[0061] 本發明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段，包括正義和反義的核酸片段。如本 文所用，"核酸片段"的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個 核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術（如PCR)以確定 和/或分離編碼GADD45G蛋白的多核苷酸。
[0062] 本發明的人GADD45G核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或 人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據已公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱 讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所制備的 cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增， 然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
[0063] 一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將 其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。 [0064] 此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通 過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
[0065] 應用PCR技術擴增DNA/RNA的方法被優選用于獲得本發明的基因。用于PCR的引 物可根據本文所公開的本發明的序列信息適當地選擇，并可用常規方法合成。可用常規方 法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
[0066] 本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，以及用本發明的載體或GADD45G蛋 白編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述多肽的方法。
[0067] 通過常規的重組DNA技術，可利用本發明的多核苷酸序列可用來表達或生產重組 的GADD45G蛋白。一般來說有以下步驟：
[0068] (1).用本發明的編碼人GADD45G蛋白的多核苷酸（或變異體），或用含有該多核 苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；
[0069] (2).在合適的培養基中培養的宿主細胞；
[0070] (3).從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。
[0071 ] 本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含人GADD45G編碼DNA序列和合適的轉 錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組 技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。表 達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
[0072] 此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的 宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋 白（GFP)，或用于大腸桿菌的四環素或氨芐青霉素抗性。
[0073] 包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化適 當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
[0074] 宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高 等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌屬的細菌細胞；真菌細胞 如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、C0S、或293細胞的動物細胞等。
[0075] 用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原 核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期后收獲，用CaCl 2法處理， 所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的 方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法：磷酸鈣共沉淀法，常規機械方 法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。
[0076] 獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用 的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適于宿主細胞生長的條件下 進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的方法（如溫度轉換或化學誘導） 誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
[0077] 在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如 果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這 些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于：常規的復性處理、用 蛋白沉淀劑處理（鹽析方法）、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析（凝膠過濾）、 吸附層析、離子交換層析、高效液相層析（HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結 合。
[0078] JAK-STAT3
[0079] JAK-STAT信號通路主要參與細胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調節等多個重要的 生物學過程。它主要由三個成員組成，即酪氨酸激酶相關受體、酪氨酸激酶JAK和轉錄因子 STAT。
[0080] 其中，JAK是一類非跨膜型酪氨酸激酶，其蛋白家族共包括4個成員：JAKl、JAK2、 JAK3以及Tyk2。STAT則被稱為"信號轉導子和轉錄激活子"，即其同時具有信號轉導及轉 錄激活的重要作用。目前已發現六個STAT家族成員，即STAT1-STAT6。
[0081] 促進劑和藥物組合物
[0082] 利用本發明蛋白，通過各種常規篩選方法，可篩選出與GADD45G蛋白發生相互作 用的物質，尤其是促進劑等。
[0083] 本發明GADD45G蛋白的促進劑，當在治療上進行施用（給藥）時，可促進GADD45G 蛋白的表達和/或活性，進而誘導腫瘤細胞的衰老。在另一優選例中，所述的GADD45G促進 劑包括的GADD45G基因表達產物、促進型miRNA、促進型轉錄調控因子、或促進型靶向小分 子化合物。一種優選的GADD45G促進劑為MG-132。
[0084] 通常，可將這些促進劑配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中， 其中pH通常約為5-8,較佳地pH約為6-8,盡管pH值可隨被配制物質的性質以及待治療的 病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括（但并不限 于）：瘤內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、皮內、或局部給藥。
[0085] 本發明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發明GADD45G蛋白或其 促進劑以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括（但并不限于）：鹽水、緩沖液、 葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可 以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行 制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規方法進行制備。藥物組合物如針劑、 溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微 克-10毫克/千克體重。
[0086] 篩選藥物的方法
[0087] 本發明還提供了一種篩選制備誘導腫瘤細胞衰老的候選化合物的方法，包括步 驟：
[0088] (a)在測試組中，向細胞培養體系添加測試化合物，并觀察測試組中所述細胞 GADD45G的表達量和/或活性；在對照組中，向相同的培養體系不添加測試化合物，并觀察 對照組中所述細胞的GADD45G的表達量和/或活性；
[0089] 其中，如果測試組中的GADD45G的表達量和/或活性大于對照組，則說明該化合物 是對GADD45G有促進作用的用于誘導腫瘤細胞衰老的候選化合物。
[0090] 本發明篩選藥物的方法還包括：
[0091] (b)對（a)中獲得的候選化合物，還進一步測試其對JAK-STAT3的抑制作用。
[0092] 在另一優選例中，步驟（b)中還包括：在測試組中，向腫瘤細胞培養體系添加測試 化合物，并觀察所述的腫瘤細胞的生長情況和/或細胞量；在對照組中，向相同培養體系不 添加測試化合物，并觀察所述的腫瘤細胞的生長情況和/或細胞量；
[0093] 其中，若測試組中衰老的細胞比例顯著大于對照組，和/或若測試組中的細胞量 顯著少于對照組，則說明，該化合物是用于誘導腫瘤細胞衰老的候選化合物。
[0094] 通用方法
[0095] I. 1 材料
[0096] 人肝癌細胞株H印3B、PLC/PRF/5、SK-H印1、SUN475以及THLE-2人正常肝細胞株 (CRL-2706)來自ATCC，人肝癌細胞株HuH-7購自日本Riken，人肝癌細胞株SMMC-7721購 自中科院細胞庫，人肝癌細胞株HCC-LM3、MHC-97H購自中山醫院肝癌研究所，LPC-H-Ras V12小鼠肝腫瘤細胞（CCTCC N0:C2010115)。pTRIPZ Tet-on表達質粒來自Thermo公司，其 中 pTRIPZ-Con (空載）載體中，紅色突光蛋白（Turbo Red Fluorescent protein，tRFP)能 夠被強力霉素誘導表達；cFUGW-Ca-Stat3及pT/CMV-SV40-LgT質粒均購自Addgene公司。 細胞培養液 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)、DMEM:F12 (1:1)以及胎牛血清 (fetal bovine serum，FBS)購自美國HyClone公司。噻唑蘭（Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide, MTT)、碘化丙陡（Propidium Iodide, PI)、7_氨基放線菌素 D(7_Aminoactinomycin D, 7-AAD)、強力霉素（doxycycline, Dox)、噪呤霉素和Na3VO4購自美國sigma公司； NCS-87877購自德國Merck公司。質粒小抽提試劑盒和膠回收試劑盒購自德國QIAGEN公 司；LipofetAMINE 2000, optiDMEM 和總 RNA 提取試劑 TRIzol 購自美國 Invitrogen 公司； 限制性內切酶，T4連接酶，高保真酶PrimeStar?，RNA反轉試劑盒PrimeScript? RT Kit 和以 SYBY Green 為染料用于實時熒光定量 PCR (Quantitative real-time PCR，qRT-PCR) 的 SYBR Premix Ex Taq? 試劑盒購自大連 TaKaRa。APC(allophycocyanin)_Annexin V 抗 體購于美國eBioscience公司。細胞衰老染色試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司。 兔抗人GADD45G多克隆抗體、兔抗人Rb多克隆抗體、兔抗人p53單克隆抗體、鼠抗人p21/ ⑶KNlA單克隆抗體、兔抗人p27多克隆抗體、鼠抗人a -Tubulin單克隆抗體、兔抗人pl6 多克隆抗體、兔抗人Tyk2多克隆抗體和兔抗人Shp2多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公 司；兔抗人￥托4多克隆抗體、兔抗人燈-67多克隆抗體、兔抗人？-允1^2〇>1' 1°°7/1°°8)多克 隆抗體和兔抗人Jak2多克隆抗體購自美國Epitomics公司；兔抗人p-Stat3 (Tyr7°5)多克 隆抗體、兔抗人p-Tyk2(T yr1(l54/1°55)多克隆抗體、兔抗人p-Shp2(Tyr 58°)多克隆抗體和鼠抗 人Stat3單克隆抗體購于美國Cell Signaling Technology公司。肝癌芯片及組織樣本 HLiv-HCC150CS-01 75對，150點肝癌芯片購于上海芯超公司；其余45對肝癌及癌旁組織樣 本來源于江蘇省啟東市肝癌防治研究所，用于RNA的提取以及蛋白檢測。本實驗所用BALB/ c雄性裸鼠，6周齡，體重20g左右，皆購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，飼養于華東 師范大學動物房。
[0097] I. 2GADD45G真核表達質粒的構建
[0098] 從GenBank中檢索獲得人源GADD45G的編碼序列，取其上、下游序列各約20bp為 引物，同時在引物兩端引入限制性內切酶AgeI和EcoRI (上游引物SEQ ID NO. :3:5'-CG GACCGGTGCCACCATGACTCTGGAAGAAGTCCG-3'；下游引物 SEQ ID N0.:4:5'-GCCGAATTCTCACT CGGGGAGGGTGATGCTGGGC-3'）。提取THLE-2細胞(人肝永生化細胞）的mRNA，然后逆轉錄得 到全基因組cDNA，以此為模板，做PCR擴增反應：98°C預變性30s ;98°C 10s，60°C 15s， 72°〇458共30個循環；最后721：延伸51^11。擴增產物行1.2%瓊脂糖凝膠電泳后回收 目的片段。PCR產物目的片段經膠回收后，與pTRIPZ載體一并用限制性內切酶AgeI和 EcoRI進行雙酶切反應，4h后再次瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，得到產物行酶連反應，反 應體系為 pTRIPZ0.5yL (含 300ng DNA)，外源 DNA 插入片段 4.5yL (含 400ng DNA)和 Solution I 5yL，16°C水浴中過夜連接，然后轉化大埃希菌Stble3,均勻涂于含氨節青霉 素 （amp i c i 11 in, Amp)的LB平板上，37 °C培養過夜。挑取陽性菌落，加入含有Amp抗性的LB 液體培養液中，37°C，275r / min搖菌15h，提取質粒后再酶切鑒定，后送至上海英駿生物有 限公司測序，將測序正確的克隆采用無內毒素質粒提取試劑盒抽提質粒，存放于-20°C冰箱 中保存。
[0099] 1. 3病毒制備和細胞感染
[0100] 接種細胞數約為3. 5X IO5個/孔(使用不加抗生素的培養基）的慢病毒包裝293T 細胞于6孔板中，24h培養后將載體質粒pTRIPZ-Con (空載)和pTRIPZ-GADD45G (含目的基 因載體）分別與輔助質粒PSPAX2及pMD2G(共4μ g ;質量比，載體：psPAX2 :pMD2G=3:2:1) 相互混合，加入 250 μ L optiDMEM 里，然后將 10 μ L LipofetAMINE 2000 亦放入 250 μ L optiDMEM中，靜置3min，混合，室溫放置30?40min，使表達質粒與脂質體充分混勻，隨后將 混合液加至293T細胞中。48h后，收取含有病毒的上清，500 X g離心5min，0. 45 μ m的濾網 過濾。將處于對數生長期的待感染的目的細胞鋪至24孔板，細胞密度為30%，貼壁培養24h 后準備感染。在病毒上清液中，加入凝聚胺（polybrene;終質量濃度為8yg/mL)，混勻后， 加入待感染細胞中（每孔300 μ L，），重復感染2次，每次12?16h，采用終濃度為5 μ g/mL 的嘌呤霉素篩選病毒感染后的目的細胞1周，獲得穩定轉染質粒的細胞系。
[0101] I. 4BrdU法檢測細胞增殖
[0102] 6孔板中接種滿度為30%?40%目的細胞，過夜后去上清液，換條件培養基，處理 72h后按照BrdU流式檢測試劑盒（BD公司）說明書進行BrdU摻入及流式檢測。
[0103] I. 5MTT法檢測細胞增殖
[0104] 取對數生長期的目的細胞，按I X IO4個/mL的密度200 μ L每孔接種于96孔板。 過夜后，去上清液，換含有0. 5 μ g/mL Dox和10%FBS的DMEM處理細胞72h后于每孔中加入 MTT溶液20 μ L (5ng / mL)，37°C條件下培養3h，棄去上清液，每孔加入DMS0150 μ L，混勻， 利用分光光度計于540nm波長處測定各孔吸光度（D)值。
[0105] 1.6細胞凋亡檢測
[0106] 6孔板中接種滿度為30%?40%目的細胞，過夜后去上清液，換條件培養姐，處 理72h后用胰酶消化，經PBS沖洗后，500Xg離心收集細胞，以ImL染色緩沖液（binding buffer)懸浮細胞，并移人流式管中，再500Xg離心收集細胞，以100 μ L染色緩沖液懸浮 并移人流式管中避光加入2. 5 μ LAPC-Annexin V以及0. 1 μ L7-AAD，混勻反應30min，補充 100?200 μ L染色緩沖液，上流式細胞儀（FACSCalibur?流式細胞儀，Becton Dickinson) 檢測細胞凋亡。
[0107] 1.7細胞周期檢測
[0108] 取對數生長期的目的細胞，按5 X IO4個/mL的密度2mL每孔接種于6孔板中。過 夜后去除上清液，細胞換條件培養基培養96h后用胰酶消化，經PBS沖洗后，500Xg離心 5min收集細胞。除上清液，加預冷的70%乙醇重懸細胞，于-20° C長期固定。待細胞染色 時，500 Xg離心5min收集細胞，用ImL的PBS洗細胞一次，加入IOOyL含PI (50yg/mL) 和RNase A (100 μ g/mL)的PBS重懸細胞，室溫避光孵育30min。在加入200 μ L PBS后，上 流式細胞儀檢測細胞檢測周期。
[0109] 1. 8衰老相關半乳糖苷酶染色
[0110] 6孔板中接種滿度為30%?40%目的細胞，過夜后去上清液，換條件培養基培養細 胞，72h后，用PBS洗滌2次，染色固定液固定15min，再用PBS洗滌3次，加入衰老相關半乳 糖苷酶染色（senescence-associated beta-galactosidase，SA-β-gal)染色液 lmL，37°C 條件下隔絕CO2染色過夜后于倒置顯微鏡（Zeiss)明場觀察。
[0111] I. 9qRT-PCR檢測目的基因 mRNA的表達
[0112] 利用TRIzol試劑提取目的細胞總RNA，逆轉錄mRNA得到cDNA。IL-8上游引物：5 ，-ACCACCGGAAGGAACCATCTCAC-3'（SEQ ID NO. :5)，下游引物：5'-AGCACTCCTTGGCMAACTGCAC -3'（SEQ ID NO. :6) ;IL-6 上游引物：5'-GAGAGTAGTGAGGAACAAGCCAGA-3'（SEQ ID NO. :7)， 下游引物：5' -GTTGGGTCAGGGGTGGTTATT-3'（SEQ ID NO. :8) ;GADD45G 上游引物：5' -GTCTA CGGAGTCAGCCAAAGTC-3'（SEQIDN0·:9)，下游引物：5'-AAAGCCTGGATCAGCGTAAAAT-3'（SEQ ID NO. :10) ;hTERT 上游引物：5'-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3'（SEQ ID NO. :11)，下游引物： 5' -GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3'（SEQ ID NO. :12);內參照 GAPDH 上游引物：5' -CATGAGAAGT ATGACAACAGCCT-3'（SEQIDN0·:13)，下游引物：5'-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3'（SEQID NO. : 14)(引物均由上海英駿生物技術有限公司合成）。然后采用SYBR方法，按SYBR Premix Ex Taq? 試劑盒的要求在 Real-time7300PCR 儀（ABI7300，Applied Biosystem)上進行 PCR 擴增。結果采用相對定量法比較mRNA的表達差異，利用Ct值計算，以表示目的基 因 mRNA的相對表達量，Λ ACt = (Ct目的基因一Ct GAPDH)實驗組一（Ct目的基因一Ct GATOH)對照組。
[0113] 1. 10蛋白質印跡法檢測哀老相關蛋白的表達
[0114] 收取目的細胞，冰冷PBSlmL洗滌2次，加適量的蛋白裂解液，冰上裂解細胞lh，其 中每隔20min吹打一次，然后12000 X g4°C離心30min，上清即為裂解所得蛋白，每孔上樣總 蛋白50 μ g，經12%的SDS-PAGE電泳分離后轉移至醋酸纖維膜，轉膜90min后，用5%的BSA 封閉60min，加入1:1000稀釋的一抗，4°C過夜；TBST緩沖液充分漂洗后加入I :5000稀釋 的HRP標記的羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗，室溫反應2h，TBST洗膜3次，增強型化學發光試 劑（ECL)顯色，由ChemiDoc?XRS成像系統（Bio-Rad)獲取條帶圖像。
[0115] 1.11克隆形成實驗
[0116] 取對數生長期的目的細胞，按IX IO3個/mL、0. 5X IO3個/mL和0. 5X IO3個/mL密 度2mL每孔接種于35mm皿中，鋪板均勻。24小時貼壁后各組分別給予或不給予Dox處理。 每3d換一次培養液，培養7d后去除細胞培養液，PBS洗兩次。甲醛固定30min，用自來水洗 5min后利用結晶紫染色lh，再次用自來水洗去背景，過夜晾干后于掃描儀掃描。
[0117] I. 12RNA 干擾
[0118] 取對數生長期的目的細胞，按5X104個/mL的密度2mL每孔接種于6孔板中。24h 后去除上清液，換為ImL DMEM培養基培養lh。準備兩個已加入250yLopti-DMEMRNase Freel. 5mL EP管，一管加入終濃度為IOOpM的目標siRNA，另一管加入5μ L的脂質體 LipofectamineTM2000,室溫靜置5min。充分混勻后，室溫靜置45min。將500 μ L轉染混 合物均勻滴加到細胞培養孔中，前后移動培養皿，混合均勻。6 h后去除上清液換成完全 DMffl培養基。p21特異siRNA隨機混合物(貨號:EHU003861). p27特異siRNA混合物(貨 號:EHU025821). p53特異siRNA混合物(貨號:EHU123221)、Rb特異siRNA混合物(貨 號:EHU023531)購自 Sigma 公司、Shp2_l 特異 siRNA (貨號：SASI_Hs02_00334550)及 Shp2-3 特異 siRNA (貨號：SASI_Hs02_00334551)均購自 Sigma 公司；pl6 特異 siRNA 序列 為CGCACCGCCTAGTTACGGT，由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。
[0119] 1.13荷瘤實驗
[0120] 實驗一：過表達GADD45G皮下荷瘤情況
[0121] 每只BalB/C裸鼠右下側腿周皮下接種含5X IO6個導入不同質粒的SK-H印1細胞 的200 μ L PBS (每組10只）。每組又隨機分為兩組，一組給予含2 μ g/mL Dox的水，另一組 正常給水。觀察50d，每隔3d觀察一次腫瘤大小。
[0122] 實驗二：過表達組成性活化的Stat3對GADD45G細胞成瘤影響
[0123] 每只BalB/C裸鼠右下側腿周皮下接種含6X IO6個導入不同質粒的SK-H印1細胞 的200 μ L PBS (每組16只）。每組又隨機分為兩組，一組給予含2 μ g/mL Dox的水，另一組 正常給水。觀察50d，每隔3d觀察一次腫瘤大小。
[0124] 1.14 免疫組化（IHC)
[0125] 取新鮮的腫瘤組織放入4%福爾馬林（PFA)中，室溫24h后于4°C保存。按照常規 石蠟包埋的方法進行包埋、切片（4 μ m厚)、烤片、脫蠟。然后將貼有切片的載玻片放入PH=6 的0. OlM的檸檬酸緩沖液中，微波爐中火加熱lOmin，再用大火加熱IOmin冷卻至室溫。于 蒸饋水中處理一次，5min。在放入3%H 202，10min。蒸饋水中處理一次，5min，再用PBS洗二 次。小心去除液體，用10%TBST配置的BSA封閉，lh。加入適量比例的一抗，4°C過夜，PBS洗 三次，再加入辣根過氧化物酶標記的二抗，37°C孵育lh，PBS洗三次。DAB顯色，自來水沖洗 3min后，蘇木素染色2min，自來水沖洗15min。中性樹膠封片。于正置顯微鏡下觀察分析。
[0126] 本發明的有益效果
[0127] 1.本發明應激蛋白GADD45G基因或其表達產物可誘導腫瘤細胞衰老，可用于抑制 腫瘤細胞尤其是肝癌細胞的生長或增殖。
[0128] 2. GADD45G基因或其表達產物通過JAK-STAT3通路誘導細胞衰老，而非通過常規 細胞衰老途徑。
[0129] 3.通過上調Shp2抑制JAK-STAT3通路是誘導細胞衰老的關鍵因素。
[0130] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本 發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照 常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否 則百分比和份數是重量百分比和重量份數。
[0131] 實施例1GADD45G基因在肝癌與其癌旁組織之間表達比較，及其表達與臨床病理 評分之間的關系
[0132] I. 1檢測了 8個肝癌細胞系中GADD45G的表達情況，以SV-40轉化的永生化正常肝 細胞系THLE-2的GADD45G表達為參照。
[0133] 結果顯示，8個肝癌細胞系中GADD45G的轉錄水平均明顯低于THLE-2細胞系（圖 1A，Ρ〈0· 05)。
[0134] 1.2以DEN藥物誘導小鼠肝細胞性腫瘤作為模型，分別提取小鼠肝癌及癌旁組織 RNA，GADD45G轉錄水平亦是在肝癌中顯著下降（圖1Β，Ρ〈0. 05)。分別提取了 45對以及12 對人肝癌和癌旁組織的RNA和蛋白，發現在人肝癌中GADD45G轉錄（圖1C，Ρ〈0. 001)和蛋白 水平顯著低于癌旁組織（圖1D)。
[0135] 1. 3分析GADD45G的表達是否與臨床病理評分相關
[0136] 經過分析發現GADD45G的表達與性別，年齡以及腫瘤大小沒有統計學的差異(表 1)。
[0137] 表1組織芯片中GADD45G表達情況一覽表
[0138]

【權利要求】
1. 一種GADD45G基因、蛋白或其促進劑的用途，其特征在于，用于制備誘導腫瘤細胞衰 老的藥物組合物。
2. 如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的GADD45G來自哺乳動物。
3. 如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的GADD45G基因、蛋白或其促進劑包括 的GADD45G基因表達產物、促進型miRNA、促進型轉錄調控因子、或促進型靶向小分子化合 物。
4. 如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的藥物組合物包括所述GADD45G基因、 蛋白或其促進劑以及藥學上可接受的載體。
5. -種用于誘導腫瘤細胞衰老的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物包括 GADD45G基因、蛋白或其促進劑以及藥學上可接受的鹽。
6. -種篩選制備誘導腫瘤細胞衰老的候選化合物的方法，其特征在于，包括步驟： (a) 在測試組中，向細胞培養體系添加測試化合物，并觀察測試組中所述細胞GADD45G 的表達量和/或活性；在對照組中，向相同的培養體系不添加測試化合物，并觀察對照組中 所述細胞的GADD45G的表達量和/或活性； 其中，如果測試組中的GADD45G的表達量和/或活性大于對照組，則說明該化合物是對 GADD45G有促進作用的用于誘導腫瘤細胞衰老的候選化合物。
7. 如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的步驟還包括： (b) 對（a)中獲得的候選化合物，還進一步測試其對JAK-STAT3的抑制作用。
8. -種JAK-STAT3抑制劑的用途，其特征在于，用于制備誘導腫瘤細胞衰老的藥物組 合物。
9. 如權利要求8所述的用途，其特征在于，所述的JAK-STAT3抑制劑包括GADD45G基 因、蛋白或其促進劑和/或shP2基因、蛋白或其促進劑。
10. -種體外非治療性的誘導腫瘤細胞衰老的方法，其特征在于，向細胞培養體系中加 入GADD45G基因、蛋白或其促進劑，從而誘導腫瘤細胞的衰老。
【文檔編號】A61K38/19GK104225621SQ201310242123
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年6月18日 優先權日:2013年6月18日
【發明者】劉永忠, 楊兆娟, 張力, 馬愛輝 申請人:上海市腫瘤研究所