專利名稱：：elF－5A同工型:衰老－誘導elF－5A；損傷－誘導elF－5A；生長elF－5A和DHS的制作方法
技術領域：
：本發明涉及以下內容真核起始因子5A(“eIF-5A”)的獨特的同工型、編碼eIF-5A的多核苷酸、脫氧羥丁賴氨酸(hypusine)合酶(“DHS”)、編碼DHS的多核苷酸，以及eIF-5A同工型和DHS的的表達調節方法。現有技術描述衰老是一個植物體生命過程中的末期。它預示死亡并且發生于生物體組織的各個水平上，包括整個植物、器官、花、果實、組織和單個細胞。多種體內體外因子都可誘導衰老起始。衰老是植物體生命中或植物組織(如果實、花、葉)的一個復雜、高度受控的發育階段。衰老導致細胞膜和生物大分子的協同崩潰和隨之發生的代謝物向植物體其它部分的移動。除了在正常的植物體發育過程中發生的程序性衰老，細胞和組織的死亡及隨之發生的代謝物重定位也可以是由于外部，環境因子誘發的協同性反應。衰老也被稱為壞死或細胞程序性死亡，誘導衰老過早起始的外部因子包括環境應激(environmentalstress)如溫度、干旱、光照或營養缺乏，也包括病原體攻擊。受到環境應激作用的植物組織也產生乙烯，通常稱作應激乙烯(Buchanan-Wollaston，V.，1997，J.Exp.Botany，48181-189；Wright，M.，1974，Plant，12063-69)，已知在某些植物體中乙烯會引起衰老。衰老并不是一個被動過程，更準確的說是一個主動的受控過程，涉及特定基因的協同表達。在衰老過程中，總RNA量下降，許多基因的表達被關閉(Bate等1991，J.Exper.Botany，42，801-11；Hensel等1993，ThePlantCell，5，553-64)。但是，越來越多的證據表明衰老過程依賴于核基因的從頭轉錄。例如，除胞核作用、mRNA和蛋白合成的抑制劑可阻礙衰老。在對來自衰老葉和綠葉的mRNA體外翻譯的分子研究中發現，衰老葉的蛋白產物模式發生了變化(Thomas等1992，J.PlantPhysiol.，139，403-12)。使用差示篩選和扣除雜交技術，已從不同植物體中鑒別出許多代表衰老-誘導基因的cDNA克隆，包括單子葉植物和雙子葉植物，如擬南芥(Arabidopsis)、玉米、黃瓜、蘆筍、番茄、稻和馬鈴薯。鑒別出衰老過程中特異表達的基因有力證明了衰老的進行需要從頭轉錄。在壞死和死亡發生以前，衰老過程中發生的事件顯示出高度的協調以允許最大限度的使用細胞成分。一定存在復雜的相互作用來調節這個過程，包括對特異信號的感知和基因級聯表達的誘導。編碼衰老相關蛋白的基因表達很可能通過普通激活蛋白所調節，而激活蛋白依次直接或間接被激素信號活化。對這個過程的起始信號和隨后的協同作用的機制了解甚少。基因的協同表達需要轉錄和翻譯因子包括起始因子。不同生物包括植物的翻譯起始因子已被分離和鑒定。翻譯起始因子可控制mRNA移出細胞核的速率，控制mRNA結合到核糖體的速率，并且在某種程度上可影響特定mRNAs的穩定性(Zuk，etal.，EMBOJ.172914-2925(1998))。這樣一個并不是整體翻譯活性都需要的翻譯起始因子被確信為從胞核到胞質穿梭運輸特定mRNA亞群以利翻譯。Jao，等J.CellBiochem.86590-600，(2002)；Wang等JBiolChem27617541-17549(2001)；Rosoriusetal.J.CellSci.，112，2369-2380(1999)。這種翻譯因子稱為真核起始因子5A(eIF-5A)，它是已知的唯一一種含氨基酸羥丁賴氨酸的蛋白。Park，等JBiolChem26315264-15269(1988)。真核起始因子5A(eIF-5A)是一種基本蛋白因子，大小約為17kDa，參與真核細胞蛋白合成的起始作用。羥丁賴氨酸其特征在于存在羥丁賴氨酸，羥丁賴氨酸[N-(4-氨基-2-羥基丁基)賴氨酸]是一種獨特的修飾氨基酸，已知只存在于eIF-5A中。羥丁賴氨酸通過使多胺即亞精胺上的丁氨基基團轉移至eIF-5A中特定賴氨酸殘基的側鏈氨基上并進行羥化，從而翻譯后修飾形成羥丁賴氨酸。eIF-5A的激活包括使亞精胺上的丁氨基轉移至eIF-5A賴氨酸殘基上、形成羥丁賴氨酸并活化eIF-5A。在真核生物中，脫氧羥丁賴氨酸(DHS)合酶介導eIF-5A中羥丁賴氨酸的翻譯后形成。體外使用甲硫氨酰-嘌呤霉素實驗表明羥丁賴氨酸修飾對eIF-5A的活性是必需的。通過脫氧羥丁賴氨酸合酶(DHSEC1.1.1.249)和脫氧羥丁賴氨酸羥化酶(DHHEC1.14.99.29)對保守的賴氨酸殘基的轉化作用，羥丁賴氨酸翻譯后在eIF-5A上形成羥丁賴氨酸。DHS已從幾種植物中分離出，包括番茄(GenBankAccessionNumberAF296077)、擬南芥Arabidopsisthaliana)(AT-DHS；GenBankAccessionNumberAF296078)、煙草(Ober和Hartmann，1999)、康乃馨(GenBankAccessionNumberAF296079)和香蕉(GenBankAccessionNumberAF296080)，然而DHH基因仍未被識別。DHS將亞精胺的丁氨基轉移至eIF-5A的一個保守性賴氨酸殘基上4，將其轉化為脫氧羥丁賴氨酸。這個中間體形式的eIF-5A再被DHH羥化為羥丁賴氨酸。Park等Biol.Siganals6，115-123(1997)。體外eIF-5A脫氧羥丁賴氨酸型和羥丁賴氨酸型均可與mRNA結合。LiuPark等BiolSignals6166-174(1997)。盡管eIF-5A的功能并未被完全認識，但有證據表明它可調節細胞分裂(Park等Biol.Chem.276(20)17541-17549(2001)；Tome等BiolSignals6150-156，(1997))和衰老(Wang等JBiolChem276(20)17541-17549(2001))。也可見美國專利6,538,182和美國申請09/725,019，兩者的全部內容通過引用被結合至本文中。一些生物含有一種以上的eIF-5A同工型，這些同工型須滿足以下前提，即每種同工型都是特定組的mRNA的特異穿梭載體，而這些mRNA涉及諸如細胞分裂和衰老之類的過程。Wang等人證明番茄果實變軟及自然和應激誘導的葉衰老與DHSmRNA水平上升有關(Wang等JBiolChem276(20)17541-17549(2001))。此外，在轉基因番茄中引入一個組成性啟動子控制下的DHScDNA反義片段來抑制DHS表達時，果實變軟和酸敗的推遲證明了這些轉基因番茄的果實表現出明顯的衰老推遲。參見美國專利6,538,182和申請于2003年11月29日的美國申請09/725,019，其全部內容通過引用結合至本文中。既然已知DHS活化eIF-5A，這些數據顯示羥丁賴氨酸-修飾的eIF-5A(活性eIF-5A)可通過選擇性翻譯衰老所需mRNA來調節衰老。這一點通過在擬南芥(“AT”)中表達一個組成性啟動子控制下的全長或3’UTRcDNA的反義序列以減量調節DHS得到進一步證明。通過減量調節擬南芥DHS(“AT-DHS”)表達并減少其對eIF-5A活化的可用性，衰老被推遲了約2周(見美國專利6,538,182)。在這樣的轉基因植物里，不僅觀察到衰老被推遲，而且觀察到種子產量上升、對應激的耐受力上升和生物量產出上升，而且這里每種表型的程度由DHS表達減量調節的程度所決定。Southernblot(Wang等2001)和BLAST分析表明番茄和擬南芥基因組中僅含有一個拷貝的DHS基因，因而為了尋靶負責衰老轉錄物運出胞核的特異eIF-5A同工型，必須通過衰老-誘導eIF-5A的反義構建體(具3’UTR)或利用植物對一個過表達基因進行減量調節的天然能力(即通過利用正義(sense)多核苷酸來得到過量表達)來鑒定和特異減量調節衰老特異eIF-5A同工型。植物沒有免疫系統，因而具有一種獨特方法來應對病毒——這種方法稱為共抑制，這種方法可導致病毒RNA的序列特異性降解。當轉基因處于一個強組成型啟動子(如花椰菜鑲嵌病毒雙35S啟動子)控制下時，其對植物體來說表現為病毒的轉錄物，并發生序列特異性降解，但不僅僅是轉入的基因，相應內源基因也被降解。(見綜述，FagardandVaucheret，AnnualReview.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.，June；51167-194(2000))一些證據表明，對內源基因表達的減量調節來說共抑制作用的有效性，如不是更有效則與通過反義技術抑制表達的有效性相當。發明概述本發明提供真核起始因子5A(“eIF-5A”)同工型衰老-誘導eIF-5A，損傷-誘導eIF-5A和生長eIF-5A以及編碼這三種因子的多核苷酸。本發明提供這三種eIF-5A的反義多核苷酸，也提供包含這三種eIF-5A同工型的正義和反義多核苷酸的表達載體。本發明也涉及這些因子的表達調節(提高/增量-調節或抑制)的方法。本發明也涉及脫氧羥丁賴氨酸合酶(“DHS”)和其編碼多核苷酸。本發明提供DHS的反義多核苷酸，也提供包含DHS的正義和反義多核苷酸的表達載體。本發明也涉及DHS的表達調節(提高/增量-調節或抑制)的方法。附圖簡述圖1為擬南芥的三種eIF-5A同工型序列對比。行1為衰老-誘導eIF-5A(美國6;538;182和未決申請(pengdingapplication)09/725,019已有描述)；行2為損傷-誘導eIF-5A；行3為生長eIF-5A。圖2為擬南芥的三種eIF-5A同工型編碼區域序列對比。行1為衰老-誘導eIF-5A；行2為損傷-誘導eIF-5A；行3為生長eIF-5A。圖3為擬南芥的衰老-誘導eIF-5A的基因組基因序列。圖4為擬南芥的損傷-誘導eIF-5A的基因組基因序列。圖5為擬南芥的生長eIF-5A的基因組基因序列。圖6為雙載體pKYLX71-35S2圖譜。圖7為雙載體pGEM-TEasyVector圖譜。圖8為哥倫比亞生態型(Columbiaecotype)的擬南芥野生型植株不同組織中全部三種eIF-5A同工型的蛋白印跡雜交分析結果。圖9為哥倫比亞生態型(Columbiaecotype)的擬南芥野生型植株葉子感染72h后衰老-誘導eIF-5A和損傷-誘導eIF-5A的蛋白印跡雜交分析結果。圖10為哥倫比亞生態型(Columbiaecotype)的擬南芥野生型植株葉發生損傷72h后三種eIF-5A同工型的RNA印跡雜交分析結果。圖11描述了衰老-誘導AteIF-5A、損傷-誘導AteIF-5A、生長AteIF-5A的基因組DNA的PCR產物，分別為1、2、3號泳道。圖12為pGEM中的衰老-誘導AteIF-5A、損傷-誘導AteIF-5A、生長AteIF-5A基因組序列的瓊脂糖凝膠電泳結果。圖13為pKYLX71中的衰老-誘導AteIF-5A、損傷-誘導AteIF-5A、生長AteIF-5A基因組序列的瓊脂糖凝膠電泳結果。圖14是用含有正義損傷-誘導AteIF-5A的結構轉化的植株的T1平板照片。圖15為用正義損傷-誘導AteIF-5A轉化的T1植株在4周齡時的照片。圖16為用正義損傷-誘導AteIF-5A轉化的T1植株在5.5周齡時的照片。圖17為用正義損傷-誘導AteIF-5A轉化的T2植株在播種后10天的照片。圖18為用正義生長AteIF-5A轉化的T1植株在播種后10天的照片。圖19為用正義生長AteIF-5A轉化的T1植株在4周齡時的照片。圖20為用正義生長AteIF-5A轉化的T2植株品系的蛋白雜交印跡分析。圖21為用正義生長AteIF-5A轉化的T2植株(品系1A-1D)4周齡(上方)、5周齡(左下方)和6周齡(右下方)時的照片。圖22為用正義生長AteIF-5A轉化的T2植株(品系2A-1D)4周齡(上方)、5周齡(左下方)和6周齡(右下方)時的照片。圖23為用正義生長AteIF-5A轉化的T2植株(品系4A-D)4周齡(上方)、5周齡(左下方)和6周齡(右下方)時的照片。圖24為用正義生長AteIF-5A轉化的T2植株(品系15A-D)4周齡(上方)、5周齡(左下方)和6周齡(右下方)時的照片。圖25為用正義生長AteIF-5A轉化的T2植株(品系8A-D)4周齡(上方)、5周齡(左下方)和6周齡(右下方)時的照片。圖26為用正義生長AteIF-5A轉化的T2植株(品系9E-H)4周齡(上方)、5周齡(左下方)和6周齡(右下方)時的照片。圖27為用正義生長AteIF-5A轉化的T2植株(品系11A-D)4周齡(上方)、5周齡(左下方)和6周齡(右下方)時的照片。圖28為用正義生長AteIF-5A轉化的T2植株(品系16A-D)4周齡(上方)、5周齡(左下方)和6周齡(右下方)時的照片。圖29為擬南芥不同植株品系種子的照片，包括野生型對照和被正義生長AteIF-5A轉化的品系。圖30為用正義生長AteIF-5A轉化的亞品系種子的平均大小柱狀圖。圖31為用正義生長AteIF-5A轉化的亞品系單個種子大小柱狀32是顯示單個種子重量與單個種子體積間的比例關系的曲線圖。圖33為用正義生長AteIF-5A轉化的每個亞品系植株種子產量柱狀圖。圖34為正義生長AteIF-5A植株的表型概括。圖35為轉基因擬南芥植株(用反義全長衰老-誘導eIF-5A轉化)與野生型株對比。轉基因株表現出衰老推遲。圖36-38為用反義生長eIF-5A轉化的植株的照片。圖39為構建用以產生反義擬南芥3’DHS的載體時所用引物。圖40為載體構建體。圖41為分離自擬南芥的損傷因子eIF-5A序列，及其反義構建體的定位。圖42為載體構建體。圖43為與假單胞桿菌溫育的葉片盤(discs)的平板計數。圖44為反義轉基因植株對野生型株的CFU圖。圖45為得自番茄葉cDNA文庫的番茄葉DHScDNA序列(SEQIDNO1)和其相應的氨基酸序列(SEQIDNO2)。圖46為通過將番茄DHS基因序列與擬南芥基因庫中未鑒定序列(SEQIDNO5)對比得到的擬南芥DHS基因核苷酸序列。氨基酸間的間隙推測為內含子。圖46B為相應的擬南芥DHS氨基酸序列(SEQIDNO6)。圖46C為通過PCR得到的擬南芥DHScDNA的一個600堿基對的多核苷酸序列。圖46D為DHScDNA片段的相應氨基酸序列。圖47為相應的番茄葉DHS全長氨基酸序列(SEQIDNO2)、相應的擬南芥衰老-誘導DHS全長氨基酸序列，以及人、酵母、真菌、古生菌(Archaeobacteria)的DHS氨基酸序列對比。三或四個序列間的相同氨基酸用方框標出。圖48為番茄DHScDNA限制性酶切圖譜。圖49是以32P-dCTP標記的全長番茄DHScDNA為探針的，分離自番茄葉的基因組DNA的DNA雜交印跡分析結果。圖50為不同階段下分離自番茄花的RNA做RNA雜交印跡分析結果。頂部為總RNA的溴化乙錠染色凝膠電泳結果。每條帶含10μgRNA。底部是以32P-dCTP標記的全長番茄DHScDNA為探針的RNA雜交印跡的放射自顯影圖。圖51為不同成熟階段的番茄果實RNA的RNA雜交印跡分析結果，用32P-dCTP標記的全長番茄DHScDNA為探針。每條帶含10μgRNA。圖52為分離自2M山梨醇處理干旱應激下的番茄葉6h的RNA雜交印跡分析結果，每個帶含10μgRNA。印跡用32P-dCTP標記的全長番茄DHScDNA探測。圖53是分離自低溫處理的番茄葉的RNA雜交印跡分析結果。圖53A為總RNA的溴化乙錠染色凝膠電泳結果，每條帶含10μgRNA。圖53B是以32P-dCTP標記的全長番茄DHScDNA為探針的RNA雜交印跡放射自顯影圖。圖53C為通過葉滲出液電導率測量的相應分析滲漏數據。圖54為康乃馨DHS全長(1384bp)cDNA克隆核苷酸序列(SEQIDNO9)，不包括polyA尾和5’末端非編碼區域。核苷酸下方為相應氨基酸序列(373氨基酸殘基，SEQIDNO10)圖55是衰老中擬南芥葉的總RNA雜交印跡分析結果，32P-dCTP標記的全長擬南芥DHScDNA為探針。頂部為放射自顯影圖，底部為溴化乙錠染色凝膠圖。圖56是不同階段康乃馨花瓣總RNA雜交印跡分析結果，32P-dCTP標記的全長康乃馨DHScDNA為探針。頂部為放射自顯影圖，底部為溴化乙錠染色凝膠圖。圖57上方為番茄果實衰老-誘導eIF-5A基因序列(SEQIDNO11)，下方為相應氨基酸序列(SEQIDNO12)。圖58上方為康乃馨衰老-誘導eIF-5A基因序列(SEQIDNO13)，下方為相應氨基酸序列(SEQIDNO14)。圖59上方為擬南芥衰老-誘導eIF-5A基因序列(SEQIDNO15)，下方為相應氨基酸序列(SEQIDNO16)。圖60是擬南芥不同階段葉的總RNA雜交印跡分析結果，32P-dCTP標記的全長擬南芥DHScDNA和32P-dCTP標記的全長衰老-誘導eIF-5A基因為探針。頂部為放射自顯影圖，底部為溴化乙錠染色凝膠圖。圖61是分離自番茄果實的果實花端著色(breakerBK)，紅-硬(red-firmRF)和紅-軟(red-soft，RS)階段的總RNA雜交印跡分析結果，32P-dCTP標記的全長番茄DHScDNA和32P-dCTP標記的全長衰老-誘導eIF-5A基因為探針。伴隨果實成熟，DHS和eIF-5A含量在紅-硬階段平行上調。頂部為放射自顯影圖，底部為溴化乙錠染色凝膠圖。圖62為經山梨醇處理干旱應激的番茄葉總RNA雜交印跡分析結果。C為對照，S為經山梨醇處理的樣品。以32P-dCTP標記的全長番茄DHScDNA和32P-dCTP標記的全長衰老-誘導eIF-5A基因為探針作印跡。eIF-5A和DHS對干旱應激的反應是含量提高。頂部為放射自顯影圖，底部為溴化乙錠染色凝膠圖。圖63為番茄花蕾和開放并衰老中的花的總RNA雜交印跡分析結果，以32P-dCTP標記的全長番茄DHScDNA和32P-dCTP標記的全長衰老-誘導eIF-5A基因為探針作印跡。eIF-5A和DHS的含量在開放/衰老花中含量提高。頂部為放射自顯影圖，底部為溴化乙錠染色凝膠圖。圖64為寒害的番茄葉總RNA雜交印跡分析結果。以32P-dCTP標記的全長番茄DHScDNA和32P-dCTP標記的全長衰老-誘導eIF-5A基因為探針作印跡。eIF-5A和DHS在復溫期間隨寒害的發展而含量提高。頂部為放射自顯影圖，底部為溴化乙錠染色凝膠圖。圖65為3.1周齡的野生型擬南芥(左方)和反義方向表達DHS3’末端基因(序列見圖80)的轉基因株的照片，顯示轉基因株的葉比野生型大。圖66為4.6周齡的野生型擬南芥(左方)和反義方向表達DHS3’末端基因(序列見圖80)的轉基因株的照片，顯示轉基因株的葉比野生型大。圖67為5.6周齡的野生型擬南芥(左方)和反義方向表達DHS3’末端基因(序列見圖80)的轉基因株的照片，顯示轉基因株的葉比野生型大。圖68為6.1周齡的野生型擬南芥(左方)和反義方向表達DHS3’末端基因(序列見圖80)的轉基因株的照片，顯示轉基因株的外形比野生型大。圖69是反義方向表達DHS基因的三個轉基因擬南芥T1品系植株的種子產量增加的圖。以種子的體積來計量種子的產量。野生型株的SEn＝30。圖70為反義方向表達DHS3’末端基因(序列見圖80)的轉基因番茄植株(左方)和野生型株(右方)的照片，顯示轉基因株的葉和植株體都大于野生型株。照片攝于將植株幼苗移植至土中18天后。圖71為反義方向表達DHS3’末端基因(序列見圖36)的轉基因番茄植株(左方)和野生型株(右方)的照片，顯示轉基因株的葉和植株體都大于野生型株。照片攝于將植株幼苗移植至土中32天后。圖72-79為野生型番茄果實(頂部組)和反義方向表達全長DHS基因的轉基因番茄果實(底部組)的照片。果實在果實花端著色階段采集，在生長室里成熟。自采集起的時間(以天為單位)顯示于每組的左上角。圖80為擬南芥衰老-誘導DHS基因的3’末端核苷酸序列(SEQIDNO30，上方)和相應氨基酸序列(下方)，這個DNA片段被用來以反義方向轉化植株。圖81為番茄DHS基因的3’末端核苷酸序列(SEQIDNO31，上方)和相應氨基酸序列(下方)，這個DNA片段被用來以反義方向轉化植株。圖82為600bp擬南芥DHS探針的核苷酸序列(SEQIDNO26，上方)和相應氨基酸序列(下方)，該探針被用來分離全長擬南芥基因。圖83為483bp康乃馨DHS探針的核苷酸序列(SEQIDNO27，上方)和相應氨基酸序列(下方)，該探針被用來分離全長康乃馨基因。圖84(a)和(b)為以反義方向表達DHS3’末端基因(序列見圖81)的轉基因番茄果實(右方)和野生型果實(左方)的照片。野生型果實表現出花蒂腐(blossomendrot)，而轉基因果實則無。圖85為幾種植物的不同eIF-5A同工型序列對比，也顯示羥丁賴氨酸保守區域的對比。圖86為番茄衰老-誘導eIF-5A多核苷酸和氨基酸序列。圖87為擬南芥衰老-誘導eIF-5A和pKYLX71-正義衰老-誘導eIF-5A的結構。圖88為番茄衰老-誘導eIF-5A和pKYLX71-正義衰老-誘導eIF-5A的結構。圖89為擬南芥對照株和包含正義多核苷酸衰老-誘導eIF-5A的轉基因株的對比照片。轉基因株比對照株有更粗的開花莖。圖90和圖91為包含正義多核苷酸衰老-誘導eIF-5A的轉基因植株，(圖90為擬南芥，圖91為番茄)，轉基因株更發達的木質部表明轉基因株木質部產生作用增強。圖92為擬南芥對照植株和包含正義多核苷酸衰老-誘導eIF-5A的擬南芥轉基因株的對比，在擬南芥中使用一個番茄正義多核苷酸衰老-誘導eIF-5A。轉基因株有比對照株有更粗的開花莖。圖93和94兩個柱狀圖顯示包含正義多核苷酸衰老-誘導eIF-5A的轉基因植株有更高的木質部產生作用。圖94涉及番茄的正義多核苷酸衰老-誘導eIF-5A。圖95為油菜(canola)的生長eIF-5A氨基酸序列和多核苷酸序列。圖96為油菜的生長eIF-5A和pKYLX71-正義生長eIF-5A結構。圖97為油菜DHS氨基酸序列和多核苷酸序列。圖98為油菜DHS和pKYLX71-正義DHS結構。圖99的柱狀圖顯示在油菜里DHS的表達抑制提高了種子產量。圖100的柱狀圖，從左到右依次顯示擬南芥、油菜、番茄的生長同工型eIF-5A增量調節和番茄DHS的增量調節。圖101為番茄生長eIF-5A氨基酸和多核苷酸序列。圖102為番茄生長eIF-5A和pKYLX71-正義生長eIF-5A結構。圖103為番茄損傷-誘導eIF-5A氨基酸序列和多核苷酸序列。圖104a和b為番茄損傷-誘導eIF-5A和pKYLX71-正義番茄損傷-誘導eIF-5A結構。圖105為萵苣DHS多核苷酸的部分序列。圖106為pTA7001-3’UTR反義萵苣DHS構建體。圖107A和B為苜蓿DHS氨基酸和多核苷酸序列。圖108A和B為香蕉DHS氨基酸和多核苷酸序列。圖109A和B為三角葉楊(cottonwood)DHS氨基酸和多核苷酸序列。圖110為香蕉黑條葉斑病球腔菌(mycosphaerellafijiensis)部分DHS氨基酸和多核苷酸序列。發明詳述在這里，術語“植物”指完整植株、植株的一部分、植物細胞，或指植物細胞群。可適用本發明方法的植物類型不限定，包括如乙烯敏感型和乙烯不敏感型植物；產果型植物如杏樹、蘋果樹、橘樹、香蕉、葡萄、梨樹、番茄、草莓、鱷梨等；蔬菜如胡蘿卜、豌豆、萵苣、卷心菜、蕪菁、馬鈴薯、椰菜、蘆筍等；花卉類如康乃馨、玫瑰、菊花等；農作物如玉米、稻谷、大豆、苜蓿等；和林木類如落葉樹、針葉樹、常綠樹等；一般而言，任何可接受并表達本發明的DNA分子的植物都適用于本發明。也可包括不同倍體水平的植物，包括單倍體、雙倍體、四倍體和多倍體。所用的植物可以是單子葉或雙子葉植物。這里轉基因植物定義為經某種方法進行遺傳修飾的植株，包括但不限于將異源或同源衰老-誘導eIF-5A、損傷-誘導eIF-5A、生長eIF-5A或DHS的基因整合進基因組的植株。被改變的遺傳物質可編碼蛋白，也可含有一段調節或控制序列，或者其本身是或包含一段反義序列或正義序列，或編碼一段反義RNA或正義RNA且這些RNA是該植株的衰老-誘導eIF-5A、損傷-誘導eIF-5A、生長eIF-5A或DHSDNA或mRNA序列或是其部分片段的正義或反義序列。“轉基因”和“轉基因序列”定義為被整合到轉基因植物的外源基因或部分基因序列。這里用的術語“雜交”意指在合適的嚴格條件下進行的核酸雜交，其條件可由本領域技術人員根據探針序列和靶序列特性來方便的確定。雜交和洗脫條件為本領域熟知的，而且也可方便的根據所需嚴格性通過改變溫育時間，溫度和/或溶液離子強度來調節條件。例如可參見Sambrook，J.etal.，MolecularCloningALaboratoryManual，2ndedition，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，NewYork，1989。條件選擇要依據待雜交序列長度，特別是探針序列長度、核酸的相對G-C含量、允許的錯配量來進行。當需要兩條互補性較低的鏈進行部分雜交時，優選低嚴格性條件。當需要完全互補或近似完全互補時，優選高嚴格性條件。此處所說的高嚴格性所指如下雜交液含6×SSC、0.01MEDTA、1×Denhardt溶液和0.5％SDS。雜交在約68℃進行，當進行DNA克隆片段雜交時雜交時間約3-4h，當進行真核總DNA雜交時雜交時間約12-l6h。對較低嚴格性可降低雜交溫度至約42℃，低于雙鏈解鏈溫度(TM)。已知TM是G-C含量、雙鏈長度和溶液離子強度的函數。這里所用的術語“基本序列同一性”(sustantialsequenceidentity)或“基本同源性”(substantialhomology)是指一段多核苷酸序列或氨基酸序列與另一段多核苷酸序列或氨基酸序列的結構和/或功能基本上等同。具有基本序列同一性或基本同源性的序列間的任何結構或功能差異都是微小的，也就是說這些差異不會影響這些序列在所需應用中發揮期望作用的能力。例如，差異可能是由于不同種類生物在密碼子使用上的固有差別引起的。如果兩個或更多不同序列間有顯著量的序列重疊或相似性，或者即使有長度或結構不同但不同序列間表現出相似的物理特性，那么結構上的差異就被認為是微小的。這種物理特性包括如在限定條件下雜交的能力，或者對蛋白是免疫交叉反應能力或相似的酶活性等。這些特性中的每一種都可由本領域技術人員用本領域已知技術方便地確定。此外，如兩條多核苷酸序列至少有約70％，優選約80％，最優選約90％的相似性，則它們“基本互補”(substantialcomplementary)。如果兩條氨基酸序列在其多核苷酸的活性部分間至少有70％的相似性，則兩條氨基酸序列基本同源(substantialhomologous)。這里所用的短語“與(DNA或RNA分子的)相應部分雜交”意為參與雜交的一方分子如寡核苷酸、多核苷酸或任何核苷酸序列(正義或反義方向)識別并雜交到另一方核酸分子的一段序列上，而后者核酸分子具有約和前者相同的大小并且有足夠的相似性以影響合適條件下的雜交。例如，一段100核苷酸長的番茄損傷-誘導eIF-5A基因3’編碼或非編碼區域的反義序列，會識別并雜交到3’編碼或非編碼區域內一段約100核苷酸核酸部分上，后者可以是AT損傷-誘導eIF-5A基因或其它任何植物的損傷-誘導eIF-5A基因，只要兩條核酸分子有約70％或更高的相似性。要理解的是，“相應區域”可允許雜交發生一些錯配，因而“相應區域”可小于或大于雜交到其上的分子，如大于或小于20％-30％，優選大小差異不超過約12-15％。這里所用的術語，一個核酸(或多核苷酸)的“功能性衍生物”是指編碼衰老-誘導eIF-5A、損傷-誘導eIF-5A、生長eIF-5A或DHS的核苷酸序列或基因的一個片段、變異體、同源物或類似物。一個功能性衍生物至少保留了衰老-誘導eIF-5A、損傷-誘導eIF-5A、生長eIF-5或DHS的編碼DNA的部分功能，使其使用與本發明一致。這種功能可包括在高度嚴格條件下與分離的天然衰老-誘導eIF-5A、損傷-誘導eIF-5A、生長eIF-5或DHS基因進行雜交，或是與來自其它植物的基本同源DNA或其mRNA轉錄物進行雜交的能力，而這些衰老-誘導eIF-5A、損傷-誘導eIF-5A、生長eIF-5或DHS基因的反義序列抑制衰老-誘導eIF-5A、損傷-誘導eIF-5A、生長eIF-5或DHS的表達。基因或DNA序列的“片段”指這個核酸分子的任一亞組，如較短的多核苷酸或寡核苷酸。“變異體”指與整個基因或基因的一個片段基本相似的分子，如含有一個或多個取代核苷酸的核苷酸取代變異體，但仍保持了與特定基因雜交的能力或者編碼能夠與天然DNA雜交的mRNA轉錄物的能力。“同源物”指來自異屬或異種植物的片段或變異體序列。“類似物”指一個非天然的分子，它與整個分子、變異體或其片段具有基本相似或功能相關。“調節表達”指表達被抑制或增量調節。“抑制表達”指靶基因相應蛋白和/或mRNA缺失或含量水平可探測性下降，如抑制衰老-誘導eIF-5A、損傷-誘導eIF-5A、生長eIF-5或DHS。“增量調節”或”過度表達”指靶基因相應蛋白和/或mRNA含量水平可探測性上升，如衰老-誘導eIF-5A、損傷-誘導eIF-5A、生長eIF-5或DHS。本發明中的分離的多核苷酸包括那些從天然來源分離出的，重組產生的或人工合成的多核苷酸。本發明中的分離的肽包括那些從天然來源分離出的，重組產生的或人工合成的肽。本發明的分離蛋白包括以融合蛋白形式表達的衰老-誘導eIF-5A、損傷-誘導eIF-5A、生長eIF-5A或DHS，優選包含eIF-5A或DHS與麥芽糖結合蛋白融和的蛋白。本發明的衰老-誘導eIF-5A、損傷-誘導eIF-5A、生長eIF-5A或DHS肽的“功能性衍生物”包括衰老-誘導eIF-5A、損傷-誘導eIF-5A、生長eIF-5A或DHS的片段、變異體、類似物或化學衍生物，它們至少保持部分活性或者保持與eIF-5A同工型或DHS的特異抗體進行免疫交叉反應的能力。eIF-5A或DHS肽的片段指蛋白分子的任一亞組。變異體肽可通過直接化學合成得到，例如使用該領域的已知方法。eIF-5A或DHS肽的類似物是指與整個蛋白或其片段具有基本相似性的非天然蛋白。eIF-5A或DHS的化學衍生物含有附加的肽或肽片段非正常部分的化學組成部分。通過使用能與選定的側鏈或末端殘基進行反應的有機衍生劑將修飾引入到肽或其片段上的靶氨基酸殘基上。依照本發明，eIF-5A或DHS肽可通過培養由本發明的多核苷酸(以正義方向)轉化的細胞進行，根據克隆方案使細胞以游離或融合蛋白形式合成蛋白，再從細胞提取物或培養基中分離蛋白。或者，可在一個無細胞系統中生產蛋白。Ranu，等Meth.Enzymol.，60459-484，(1979)。質粒DNA的制備、限制性內切酶消化、DNA瓊脂糖凝膠電泳、蛋白質聚丙烯酰胺凝膠電泳、PCR、RT-PCR、DNA雜交印跡、RNA雜交印跡、DNA連接和細菌轉化這些操作按本領域已知的常規方法進行。參見如Sambrook，J.etal.，MolecularCloningALaboratoryManual，2ndedition，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，NewYork，1989。Sambrook公開了核酸的雜交技術。與本發明一致的構建重組核酸分子的程序參見，Sambrook，J.etal.，MolecularCloningALaboratoryManual，2ndedition，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，NewYork，1989.，和Maniatis，T.etal，MolecularmechanismintheControlofGeneexpression，eds.，Nierlich，etal，eds.，Acad.Press，N.Y.(1976)。后兩者通過引用完全結合到本文。與本發明一致的轉基因植物可通過任何本領域內已知的植物轉化方法進行DNA轉化來制備。植物轉化方法包括直接與根癌土壤菌(Agrobacteriumtumefaciens)共培養植株、組織或細胞，或直接感染(Miki，等Meth.inPlantMol.Biol.andBiotechnology，(1993))；直接將基因轉移入原生質體或原生質攝取(Paszkowski，etal.，EMBOJ.，122717(1984))；電穿孔(Fromm，等Nature，319719(1986))；微粒轟擊(Klein等BioTechnology，6559-563(1988))；注射進苗或植物的分生組織(DeLaPena，等Nature，325274-276(1987))；注射進培養細胞或組織的原生質體(Reich，等BioTechnology，41001-1004(1986))。通常從轉化過程得到一個完整植物。植物從原生質、愈傷組織、部分組織或移植體等中再生。從eIF-5A同工型或DHS表達被改變的再生轉基因植物得到的植物部分，如葉、花、果實、種子等都包含在這里所用的“植物”定義內。再生植物的后裔、變異體、突變體也包含在“植物”的定義內。eIF-5A總述本發明涉及三種不同亞型的eIF-5A衰老-誘導eIF-5A、損傷-誘導eIF-5A、生長eIF-5A。本發明提供分離自不同種植物的eIF-5A不同亞型及其分離方法。本發明也提供了編碼這些不同亞型的多核苷酸。本發明還提供了eIF-5A同工型的反義多核苷酸，以及包含這些多核苷酸和反義多核苷酸的表達載體。在一些實施方案中，提供通過使用包含eIF-5A同工型反義多核苷酸的表達載體轉化植物以抑制內源eIF-5As表達的方法。在一些實施方案中，提供通過使用eIF-5A同工型正義多核苷酸來增量調節內源eIF-5A的方法。自然狀態下，不同eIF-5A同工型根據植物生命階段或外部條件進行增量或減量調節。如在衰老組織中，衰老-誘導eIF-5A受到增量調節。衰老-誘導eIF-5A被認為通過將特定種類的mRNAs(涉及衰老途徑)穿梭運出胞核到胞質內進行翻譯從而參與植株或植物組織的進一步衰老。當減量調節或抑制衰老-誘導eIF-5A表達時，植株和/或組織的衰老被推遲。轉化/轉基因植物具有更大生物量產出、延長的果實貯藏時間、延長的花貯藏時間、種子變大、種子產量提高，證明了它們的衰老推遲。當植株和/或植物組織被暴露于損傷事件如低溫、脫水或機械損傷時，損傷-誘導eIF-5A受到增量調節。通過減量調節損傷-誘導eIF-5A，與未轉化株或野生型株相比，轉基因株有更強的對病原體入侵引起的致命損害的抵御能力。當植株處于生長期，生長eIF-5A受到增量調節。通過增量調節生長eIF-5A，使得轉基因株有更大的種子、更高的生物量產出及種子產量。圖1顯示了分離自擬南芥(“AT”)的三種eIF-5A同工型的對比。圖2顯示了這些同工型編碼區域的對比。圖3-5提供了這些同工型的基因組序列。蛋白質雜交印跡(見圖8)顯示這三種同工型在植物體生命不同階段的表達。圖8揭示當葉齡增長，衰老-誘導eIF-5A含量增加。而其在未開放花蕾、長角果或莖芽中觀察不到，但在吸漲(imbibed)種子中可觀察到。在吸漲種子中，有子葉組織和發育中的胚胎。因此衰老-誘導eIF-5A在吸漲種子里存在是由于當胚胎發育時子葉正在衰老。生長eIF-5A存在于吸漲種子的原因在于胚胎在活躍生長。損傷-誘導eIF-5A存在于長角果、種子、莖中的原因是采集這些部位時引起了損傷。盡管不同同工型間和來自不同種植物的同工型間有高度同源性(約85％)，但不同同工型的3’UTR區域不同。同工型間和不同種植物同工型間的一個高度保守區域確信為羥丁賴氨酸位點。羥丁賴氨酸位點確信為以下氨基酸5’-CKVVEVSTSKTGKHGHAKCHFV-3’(SEQIDNO＿)。圖85顯示不同eIF-5A同工型和幾種植物的對比。衰老-誘導eIF-5A衰老-誘導eIF-5A在衰老組織中表達。本發明涉及到在擬南芥、番茄和康乃馨中發現衰老-誘導eIF-5A。衰老-誘導eIF-5A在衰老組織中受增量調節，并且在植物和植物組織中涉及與形態變化相關的衰老誘導。抑制衰老-誘導eIF-5A在植株中的表達可改變衰老和衰老相關過程。可通過使用反義構建體或使用正義構建體以引起共抑制來進行減量調節。在轉基因植物中抑制衰老-誘導eIF-5A引起不同形態學變化，包括生物量提高、果實變軟或壞死推遲、花切片或植物組織如萵苣葉切段的褐變推遲、種子變大和種子產量提高。因此，本發明的一個實施方案是從擬南芥分離的衰老-誘導eIF-5A。氨基酸序列見圖59，(SEQIDNO＿)。其編碼該氨基酸的核苷酸序列見圖59，(SEQIDNO＿)。另一實施方案是從番茄分離的衰老-誘導eIF-5A。氨基酸序列見圖57和86，(SEQIDNO＿)。其編碼該氨基酸的核苷酸序列見圖57和86，(SEQIDNO＿)。還有一實施方案是從康乃馨分離的衰老-誘導eIF-5A。氨基酸序列見圖58，(SEQIDNO＿)。其編碼該氨基酸的核苷酸序列見圖58，(SEQIDNO＿)。本發明也提供分離的衰老-誘導eIF-5A多核苷酸，其與上述列舉的衰老-誘導eIF-5A編碼多核苷酸有90％同源性，并可在嚴格條件下與這些多核苷酸的互補序列或與其它編碼衰老-誘導eIF-5A的多核苷酸進行雜交。本發明也提供衰老-誘導eIF-5A的反義多核苷酸。這種反義多核苷酸可以為任何長度，只要它能夠抑制表達。在一些實施方案中，所用的反義多核苷酸包括全長編碼區，在另一些尤其優選的實施方案里，反義多核苷酸定位在3’UTR，因為不同的eIF-5A同工型在3’UTR有高度的差異。在一些實施方案里，反義多核苷酸會定位至5’非編碼區。已知與5’非編碼區基本互補的反義多核苷酸是轉錄因子編碼基因表達的有效抑制劑。Branch，M.A.，Molec.CellBiol.，134284-4290(1993)。這里及權利要求書所用的術語“衰老-誘導eIF-5A反義多核苷酸”不僅包括與上文所列舉多核苷酸的互補序列有100％同源性的反義多核苷酸，也包括那些反義多核苷酸功能變異體。功能變異體，不管來自天然或人工制備，與衰老-誘導eIF-5A相應部分至少有80％的同源性并且可在高度嚴格條件下與相應部分發生雜交。此外，變異體必須具有本發明需要的功能，也就是說，當將它們引入一個表達載體并且此載體被整合到至少一個植物細胞的基因組時，變異體能夠調節內源衰老-誘導eIF-5A的表達。本領域技術人員可利用這一特點，即在反義多核苷酸中進行非實質改變不會對反義多核苷酸結合至轉錄物并減少或抑制基因表達的能力產生有害的影響。因此，術語“反義多核苷酸”包括那些與轉錄物基本互補的序列和那些仍可特異結合轉錄物并抑制或減少基因表達的能力的反義序列。反義多核苷酸綜述見，Alberts，etal.，MolecularBiologyoftheCell，2nded，GarlandPubIishing，Inc.NewYork，1989(尤其是195-196頁，通過引用結合至本文)。本發明的一個實施方案提供包含衰老-誘導eIF-5A多核苷酸(本發明中如上述)或衰老-誘導eIF-5A反義多核苷酸(本發明中如上述)的表達載體。載體可以是質粒(優選)，或是病毒，或者是本領域內已知的用以在植物細胞或細菌細胞中復制并表達其上編碼基因的其它載體。載體被整合至染色體上，使得它可以被轉錄出所需的衰老-誘導eIF-5ARNA的反義多核苷酸。可用本領域的標準方法，重組DNA技術來構建這樣的質粒或病毒載體。例如，載體可以是含有可在原核宿主中發揮功能的復制系統和本發明的反義多核苷酸的質粒。或者，載體可以是含有可在土壤桿菌(Agrobacterium)中發揮功能的復制系統和本發明中的反義多核苷酸的質粒。可在土壤桿菌中復制的質粒在本領域內已得到充分認識。參見Miki，etal.，ProceduresforIntroducingForeignDNAIntoPlants，MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology，Eds.B.R.GlickandJ.E.Thompson.CRCPress(1993)，PP.67-63。此外載體包含有效連于所述多核苷酸的調節序列，以允許多核苷酸的表達。調節序列可包括在轉基因植物細胞中作用的啟動子。啟動子可以是誘導型、組成型或組織特異型。本領域技術人員了解這些啟動子。可有效與本發明的不同eIF-5A同工型和DHS組合并產生該基因的正義或反義轉錄物的啟動子調節元件總體上包括任何植物啟動子，更詳細的講，包括組成性啟動子如無花果瘤鑲嵌病毒35S啟動子、花椰菜鑲嵌病毒35S啟動子、CaMV35S啟動子、MAS啟動子，或組織特異性的或衰老-誘導啟動子，如康乃馨花瓣GST1啟動子或擬南芥SAG12啟動子(參見如J.C.Palaqui等PlantPhysiol.，1121447-1456(1996)；Morton等MolecularBreeding.1123-132(1995)；Fobert等PlantJournal，6567-577(1994)；Gan等PlantPhysiol.，113313(1997)，均通過引用結合到本文)。優選在本發明使用組成型啟動子。當使用衰老-誘導eIF-5A反義多核苷酸時優選使用SAG12啟動子，見實施例23。本發明中的有效啟動子的表達水平可使用常規表達系統來測量，例如通過測量報告基因的產物量，如測量導入了啟動子/報告基因的轉基因植物的花、葉、果實和其它組織細胞提取物中相應蛋白或mRNA的含量。典型報告基因例如GUS。調節序列可任意包含5’非翻譯前導序列或多聚腺嘌呤信號或增強子。此外本發明也考慮了為本領域技術人員所知的其它調節序列。本發明也提供經包含衰老-誘導eIF-5A正義或反義多核苷酸的載體或組合載體轉化的轉基因植物細胞、產生自這種細胞的轉基因苗或成熟的轉基因植株或轉基因植物的部分如花、果實、葉、種子等。本發明還提供抑制內源衰老-誘導eIF-5A表達的方法。包括將本發明中包含衰老-誘導eIF-5A反義多核苷酸的表達載體整合進植株的至少一個細胞的基因組內。該反義多核苷酸被轉錄并抑制內源衰老-誘導eIF-5A的表達。在另一種抑制內源衰老-誘導eIF-5A表達的方法里，包含本發明中衰老-誘導eIF-5A正義多核苷酸的表達載體被整合進植株的至少一個細胞的基因組內。該正義多核苷酸被轉錄并引起外源衰老-誘導eIF-5A共表達，從而減量調節或抑制內源衰老-誘導eIF-5A的表達。損傷-誘導eIF-5A損傷-誘導eIF-5A在損傷組織里表達。本發明涉及在擬南芥和番茄中對損傷-誘導eIF-5A的發現。本發明發現這種同工型在植物受損傷時受增量調節。增量調節發生在轉錄水平。此外，發生致病感染后，它只在蛋白水平受到增量調節，引起細胞死亡，因而推論損傷-誘導eIF-5A在病原體入侵事件中驅動細胞死亡。圖9顯示衰老-誘導eIF-5A在對照植株、模擬處理(mocktreatment)株、Avr處理株和Vir處理株內的含量保持恒定(在植株4周齡時檢測得到)。而損傷-誘導eIF-5A在Vir處理株里受到增量調節。圖10顯示一個用止血鉗損傷葉子的實驗結果。分別在損傷后立即、1h、9h測量衰老-誘導eIF-5A、損傷-誘導eIF-5A、生長eIF-5A的含量水平。RNA雜交印跡分析顯示衰老-誘導eIF-5A含量不變，但損傷-誘導eIF-5A含量顯著上升。生長eIF-5A的含量水平在損傷事件里開始下降。本發明證實當損傷-誘導eIF-5A受到增量調節同時植株遭損傷時(如移植幼苗)這個損傷會引起對生長eIF-5A表達的非常強的抑制。見圖14-17。結果植株生長受到強烈阻礙。但是當用卡那霉素浸泡種子并直接播種于土壤(無需移植因而無移植損傷)，種子會長成正常大小的植株。均有正義損傷-誘導eIF-5A構建體整合入的不同試驗株間的差異(圖15)是由于損傷-誘導eIF-5A表達水平不同引起的。當引入一個基因(正義或反義)時可得到不同程度的增量調節或減量調節，本領域技術人員可利用這一特性。差異的程度取決于基因的整合位置與整合拷貝數。通過表達水平差異可將不同表型與基因表達關聯起來。一旦所需表型產生，即可選出該植株并用來產生所需后代。因而在圖15中，對損傷-誘導eIF-5A實施強增量調節的植株在受損傷后幾乎不生長(標簽10-株)，而生長稍好的植株(但也不如野生型株)(標簽4-株)的增量調節強度遜于前者。本發明的一個實施方案是從擬南芥分離的損傷-誘導eIF-5A。氨基酸序列見圖41(SEQIDNO＿)，編碼該氨基酸的核苷酸序列見圖41(SEQIDNO＿)。本發明的另一實施方案是從番茄分離的損傷-誘導eIF-5A。氨基酸序列見圖103(SEQIDNO＿)，編碼該氨基酸的核苷酸序列見圖103(SEQIDNO＿)。本發明也提供分離的損傷-誘導eIF-5A多核苷酸，具有與上述列舉多核苷酸序列90％的同源性，可在嚴格條件下與所列舉多核苷酸的互補序列或其它編碼損傷-誘導eIF-5A的序列進行雜交。本發明還提供損傷-誘導eIF-5A的反義多核苷酸。這種反義多核苷酸可以為任何長度，只要它能夠抑制表達。在一些實施方案中，所用的反義多核苷酸包括全長編碼區，在另一些更優選的實施方案里，定位至3’UTR，因為不同的eIF-5A同工型在3’UTR有更高程度的差異。在一些實施方案里，反義多核苷酸定位至5’非編碼區。已知與5’非編碼區基本互補的反義多核苷酸是轉錄因子編碼基因表達的有效抑制劑。Branch，M.A.，Molec.CellBiol.，134284-4290(1993).這里及權利要求書所用的術語“損傷-誘導eIF-5A反義多核苷酸”不僅包括與上文所列舉多核苷酸的互補序列有100％同源性的反義多核苷酸，也包括那些反義多核苷酸功能變異體。功能變異體如上文描述。變異體發揮本發明預期的功能，也就是當其被導入一個表達載體并且此載體被整合到至少一個植物細胞的基因組內時，變異體可調節內源損傷-誘導eIF-5A的表達。本發明的一個實施方案提供了一個表達載體，包含本發明中如上描述的損傷-誘導eIF-5A多核苷酸或本發明中如上描述的損傷-誘導eIF-5A反義多核苷酸。載體同上文描述。本發明也提供經包含損傷-誘導eIF-5A正義或反義多核苷酸的載體或組合載體轉化的轉基因植物細胞、產生自這種細胞的轉基因苗或成熟的轉基因植株或轉基因植物的部分如花、果實、葉、種子等。本發明還提供抑制內源損傷-誘導eIF-5A表達的方法。包括將本發明的包含損傷-誘導eIF-5A反義多核苷酸的表達載體整合進植株的至少一個細胞的基因組內。該反義多核苷酸被轉錄并抑制內源損傷-誘導eIF-5A的表達。在另一種抑制內源損傷-誘導eIF-5A表達方法里，含本發明的損傷-誘導eIF-5A正義多核苷酸的表達載體被整合進植株的至少一個細胞的基因組內。該正義多核苷酸被轉錄并引起外源損傷-誘導eIF-5A基因的表達，從而導致減量調節或抑制內源損傷-誘導eIF-5A的表達。通過抑制內源損傷-誘導eIF-5A的表達，使所得的轉基因植株具有更強的抵御病原體引起的致命損害的能力。見實施例16和圖43，44。生長eIF-5A本發明也涉及生長eIF-5A。生長eIF-5A在生長組織中表達。當用生長eIF-5A正義多核苷酸增量調節生長eIF-5A時，注意到三種表型改變種子變大、產量提高、生物量提高。本發明的一個實施方案是從擬南芥分離生長eIF-5A。氨基酸序列見圖1(SEQIDNO＿)，編碼該氨基酸的核苷酸見圖2(SEQIDNO＿)。本發明的另一個實施方案是從番茄分離的生長eIF-5A。氨基酸序列見圖101(SEQIDNO＿)，編碼該氨基酸的核苷酸見圖101(SEQIDNO＿)。本發明的再一個實施方案是從油菜分離的生長eIF-5A。氨基酸序列見圖95(SEQIDNO＿)，編碼該氨基酸的核苷酸見圖95(SEQIDNO＿)。本發明也提供分離的生長eIF-5A多核苷酸，具有與上述列舉多核苷酸序列90％的同源性，可在嚴格條件下與所列舉多核苷酸的互補序列或其它編碼生長eIF-5A的序列進行雜交。本發明也提供生長eIF-5A的反義多核苷酸。這種反義多核苷酸可以為任何長度，只要它能夠抑制表達。在一些實施方案中，所用的反義多核苷酸包括全長編碼區，在另一些更優選的實施方案里，反義多核苷酸定位至3’UTR，因為不同的eIF-5A同工型在3’UTR有更高程度的差異。在一些實施方案里，反義多核苷酸會定位至5’非編碼區。已知與5’非編碼區基本互補的反義多核苷酸是轉錄因子編碼基因表達的有效抑制劑。Branch，M.A.，Molec.CellBiol.，134284-4290(1993).這里及權利要求書所用的“生長eIF-5A反義多核苷酸”不僅包括與上文所列舉多核苷酸的互補序列有100％同源性的反義多核苷酸，也包括那些反義多核苷酸功能變異體。功能變異體如上文描述。變異體發揮本發明預期的功能，也就是當其被導入一個表達載體并且此載體被整合到至少一個植物細胞的基因組內時，變異體可調節內源生長eIF-5A的表達。本發明的一個實施方案提供了一個表達載體，包含本發明的生長eIF-5A多核苷酸或本發明的如上描述的生長eIF-5A反義多核苷酸。載體同上文描述。本發明也提供經包含生長eIF-5A正義或反義多核苷酸的載體或組合載體轉化的轉基因植物細胞、產生自這種細胞的轉基因苗或成熟的轉基因植株或轉基因植物的部分如花、果實、葉、種子等。本發明還提供抑制內源生長eIF-5A表達的方法。包括將本發明的包含損傷-誘導eIF-5A反義多核苷酸的表達載體整合進植株的至少一個細胞的基因組內。該反義多核苷酸被轉錄并抑制內源生長eIF-5A的表達。在另一種抑制內源生長eIF-5A表達方法里，含本發明的生長eIF-5A正義多核苷酸的表達載體被整合進植株的至少一個細胞的基因組內。該正義多核苷酸被轉錄并引起外源生長eIF-5A基因的表達，從而導致減量調節或抑制內源生長eIF-5A的表達。本發明的另一實施方案提供了增量調節生長eIF-5A的方法。包含本發明的生長eIF-5A正義多核苷酸的表達載體整合進植株的至少一個細胞的基因組內。該正義多核苷酸被轉錄并引起外源生長eIF-5A基因的共表達，從而使細胞表達比非轉基因細胞更多的生長eIF-5A。圖19顯示生長eIF-5A受增量調節的植物比對照植株有更高的生物量。生長eIF-5A按正義方向被插入擬南芥植株以增量調節生長eIF-5A表達。測定了16個母品系(1-16)以確定生長eIF-5A表達的一般水平。每個母品系產生8個子品系(A-H)。測量每個母品系的生長eIF-5A表達水平，結果見圖20。注意到由始至終母品系的表達水平差異。例如，品系2和10有很高的表達水平而品系11和16則很低或不表達。圖21和22顯示來自品系1和2的植株。這些植株大于對照株。因為生長eIF-5A是一個細胞分裂同工型而且因為它是組成型表達，細胞分裂作用增強。衰老減弱的出現是因為植物被固定于生長模式并且不能轉換到衰老途徑。圖23和24為來自生長eIF-5A表達水平中等的品系植株。它們顯示有更大的葉和衰老推遲。圖25和26為來自低水平增量調節的品系。它們有大的葉子和大的蓮座。圖27和28為來自無增量調節(可能由于基因共抑制)的品系植株。因為植株有卡那霉素抗性，所以抗性基因肯定存在以使植株在培養基上生長。衰老-誘導eIF-5A也被共抑制，因此引起植株變大。除了生物量增加，增量調節生長eIF-5A的植株種子變大。所有品系的種子大小均被測量。可觀察到生長eIF-5A表達水平最高的品系種子變大了3倍以上。這是因為生長eIF-5A受到增量調節，增強細胞分裂作用，因而使種子變大。在以上例子中生長eIF-5A(來自擬南芥)被組成型表達，也就是通過使用一個通用啟動子使它在植株的所有部位均表達。相反，通過使用一個組織特異啟動子，可使增量調節在特定組織里進行。例如，通過使用種子特異啟動子，生長eIF-5A僅在種子中受增量調節，這樣允許葉子正常生長而種子產量提高。因此，使用一個特異啟動子，生長eIF-5A可在所需植株部位受增量調節，以得到一個所需表型。通過增量調節生長eIF-5A所得的三種表型——生物量提高、種子變大和產量提高，不會同時出現(或表現在同一植株內)。例如，如果一個植株表現出種子變大，那么就會出現較小的植株。生長eIF-5A表達水平最高的品系產生最大的種子，但植株較小，因為遍及整個植株的大量細胞分裂是在損害細胞變大的情況下(需要更大的葉)進行的。在較低的生長eIF-5A表達水平，可觀察到影響葉(變大)但不影響種子。因此可使用組織特異表達并選取所需表型。例如，可將生長eIF-5A基因置于木質部特異啟動子控制下以獲得更高的木質部產量。這樣，可用任何所需啟動子來獲得所需組織特異型的增量調節。DHS激活eIF-5A必須有DHS參與，DHS在衰老組織中表達。因而本發明提供了分離自擬南芥、番茄、康乃馨、油菜、萵苣、苜蓿、香蕉、三角葉楊和球腔菌(mycosphaerella)的DHS。因此本發明的一個實施方案為分離自擬南芥的DHS。氨基酸序列見圖46(SEQIDNO＿)，編碼該氨基酸的核苷酸序列見圖46(SEQIDNO＿)。另一個實施方案為分離自番茄的DHS。氨基酸序列見圖45A和B(SEQIDNO＿)，編碼該氨基酸的核苷酸序列見圖45A和B(SEQIDNO＿)。另一個實施方案為分離自康乃馨的DHS。氨基酸序列見圖54(SEQIDNO＿)，編碼該氨基酸的核苷酸序列見圖54(SEQIDNO＿)。另一個實施方案為分離自油菜的DHS。氨基酸序列見圖97(SEQIDNO＿)，編碼該氨基酸的核苷酸序列見圖97(SEQIDNO＿)。另一個實施方案為分離自萵苣的DHS。圖105為萵苣DHS編碼多核苷酸的部分序列。另一個實施方案為分離自苜蓿的DHS。氨基酸序列見圖107A和B(SEQIDNO＿)，編碼該氨基酸的核苷酸序列見圖107A和B(SEQIDNO＿)。另一個實施方案為分離自香蕉的DHS。氨基酸序列見圖108A和B(SEQIDNO＿)，編碼該氨基酸的核苷酸序列見圖108A和B(SEQIDNO＿)。另一個實施方案為分離自三角葉楊的DHS。氨基酸序列見圖109A和B(SEQIDNO＿)，編碼該氨基酸的核苷酸序列見圖109A和B(SEQIDNO＿)。另一個實施方案為分離自球腔菌的DHS。圖110為球腔菌DHS編碼多核苷酸的部分序列。本發明也提供了分離的DHS多核苷酸，其與上文列舉的多核苷酸有90％同源性，并能在高度嚴格條件下與所列舉多核苷酸的互補序列或與其它編碼DHS的多核苷酸進行雜交。本發明還提供了DHS的反義多核苷酸。該反義多核苷酸可為任意長度，只要能夠抑制基因表達。在一些實施方案中，反義多核苷酸包含全長編碼序列，可定位到3’UTR或5’非編碼序列。已知與5’非編碼序列基本互補的反義多核苷酸是轉錄因子編碼基因的有效表達抑制劑。Branch，M.A.，Molec.CellBiol.，134284-4290(1993).這里及權利要求書所用的術語“DHS反義多核苷酸”不僅包括與上文所列舉多核苷酸的互補序列有100％同源性的反義多核苷酸，也包括那些反義多核苷酸功能變異體。功能變異體如上文描述。變異體發揮本發明預期的功能，也就是當其被導入一個表達載體并且此載體被整合到至少一個植物細胞的基因組內時，變異體可調節內源DHS的表達。本發明的一個實施方案提供了一個表達載體，包含DHS多核苷酸(本發明中如上描述的)或DHS反義多核苷酸(本發明中如上描述的)。載體同上文描述。本發明還提供經包含DHS正義或反義多核苷酸的載體或組合載體轉化的轉基因植物細胞、產生自這種細胞的轉基因苗或成熟的轉基因植株或轉基因植物的部分如花、果實、葉、種子等。本發明也提供抑制內源DHS表達的方法。包括將本發明包含DHS反義多核苷酸的表達載體整合進植株的至少一個細胞的基因組內。該反義多核苷酸被轉錄并抑制內源DHS的表達。在另一種抑制內源DHS表達方法里，含本發明的DHS正義多核苷酸的表達載體被整合進植株的至少一個細胞的基因組內。該正義多核苷酸被轉錄并引起外源DHS基因的共表達，從而導致減量調節或抑制內源DHS的表達。通過抑制內源DHS的表達，所得轉基因植株將缺失或顯著減少用以活化eIF-5A的DHS。如前文討論，eIF-5A必須經活化方具有生物活性。因而，通過反義多核苷酸，或正義多核苷酸的共抑制來抑制或減少DHS的表達，所得轉基因株將缺失活性eIF-5A或只有減活的eIF-5A。這些轉基因株將表現出生物量的提高、種子變大和/或產量提高。包含DHS反義多核苷酸的轉基因株表現出更強的光合作用和更高的淀粉含量。見實施例24和25。使用DHS特異抑制劑處理康乃馨的實驗是進一步的證據，支持了DHS和eIF-5A調節衰老的論點。亞精胺和eIF-5A是DHS的底物(Park等1993；Park等1997)。一些結構特征與亞精胺相似的單胺、二胺或多胺在體外抑制DHS的活性(Jakus等1993)。一些多胺，如亞精胺、腐胺、精胺，已被廣泛用來延長康乃馨的花瓶保鮮時間(vaselife)(Wang和Baker，1980)。通過使用不同濃度的不同多胺，Wang等(unpublishedb)成功的將康乃馨的花瓶保鮮時間延長了兩倍。使用瞬時感染系統來減量調節DHS的進一步研究正在進行。初步的數據顯示，用真空滲入瞬時感染可表達反義DHS的系統處理后，康乃馨花在切下后第8天的存活率高于未處理花4倍(Wang等unpublishedb)。農業上農作物損失除了由于生長過程中壓力造成以外，另一主要損失來自收割后的環境壓力誘導的衰老(McCabe等2001)。這一點在部分收割植物上表現得尤為明顯，如收割后的萵苣。提示收割萵苣的信號之一為褐變，這是由酚類產物引起的(Matile等1999)。具有萵苣eIF-5A(LeIF-5A)反義多核苷酸或DHS全長反義多核苷酸的轉基因萵苣的田間實驗表明，轉基因萵苣收割后的抗褐變能力明顯強于對照組。實驗表明即使由于收割引起的壓力誘導的衰老有不同的作用途徑(Page等2001)，褐變的翻譯上游控制和其它可能的衰老信號，至少在部分上被DHS和eIF-5A所調節。衰老的下游調節由執行基因進行，這些基因能夠影響衰老并引起代謝變化，產生衰老信號。當eIF-5A和DHS受到減量調節，能負作用于衰老引起的所有信號。本發明也涉及識別這三種eIF-5A同工型的抗體，即衰老-誘導因子eIF-5A、損傷-誘導因子eIF-5A和生長因子eIF-5A。本發明也提供了在其它植物和真菌內鑒別衰老-誘導eIF-5A、損傷-誘導eIF-5A、生長eIF-5A或DHS的方法。通過使用這里的方法和提供的序列，來設計用以分離/鑒別所需同工型或DHS的探針。因為eIF-5A同工型(衰老-誘導eIF-5A、損傷-誘導eIF-5A和生長eIF-5A)通常在編碼區有高度同源性(見圖2)，為確保鑒定甚至改變所需同工型的擴增，優選自5’UTR的開始序列和3’UTR末端序列(見圖3，4和5)設計探針或引物。優選的一組用以擴增損傷-誘導eIF-5A基因或鑒別損傷-誘導eIF-5A的探針的引物序列如下。下游引物5’GAGCTCAAGAATAACATCTCATAAGAAAC3’(SEQIDNO＿)，上游引物5’CTCGAGTGCTCACTTCTCTCTCTTAGG3’(SEQIDNO＿)。在從植株或植株某部分分離損傷-誘導eIF-5A前，最好對其進行損傷處理以使該植株開始表達損傷-誘導eIF-5A。任何損傷事件均可接受，這種典型的損傷事件包括將葉片沿中央葉脈壓碎。類似的在分離衰老-誘導eIF-5A以前，最好對其實施壓力以誘導衰老。至此已對本發明進行了廣泛的描述，通過參考以下實施例將能更易于理解本發明，舉出下列實施例的目的是為了說明本發明而不是對本發明進行限定。實施例實施例1信使RNA(mRNA)的分離從番茄處于不同發育階段的花和果實中分離出總RNA，也從葉中(未處理或低溫處理或山梨醇處理)分離總RNA。取5g組織在液氮中快速磨碎。然后將研磨粉末與30ml胍緩沖液(4M異硫氰酸胍，2.5mMNaOAc，PH8.5，0.8％□-巰基乙醇)混合。用四層干酪包布(cheesecloth)過濾混合物后于4℃，10,000×g離心30min。取上清液進行氯化銫密度梯度離心，26,000×g離心20h。用75％乙醇清洗RNA沉淀后用600μlDEPC處理過的水重懸浮，然后加入0.75ml95％乙醇和30μl3MNaOAc，于-70℃沉淀RNA。取10μgRNA在1.2％甲醛變性瓊脂糖凝膠上電泳，然后轉移到尼龍膜上。用通過隨機引物獲得的并用32P-dCTP標記的全長DHScDNA(SEQIDNO1)為探針與尼龍膜在42℃下溫育過夜。然后用含0.1％SDS的1×SSC溶液室溫下洗滌膜一次，15min，再用含0.1％SDS的0.2×SSC溶液65℃下洗膜三次，每次15min。隨后將膜置于X射線膠片下，-70℃過夜。用Promega公司的PolyA+tractmRNA分離系統從總RNA中分離出PolyA+mRNA。使用Stratagene(LaJolla，Calif)的ZAPExpresscDNA合成系統，以PolyA+mRNA為模板合成cDNA。番茄葉cDNA文庫篩選取MatchF1雜交番茄株葉子，用2M山梨醇處理6h，從中分離得到的cDNA文庫稀釋至約5×106PFU/ml。使用32P標記的600bpRT-PCR片段對文庫進行篩選。切下所得的三個陽性cDNA，并按照說明書將其整合到pBK-CMV噬菌體載體上(Stratagene)。全長cDNA被插入到pBK-CMV載體中。質粒DNA分離和DNA測序用Sanbrook等人(Supra)描述的堿裂解法分離質粒DNA。使用雙脫氧法對全長陽性cDNA克隆進行測序(Sanger，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，745463-5467.)。使用BLASTsearch對開放閱讀框進行編輯和分析(GenBank，BethesdaMD)，并使用BCMsearchlauncher多序列對比模式-誘導的多對比法(MultipleSequenceAlignmentsPattern-InducedMultipleAligmentMethod)(見F.Corpet，Nuc.AcidsRes.，1610881-10890(1987))獲得編碼基因相應的氨基酸序列與五個同源性最高的蛋白序列間的對比。用MultipleFinder來鑒別所得氨基酸序列的功能基序。番茄RNA的印跡雜交分析從不同階段的番茄花(花蕾、開花和完全開放或變干的衰老花瓣)、番茄葉子和不同成熟階段的番茄果實(果實花端著色(breaker)，也就是綠果實只有不到10％為紅色；粉紅色，就是整個果實為橙色或粉紅色；紅色(硬或軟))中分離得到總RNA，取10μg上述RNA在1％的變性甲醛瓊脂糖凝膠上分離并固定于尼龍膜上。使用隨機引物試劑盒(BoehringerMannheim)標記32P-dCTP得到的全長番茄cDNA被用作探針檢測濾膜(7×107cpm)。室溫下，用1×SSC、0.1％SDS洗滌濾膜一次，65℃下用0.2×SSC、0.1％SDS洗滌濾膜三次。濾膜干燥后，置于X射線膠片下，-70℃過夜。所得結果見圖50-52。擬南芥RNA的RNA印跡雜交分析同上文方法分別從5周齡(泳道1)、6周齡(泳道2)、7周齡(泳道3)的擬南芥葉中分離總RNA，在1％的變性甲醛瓊脂糖凝膠上分離并固定于尼龍膜上。使用隨機引物試劑盒(BoehringerMannheim)標記32P-dCTP得到的全長擬南芥衰老-誘導DHScDNA被用作探針檢測濾膜(7×107cpm)。室溫下，用1×SSC、0.1％SDS洗滌濾膜一次，65℃下用0.2×SSC、0.1％SDS洗滌濾膜三次。濾膜干燥后，置于X射線膠片下，-70℃過夜。所得結果見圖55。康乃馨RNA的RNA印跡雜交分析同上文方法從康乃馨植株花的不同發育階段的花瓣，即緊實花蕾(tightbud)(泳道1)、開始開放(beginningtoopen)(泳道2)、完全開放(fullyopen)(泳道3)、內卷花瓣(inrollingpetals)(泳道4)中分離總RNA。使用隨機引物試劑盒(BoehringerMannheim)標記32P-dCTP得到的全長康乃馨衰老-誘導DHScDNA被用作探針檢測濾膜(7×107cpm)。室溫下，用1×SSC、0.1％SDS洗滌濾膜一次，65℃下用0.2×SSC、0.1％SDS洗滌濾膜三次。濾膜干燥后，置于X射線膠片下，-70℃過夜。所得結果見圖56。實施例2山梨醇誘導番茄衰老-誘導DHS基因在密閉容器里用2M山梨醇處理番茄葉6h。按以下方法從山梨醇處理后的番茄葉中提取RNA。取5g葉在液氮中磨碎。研磨粉末與30ml胍緩沖液(4M異硫氰酸胍、2.5mMNaOAc、0.8％□-巰基乙醇、PH8.5)混合。用四層干酪包布(cheesecloth)過濾混合物后于4℃，10,000×g離心30min。取上清液進行氯化銫密度梯度離心，26,000×g離心20h。用75％乙醇清洗RNA沉淀后用600μlDEPC處理過的水重懸浮，然后加入0.75ml95％乙醇和30μl3MNaOAc，于-70℃沉淀RNA。取10gRNA在1.2％的變性甲醛瓊脂糖凝膠上電泳分離，然后轉移到尼龍膜上。用通過隨機引物獲得的并用32P-dCTP標記的全長DHScDNA(SEQIDNO1)為探針與尼龍膜在42℃下溫育過夜。然后用含0.1％SDS的1×SSC溶液室溫下洗滌膜一次，15min，再用含0.1％SDS的0.2×SSC溶液65℃下洗膜三次，每次15min。膜置于X射線膠片下，-70℃過夜。結果見圖52，可見山梨醇處理的葉細胞中DHS基因被誘導轉錄。實施例3番茄衰老花中的DHS基因的誘導收獲緊實花蕾和開放、衰老番茄花，并如實施例2提取RNA。取10μgRNA在1.2％的變性甲醛瓊脂糖凝膠上電泳分離并轉移至尼龍膜。用通過隨機引物獲得的并用32P-dCTP標記的全長DHScDNA(SEQIDNO1)為探針與尼龍膜在42℃下溫育過夜。用含0.1％SDS的1×SSC溶液室溫下洗滌膜一次，15min，再用含0.1％SDS的0.2×SSC溶液65℃下洗膜三次，每次15min。膜置于X射線膠片下，-70℃下過夜。結果見圖50，可見在衰老花中DHS基因被誘導轉錄。實施例4番茄成熟過程中果實的DHS基因的誘導如實施例2方法，從番茄的果實花端著色、粉紅和成熟階段果實中提取RNA。取10μgRNA在1.2％的變性甲醛瓊脂糖凝膠上電泳分離并轉移至尼龍膜。用通過隨機引物獲得的并用32P-dCTP標記的全長DHScDNA(SEQIDNO1)為探針與尼龍膜在42℃下溫育過夜。然后用含0.1％SDS的1×SSC溶液室溫下洗滌膜一次，15min，再用含0.1％SDS的0.2×SSC溶液65℃下洗膜三次，每次15min。膜置于X射線膠片下，-70℃下過夜。結果見圖51。可見紅色成熟果實的DHS基因的轉錄作用是最強的，果實處于導致變質的衰老起始階段前。實施例5低溫誘導番茄的衰老-誘導DHS種植于罐中的番茄植株(7-8周齡)在生長室中于6℃下暴露2天、3天或6天。光周期設置為8h黑暗和16h光照。將植株搬回溫室以復溫。未復溫的植株則在搬離生長室后立即采摘。按下文方法從葉中提取RNA。取5g葉在液氮中磨碎。研磨粉末與30ml胍緩沖液(4M異硫氰酸胍、2.5mMNaOAc、0.8％□-巰基乙醇、PH8.5)混合。用四層干酪包布(cheesecloth)過濾混合物后于4℃，10,000×g離心30min。取上清液進行氯化銫密度梯度離心，26,000×g離心20h。用75％乙醇清洗RNA沉淀后用600μlDEPC處理過的水重懸浮，然后加入0.75ml95％乙醇和30μl3MNaOAc，于-70℃沉淀RNA。取10gRNA在1.2％的變性甲醛瓊脂糖凝膠上電泳分離，然后轉移到尼龍膜上。用通過隨機引物獲得的并用32P-dCTP標記的全長DHScDNA(SEQIDNO1)為探針與尼龍膜在42℃下溫育過夜。然后用含0.1％SDS的1×SSC溶液室溫下洗滌膜一次，15min，再用含0.1％SDS的0.2×SSC溶液65℃下洗膜三次，每次15min。膜置于X射線膠片下，-70℃過夜。結果見圖53。可見低溫和復溫過程可誘導葉中DHS基因的轉錄，并且增強的轉錄作用與低溫造成的損傷相關，損傷程度以細胞膜泄漏程度衡量。實施例6使用基于未鑒定的擬南芥基因組序列的引物獲得擬南芥PCR產物使用一對根據擬南芥基因組序列設計的寡核苷酸引物，以擬南芥cDNA為模板得到部分長度的衰老-誘導DHS基因序列。5’引物長19mer，序列為5’GGTGGTGTTGAGGAAGATC3’(SEQIDNO7)；3’引物長20mer，序列為5’GGTGCACGCCCTGATGAAGC3’(SEQIDNO8)。用ExpandHighFidelityPCRSystem(BoehringerMannheim)，以擬南芥衰老葉cDNA文庫為模板進行聚合酶鏈式反應，反應條件如下。反應液組成cDNA1μl(5×107pfu)dNTP(各10mM)1μlMgCl2(5mM)+10x緩沖液5μl引物1和2(各100μM)2μlExpandHighFidelityDNA聚合酶1.75U反應體積50μl反應參數94℃3min94℃/1min，58℃/1min，72℃/2min，45個循環72℃15min實施例7基因組DNA的分離和DNA雜交印跡分析從番茄葉中提取基因組DNA。取10g葉組織，在液氮中磨成細粉。將25ml勻漿緩沖液(100mMTris-HCl、100mMEDTA、250mMNaCl、1％肌氨酰、1％2-巰基乙醇、10μg/mlRNase、PH8.0)和12.5ml苯酚混合，將這37.5ml混合物預熱至60℃后加到磨碎的組織中。振搖15min，加入12.5ml氯仿-異戊醇(24∶1)，再振搖15min。然后離心，所得水相用25ml苯酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1)和氯仿-異戊醇(24∶1)再提取。室溫下加入15ml異丙醇得到核酸沉淀。用1ml水重懸浮沉淀。按下文用限制性內切酶消化基因組DNA取10μg基因組DNA，40μl10×反應緩沖液和100U限制性內切酶(XbaI、EcoRI、EcoRV或HinDIII)，總反應體積400μl，反應5到6小時。混合物再用苯酚抽提并用乙沉淀。消化后的DNA用0.8％瓊脂糖凝膠電泳，15V約15h。再將凝膠浸沒于變性緩沖液(87.66gNaCl和20gNaOH/L)中，輕輕攪動30min。再用蒸餾水清洗，再浸沒于中和緩沖液(87.66gNaCl和60.55gTris-HClpH7.5/L)中30min并輕輕攪動。DNA用毛細管印跡法轉移到Hybond-N+帶正電荷尼龍膜上。用1×106cpm/ml32P-dCTP標記的全長DHScDNA或DHScDNA3’-非編碼區序列進行雜交，42℃反應過夜。在含有50％甲酰胺、6×SSC、5×Denhardt’s溶液、0.1％SDS和100mg/ml變性鮭魚精子DNA的緩沖液中進行預雜交和雜交。膜預雜交2到4小時，雜交反應過夜。雜交完成后，室溫下用2×SSC和0.1％SDS漂洗，再用2×SSC和0.1％SDS沖洗15min，0.2×SSC和0.1％SDS沖洗15min。膜置于X射線膠片下-80℃過夜。結果見圖49。實施例8擬南芥衰老-誘導基因的分離以擬南芥衰老中葉子的cDNA文庫為模板進行PCR得到一個在擬南芥葉中表達的衰老-誘導基因全長cDNA克隆。最初，相應于該基因5’和3’的PCR產物通過使用以下引物獲得簡并上游引物<AAARRYCGMCCYTGCAAGGT>(SEQIDNO17)與T7載體引物<AATACGACTCACTATAG>(SEQIDNO18)配對，簡并下游引物<TCYTTNCCYTCMKCTAAHCC>(SEQIDNO19)與T3載體引物<ATTAACCCTCACTAAAG>(SEQIDNO20)配對。PCR產物亞克隆至pBluescript上測序。然后用5’特異引物<CTGTTACCAAAAAATCTGTACC>(SEQIDNO21)和配對的3’特異引物<AGAAGAAAGTATAAAAACCAT>(SEQIDNO22)得到全長cDNA，并亞克隆至pBluescript上測序。實施例9番茄果實衰老-誘導eIF-5A基因的分離以番茄果實cDNA文庫為模板PCR得到在番茄果實中表達的衰老-誘導基因全長cDNA克隆。最初，相應于該基因5’和3’端的PCR產物通過使用以下引物獲得簡并上游引物(SEQIDNO17)與T7載體引物SEQIDNO18)配對，簡并下游引物(SEQIDNO19)與T3載體引物(SEQIDNO20)配對。PCR產物亞克隆至pBluescript上測序。然后使用5’特異引物<AAAGAATCCTAGAGAGAGAAAGG>(SEQIDNO23)和T7載體引物(SEQIDNO18)得到全長cDNA，并亞克隆至pBluescript上測序。實施例10康乃馨衰老-誘導eIF-5A基因的分離以康乃馨處于衰老中的花的cDNA為模板得到在處于衰老中的康乃馨花中表達的衰老-誘導基因全長cDNA克隆。最初，相應于該基因5’和3’的PCR產物通過使用以下引物獲得簡并上游引物(SEQIDNO17)與T7載體引物(SEQIDNO18)配對，簡并下游引物(SEQIDNO19)與T3載體引物(SEQIDNO20)配對。PCR產物亞克隆至pBluescript上測序。然后用5’特異引物<TTTTACATCAATCGAAAA>(SEQIDNO24)和配對的3’特異引物<ACCAAAAACCTGTGTTATAACT>(SEQIDNO25)得到全長cDNA，并亞克隆至pBluescript上測序。實施例11擬南芥衰老-誘導基因的分離在擬南芥衰老中葉子的cDNA文庫中篩選得到在擬南芥葉子里表達的衰老-誘導基因全長cDNA克隆。用以篩選的探針序列(SEQIDNO26)見圖82。該探針是通過以衰老葉cDNA文庫為模板，通過Genbank中未鑒定序列(AB017060)所設計的引物進行PCR獲得的。PCR產物亞克隆至pBluescript上測序。實施例12康乃馨衰老-誘導DHS基因的分離在康乃馨衰老中花瓣cDNA文庫中篩選得到在康乃馨花瓣里表達的衰老-誘導DHS基因全長cDNA。用以篩選的探針序列(SEQIDNO27)見圖83。該探針是以衰老花瓣cDNA文庫為模板和簡并引物(上游5’TTGARGAAGATYMAARTGCCT3’)(SEQIDNO28)；下游(5’CCATCAAAYTCYTGKGCRTT3’)(SEQIDNO29)進行PCR獲得的。PCR產物亞克隆至pBluescript上測序。實施例13以擬南芥DHS基因全長或3’區域的反義多核苷酸轉化擬南芥用二元載體pKYLX71轉化土壤桿菌，載體含有擬南芥衰老-誘導DHS基因(SEQIDNO30，圖80)全長或3’區域的多核苷酸且均表達為反義構型，并處于雙35S啟動子的調節之下。轉化后的土壤桿菌以真空滲入法轉化擬南芥植株，用氨芐青霉素選擇所得T0株的轉化種子。圖65-68為轉化的擬南芥株照片，顯示DHS基因或其3’末端的反義方向表達導致了生物量提高，如葉子變大和植株變大。圖69說明轉基因擬南芥株的種子產量提高。實施例14以番茄DHS基因全長或3’區域的反義多核苷酸轉化番茄用二元載體pKYLX71轉化土壤桿菌，載體含有番茄衰老-誘導DHS基因(SEQIDNO31，圖81)全長或3’區域的多核苷酸且均表達為反義構型，并處于雙35S啟動子的調節之下。用這些轉化的土壤桿菌構建番茄葉移植體，產生轉化的愈傷組織和幼苗并以標準組織培養方法進行選擇。在溫室中種植轉化幼苗以獲得成熟的產果實T1株。圖70-79的照片顯示轉化株中番茄衰老-誘導DHS基因表達的減少引起了生物量提高，如葉子變大和植株變大，如同轉化擬南芥株所表現的一樣，同時也觀察到番茄果實軟化和壞死的推遲。實施例15用番茄DHS基因3’區域的反義多核苷酸轉化番茄植株以二元載體pKYLX71轉化土壤桿菌，載體包含DHS基因(圖81)的3’末端多核苷酸且表達為反義構型，并處于雙35S啟動子控制之下。用這些轉化的土壤桿菌構建番茄葉移植體，產生轉化的愈傷組織和幼苗并以標準組織培養方法進行選擇。在溫室中種植轉化幼苗以獲得成熟的產果實T1株。這些DHS表達減少的轉基因株的果實完全沒有花蒂腐現象(blossomendrot)，而相同條件下的對照株果實中有約33％發病。花蒂腐是一種生理疾病，是由于營養壓力引起果實底端(花的末端)的衰老和腐爛。圖84A和B的照片顯示了對照株果實的花蒂腐和轉基因株果實的正常。實施例16擬南芥翻譯起始因子5A(AteIF-5A)同工型在野生型哥倫比亞生態型-植物材料中的表達將擬南芥哥倫比亞生態型株的種子種植于盛有PromixBX土壤(PremierBrands，Brampton，ON，Canada)的6英寸罐中。新播種的罐于4℃保持2天，然后轉移至生長室中22℃下16h光照/8h黑暗的光周期。使用冷-白熒光燈泡提供光強為150μmolm-2·s-1的光照。從2周齡到7周齡，間隔一周采集一次整個蓮座，5周齡時采集莖生葉，6周齡時采集莖、長角果、花蕾和花，并采集吸漲種子(水中24h)，于液氮中速凍，保存于-80℃。丁香假單孢菌(pseudomonassyringae)感染擬南芥株將擬南芥哥倫比亞生態型株的種子播種到含64個生長單元(cell)的平臺上，用PromixBX土壤(PremierBrands，Brampton，ON，Canada)培養。播種后的平臺置于4℃保持2天后轉移到生長室中，9h光照/15h黑暗的光周期。所有處理均在植株4周齡時進行，盡管生理上由于光照時間縮短導致這些植株生長緩慢。用無致病力(avr)和有致病力(vir)的丁香假單孢菌番茄致病變種(Pseudomonassyringepv.Tomato)DC3000(得自RobinCamer博士，UniversityOfToronto，Toronto，Canana)感染4周齡植株的蓮座葉。用1ml無針頭的注射器給每株的蓮座葉的背軸面接種。參試株分成四組無接種、模擬接種(用10mMMgCl2)、無致病力丁香假單孢菌接種(106cfu/ml，10mMMgCl2)，有致病力丁香假單孢菌接種(106cfu/ml，10mMMgCl2)。進行兩次細菌計數，一次于接種后立即進行，第二次于接種后3天進行，為確保在用無致病力菌株處理時有足夠數量的細菌被導入以誘導組織獲得抗性。在預先確定的時間點采集接種葉進行后續分析。通過將DHS基因或損傷-誘導eIF-5A基因以反義方向插入T-DNA，發展了DHS或損傷-誘導eIF-5A表達減少的植株。這些品系表現出對丁香假單孢菌番茄致病變種(Pseudomonassyringepv.Tomato)DC300的顯著抗性，轉基因株相對于野生型株的細菌載量呈現高至99％的下降。見圖43和44。使用農作物得到的數據也顯示其對病原的抗性提高。用止血鉗損傷擬南芥根據Stotz等人(2000)所述，用止血鉗將正常光照條件下生長的4周齡葉沿主葉脈夾傷(約損傷至葉面積的10％)。在0min、1h和9h時分別采集葉組織，并立即速凍于液氮中，-80℃保存以進一步分析。RNA的分離和RNA印跡雜交分析根據Davis等人所述(1986)從擬南芥的蓮座葉中分離總RNA以進行雜交印跡分析。RNA在1％瓊脂糖凝膠上電泳分離并轉移到尼龍膜上(Daviset.al.，1986)。用放射性標記的衰老-誘導AteIF-5A、損傷-誘導AteIF-5A、生長AteIF-5A基因的3’UTR部分與固定的RNA在42℃下雜交過夜。這些3’UTR序列通過隨機引物試劑盒(BoehringerMannheim)標記上[α-32P]-dCTP。雜交后的膜用含0.1％SDS的2×SSC42℃洗滌2次每次15min，再用含0.1％SDS的1×SSC42℃洗滌2次每次30min。-80℃下放射自顯影過夜可見雜交。抗體的生產和純化擬南芥(AT)的真核翻譯起始因子5A(eIF-5A)同工型在氨基酸水平上具有高度同源性，尤其是在蛋白的N末端區域和中央區域(圖1)。為了獲得特異的同工型的抗體，根據AteIF-5A同工型相互間表現出獨特性的區域來設計多肽。將一個額外的半胱氨酸殘基添加到每條肽的N末端以與匙孔血藍蛋白(KLH)結合。所用序列為衰老-誘導AteIF-5A的CNDDTLLQQIKS；損傷-誘導AteIF-5A的CTDDGLTAQMRL；生長AteIF-5A的CTDEALLTQLKN。當這些序列被遞交到蛋白BLAST(近乎精確的短序列，由擬南芥限定；expectednumber2000；wordsize2；MatrixPAM90；Gapcost91)分析時，在數據庫中找到的有意義序列只有匹配的AteIF-5A而無其他。肽合成于西安大略大學多肽合成實驗室(UniversityofWesternOntarioPeptideSynthesisfacility)。根據Drenckhahnetal.(1993)和Collawn和Patterson(1999)所述，通過使用間-馬來酰亞胺基苯甲酰基-N-羥基琥珀酰亞胺酯將載體蛋白匙孔血藍蛋白(KeyholeLimpetHemocyanin(Sigma))與肽的N末端半胱氨酸殘基結合。將連接后的肽注射入兔體內，每隔兩周注射一次共四次。最后一次注射后兩周放血法收集兔血，收集的血凝固以收集抗血清。蛋白分級分離和蛋白雜交印跡分析將上文所列組織在緩沖液(50mMEPPS、pH7.4、0.25M山梨醇、10mMEDTA、2mMEGTA、1mMDTT、10mM氨基-正-己酸、植物組織蛋白酶抑制劑混合物(ProteaseInhibitorCocktailforPlanttissues(Sigma)))中，用微量離心管和小杵或大研缽與杵使組織勻質(～0.5g/ml)。在微量離心機以最高轉速短暫離心勻漿并丟棄沉淀。按Ghosh等(1988)所述測總蛋白量，用MiniproteinDualSlabcell(BioRad，Mississauga，Ontario)進行SDS-PAGE，凝膠(12％聚丙烯酰胺)用考馬斯亮藍R250(Faribanks等，1971)染色，或用半干轉移法(半干轉移槽，Bio-Rad，Hercules，CA)將蛋白轉印至聚二氟乙烯(PVDF)膜上。用1mg/ml聚乙烯乙醇封閉印跡30s(Miranda等，1993)，再于含0.1％(v/v)吐溫20和5％(w/v)奶粉的磷酸鹽緩沖液(PBS)中封閉1h。一抗(從第二次注射后的血中得到)用含0.1％(v/v)吐溫20和1％(w/v)奶粉的PBS按1∶50稀釋。用與堿性磷酸酶偶聯的山羊抗兔抗體作為二抗，和堿性磷酸酶底物NBT和BCIP(BioRad，Mississauga，ON)，來顯示抗原。實施例17制備過表達三種eIF-5A同工型的轉化擬南芥植株引物設計擬南芥(AT)的真核翻譯起始因子5A(eIF-5A)同工型在編碼區高度同源(圖2)。為避免出現擴增正確基因的問題，用以擴增衰老-誘導AteIF-5A、損傷-誘導AteIF-5A、生長AteIF-5A的引物設計基于5’UTR的接近開始區和3’UTR的末端區，分別見圖3、4和5。基于EST資料和來自GenBank數據庫的其它序列信息評估5’UTR和3’UTR序列。在引物末端添加合適的限制性內切酶識別位點，以方便后續在二元載體pKYLX71(圖6)中按正義方向進行連接反應。擴增衰老-誘導AteIF-5A基因所用的上游引物是5’AAGCTTGATCGTGGTCAACTTCCTCTGTTACC3’，下游引物是5’GAGCTCAGAAGAAGTATAAAAACCATC3’。損傷-誘導AteIF-5A所用上游引物是5’CTCGAGTCGTCACTTCTCTCTCTTAGG3’，下游引物是5’GAGCTCAAGAATAACATCTCATAAGAAAC3’。生長AteIF-5A所用上游引物是5’CTCGAGCTAAACTCCATTCGCTGACTTCGC3’，下游引物是5’GAGCTCTAGTAAATATAAAGAGTGTCTTGC3’。衰老-誘導AteIF-5A引物所加的限制性內切酶位點為HindIII和SacI位點，損傷-誘導AteIF-5A引物添加XhoI和SacI位點，生長AteIF-5A引物添加XhoI和SacI位點，如上文引物序列的下劃線部分所示。擬南芥基因組DNA的分離從3周齡蓮座葉中分離基因組DNA。將葉組織在提取緩沖液(200mMTris、pH7.5、250mMNaCl、25mMEDTA、0.5％SDS)中勻漿化，所得勻漿渦旋混合15s。用微量離心機最高轉速離心1min以除去殘留碎片。收集上清液并與異丙醇按1∶1混合，渦旋混合后室溫放置2min。微量離心機最高轉速離心5min收集沉淀，70％乙醇洗滌沉淀，真空干燥2min。干燥物用水重懸，按體積1∶1加入氯仿處理并渦旋混合。微量離心機最高轉速離心2min，收集上層液體并用20μl鹽溶液(2M醋酸鈉)和2倍體積的乙醇處理，-20℃下沉淀30min。然后用微量離心機最高轉速離心30min得到純化的基因組DNA沉淀，干燥后重懸于水中以進行PCR。基因組DNA的PCR用上文所述引物進行PCR。PCR反應混合物含1xTsg或Taq聚合酶反應緩沖液、1UTsg或Taq聚合酶、0.2mMdNTP、2mMMgCl2、相應的各自特異引物各15nmol。反應開始于熱啟動95℃10min，第一個循環包括95℃變性1min，55℃退火2min，72℃延伸2min。隨后29循環進行遞降程序即每個循環退火溫度降低0.5℃，最后一個循環退火溫度為40℃。最后72℃延伸10min。PCR產物用1％瓊脂糖凝膠電泳分離，根據說明書，使用MilliporeUltrafree-DA切膠并回收DNA用以從瓊脂糖spin柱提取DNA(MilliporeCorporation，Bedford，MA)。連接到pGEM-TEasy根據Promega公司說明書將PCR產物連接到pGEM-TEasyVector載體上(見圖7)。簡要的說，將PCR產物與pGEMT-EasyVector載體按3∶1混合，與3WeissUT4DNA連接酶在由PromegapGEM-TEasyVectorSystem(PromegaCorporatio，MadisonWI)提供的快速連接緩沖液(30mMTris-HCl、10mMMgCl2、10mMDTT、1mMATP、5％聚乙烯乙二醇(MW8000，ACSGrade)pH7.8)中15℃連接反應過夜，然后轉化大腸桿菌DH5-α感受態細胞懸液(用RbCl/CaCl法制備感受態細胞，Kushner，1978)。先將轉化反應液置于冰上30min，隨后42℃熱激90s，再加入1ml2×YT肉湯培養基于37℃復蘇1h。轉化后的細胞聚集，用小體積的2×YT肉湯培養基重懸，并涂布于含有50μg/ml氨芐青霉素的瓊脂糖平板上培養以進行選擇。pGEMT-Easy載體提供了細胞對氨芐青霉素的耐藥性，只有發生轉化的細胞才能在氨芐平板上生長。篩選并挑選出PCR產物連接到pGEMT-Easy載體的轉化細胞。通過限制性內切酶消化來篩選插入到pGEMT-Easy載體的PCR產物挑取選擇平板上的克隆接種至含50μg/ml氨芐青霉素的2×YT肉湯培養基于37℃培養過夜。使用WizardPrepDNA純化試劑盒(Promega)從選出的克隆里純化重組質粒。EcoRI37℃消化質粒DNA1h，1％瓊脂糖凝膠電泳后觀察，以確定存在AteIF-5As基因大小的插入片段。陽性質粒隨后由CoreMolecularBiologyFacility(UniversityofWaterloo，Waterloo，ON)測序，以確定序列適合在植物中(inplanta)過表達。連接到pKYLX71pGEM損傷-誘導AteIF-5A和pGEM生長AteIF-5A構建體均用XhoI和SacI進行雙酶切，連接到也用XhoI和SacI酶切的二元載體pKYLX71。這種酶切消化可以確保損傷-誘導AteIF-5A和生長AteIF-5A能以正義方向插入二元載體pKYLX71，并處于花椰菜鑲嵌病毒雙35S啟動子控制之下。使用1μg二元載體和3μg損傷-誘導AteIF-5A或生長AteIF-5A進行連接反應。連接在連接緩沖液(30mMTris-HCl、10mMMgCl2，10mMDTT、1mMATP、5％聚乙烯乙二醇(MW8000，ACSGrade)pH7.8)及3weissUT4DNA連接酶中進行。15℃連接反應過夜，并轉化大腸桿菌DH5-α感受態細胞懸液(用RbCl/CaCl法制備感受態，Kushner，1978)。先將轉化混合液置于冰上30min，隨后42℃熱激90s，再加入1ml2×YT肉湯培養基于37℃復蘇1h。轉化后的細胞聚集，用小體積的2×YT肉湯培養基重懸，并涂布于含有50μg/ml四環素的瓊脂糖平板上培養以進行選擇。pGEMT-Easy載體提供了細菌細胞對四環素的耐藥性，只有發生轉化的細胞才能在四環素平板上生長。通過PCR和XhoI和SacI雙酶切篩選并檢出插入損傷-誘導AteIF-5A或生長AteIF-5A基因的轉化細胞。隨后的PCR擴增(同上文所述基因組DNA擴增)和消化反應所得產物在1％瓊脂糖凝膠電泳分離，以確定有正確大小的插入片段。土壤桿菌的電穿孔和選擇pKYLX71損傷-誘導AteIF-5A和pKYLX71生長AteIF-5A構建體被電穿孔導入根癌土壤桿菌GV3010感受態細胞。制備感受態細胞，先將一個單克隆接種到含50μg/ml利福平和50μg/ml慶大霉素的5ml2×YT肉湯培養基中，用FormaScientificOrbitalShaker(FisherScientific)280rpm轉速28℃振搖培養過夜，然后按不同稀釋度(1∶500、1∶1000、1∶2000)接種到含50μg/ml利福平和50μg/ml慶大霉素30ml2×YT肉湯培養基中。當菌液OD600達到0.5-0.8時，冷卻菌液并離心，在SS-34轉子(Sorvall)中2000g轉速進行15min。沉淀用50ml冰冷水懸浮，再用2000g轉速離心15min。如此洗滌程序重復4次以除去鹽分和死細胞。最后得到沉淀用40ml冰冷的10％(v/v)甘油重懸，并于2000g轉速離心15min，重復一次。用100μl冰冷10％(v/v)甘油重懸并混合均勻。將細胞分裝為每份100μl貯存于冰上。為將DNA電穿孔導入土壤桿菌感受態細胞，取上述100μl細胞與500ngDNA構建體混合均勻。隨后將細菌載體混合物轉移至預冷的電穿孔杯中并置于GenePluser(Biorad)，調節至以下設置2.5kv，25μF和200Ω。電穿孔后加入1ml2×YT肉湯培養基，將整個懸液轉移到培養試管中。該電穿孔培養物28℃280rpm振搖培養3h使細胞復蘇，再加入含50μg/ml利福平和50μg/ml慶大霉素的2×YT肉湯培養基培養。電穿孔細胞在培養基中生長2天后，涂布于含四環素、慶大霉素、利福平各50μg/ml的平板上再培養2天。最后得到的克隆用PCR和SacI-XhoI雙酶切及在1％瓊脂糖凝膠上分離顯示進行篩選，得到正確導入了pKYLX71損傷-誘導AteIF-5A或pKYLX71生長AteIF-5A構建體的克隆。植株的轉化含有pKYLX71損傷-誘導AteIF-5A或pKYLX71生長AteIF-5A的根瘤土壤桿菌GV3010陽性克隆被用來轉化野生型擬南芥哥倫比亞生態型植株。制備轉化植株所用的菌液時，首先挑取含pKYLX71損傷-誘導AteIF-5A或pKYLX71生長AteIF-5A構建體的陽性單克隆，接種至各含50μg/ml四環素、慶大霉素和利福平的5ml2×YT肉湯培養基中，置于FormaScientificOrbitalShaker(FisherScientific)以280rpm轉速28℃振搖培養2天，再接種至35ml(總量)也含50μg/ml利福平和50μg/ml慶大霉素2×YT肉湯培養基中。這35ml菌液以280rpm轉速28℃振搖培養過夜，并接種至535ml(總量)含50μg/ml利福平和50μg/ml慶大霉素2×YT肉湯培養基中。以280rpm轉速28℃振搖培養過夜，到OD600約為2.0為止。用兩個250ml離心管，以1945g轉速4℃在GSA轉子(Sorvall)中離心上述菌液15min。用500ml滲透培養基(1.1gMS鹽、25g蔗糖、0.25gMES、KOH調pH5.7、100ng/ml芐基氨基嘌呤、50μlVac-In-Stuff(SilwetL-77；LehleSeeds))重懸浮沉淀，然后置于一個大塑料盤中，再放入有4個橡皮塞的真空干燥器中。取5只罐，每只長有8株處于正確發育階段的植株用以連續的滲透。每只罐先在垃圾筒上倒置以除去所有松土，然后置于一個塑料容器內(罐仍然倒置)并放進玻璃干燥器中，這樣使得4個大橡皮塞可以支持住倒置罐子使花苔(bolt)浸入土壤桿菌漿液而不是植株的蓮座浸入。植株保持這種倒轉狀態，抽真空(400mmHg)10min。經真空滲入的植株恢復后與平常一樣在生長室條件下(見植物材料部分)生長。幾周后，當長角果變干種子成熟后，采集種子。每只罐的種子放在一起。轉化植株的選擇和分離分析為鑒定初級轉化株，從真空滲入株收集的種子先用1％(v/v)次氯酸鈉和0.1％(v/v)吐溫80進行表面消毒，在轉子(Barbsterd/Thermolyne)中進行20min，用無菌水漂洗4次，再用0.8％無菌瓊脂重懸。然后種入無菌的半濃度MurashingandSkoog(MS)培養基中(2.2g/L)，并補充1％(w/v)蔗糖、0.5g/L2-[N-嗎啉代]乙磺酸(MES)、0.7％(w/v)細菌用瓊脂和40-50μg/ml卡那霉素(MurashigeandShoog，1962)。只有轉化植株才能在卡那霉素平板上生長，因為二元載體給轉化植株提供了卡那霉素抗性基因(圖6)。因為無卡那霉素抗性基因，不含二元載體的幼苗變黃并死亡。野生型幼苗作為對照種植于不含卡那霉素的MS培養基上，同時含空白pKYLX71載體的純合株種子也作為對照種植于卡那霉素平板上。空白載體對照用來證明卡那霉素對幼苗生長影響和二元載體隨機整合至擬南芥基因組所產生的影響。在每塊含MS培養基和40-50μg/ml卡那霉素平板上的一個小區域里種植少量野生型種子。這么做是為了確保培養基有足夠的選擇性來選出轉化植株，并同時試驗卡那霉素的濃度。播種后的平板于4℃保持3天以使發芽同步化。3天后平板轉移至生長室，在16h光照/8h黑暗的光周期下于20±2℃再生長7天。光照保持在150umolm-2·s-1，使用冷白熒光燈泡。pKYLX71損傷-誘導AteIF-5A和pKYLX71生長AteIF-5A載體轉化擬南芥的效率得以確定。自播種起總計10天后，分別取正義損傷-誘導AteIF-5A和正義生長AteIF-5A轉化植株各14或16株，移植到有32個生長單元的PromixBX土壤(PremierBrands，Brampton，ON，Canada)平臺上。這些T1代植株隨即轉移到另一個生長室，該生長室被控制為22℃、16h光照/8h黑暗光周期。使用冷白熒光燈泡提供光強150μmolm-2·s-1。T1代植株成熟并產生T2代種子。采集這些種子并保藏于-20℃以利進一步篩選。T1代植株命名為1，2，3等。所有16個品系的正義生長AteIF-5A株均存活并產種，但14株正義損傷-誘導AteIF-5A轉化株中僅有9株存活并產種。用選擇T1代轉化植株的方法來選擇T2代轉化植株。含正義生長AteIF-5A的品系12沒能在選擇培養基上產生轉化植株，未包括到進一步的工作中。含正義生長AteIF-5A的品系1到16(除去品系12)每種均產生8個亞品系。這些亞品系被命名為A到H，因此如在T1品系1中，T2代植株被命名為1A、1B、1C等。正義損傷-誘導AteIF-5A植株品系1、2、3、4、5、7、9和11每種產生8個亞品系(A-H)。T1株的品系12僅產生約30粒T2種子，僅產生一個T2亞品系。正義損傷-誘導AteIF-5A植株的T2品系仍在生長和鑒定中。正義生長AteIF-5A的T2植株已經成熟并產種，采集種子并保藏于-20℃直至進一步分析。正義生長AteIF-5AT3代轉化植株的選擇用與T2同樣的方法來進行。根據表型分析和正義生長AteIF-5A的過量表達程度選出8個品系。表達水平分成四類高水平表達、中等水平表達、低水平表達和無表達(由共抑制引起)。每種水平選出兩個品系，每個品系移植12株。這個四種表達水平的相應品系為1A、2D、4D、15A、8D、9H、11C和16C。正義生長AteIF-5A植株的T3代仍在生長和鑒定中。實施例18正義損傷-誘導AteIF-5A和正義生長AteIF-5A轉化植株的表型分析照片記錄正義損傷-誘導AteIF-5A和正義生長AteIF-5A品系的形態表型在分離過程中用拍照記錄，相應野生型植株對照(擬南芥哥倫比亞生態型)和空白二元載體pKYLX71轉化植株對照的表型也被同樣記錄。種子度量收集正義生長AteIF-5AT2植株的T3種子，測量種子總產量(重量和體積)、種子大小(長和寬)并計算所產種子的單個重量和體積。用Sartorius電子分析天平(analytcaldigitizedscale)稱量種子總重，將每棵植株的種子倒入一個最小刻度為100μl的1ml玻璃針筒內來測量種子總體積。為了確定種子大小(長、寬和計算得出單個體積)，將種子放在含有測微計的載玻片上，用OlympusBX51顯微鏡觀測。聯用SpotInsightColorCamera(DiagosticInstitutionInc.)和CompaqEvoD500(CompaqCompanyCorporation；IntelPentium4CPU1.7GHz，262MGRAM，Windows2000)進行顯微拍照。使用Windows系統的Image-ProExpressVersion4.0程序。用照片中的測微計作為標度測量每個亞品系的10粒種子。測量結果輸入MicrosoftExcel分析并計算諸如標準差和體積。實施例19正義損傷-誘導AteIF-5A和正義生長AteIF-5A蛋白分級分離流分的生化分析和蛋白雜交印跡分析收集每個亞品系的正義生長AteIF-5A植株的T2植株的第一片莖生葉并按上文描述提取蛋白。品系1A、2A到16A的總蛋白用12％SDS-PAGE分級分離，并轉移到PDVF膜上。用生長αAteIF-5A抗體(1∶50稀釋度)作探針檢測印跡。收集野生型和空白二元載體對照株的第一片莖生葉并提取總蛋白作為對照。實施例20擬南芥翻譯起始因子5A(AteIF-5A)同工型在野生型哥倫比亞生態型植株中的表達采集不同發育階段的若干植物組織并提取總蛋白以進行蛋白雜交印跡分析。圖8中的蛋白雜交印跡分析結果顯示在2周齡蓮座葉中未見衰老-誘導AteIF-5A，但從3周齡葉子開始衰老-誘導AteIF-5A上調并大量增加直至5周齡，其后大量減少但7周齡時仍然存在。在PEG處理植株或對照植株中均未檢測到衰老-誘導AteIF-5A，但在花泳道中(包括衰老花)和吸漲種子泳道中存在，反映有子葉的組織的衰老。當用損傷-誘導αAteIF-5A抗體作探針檢測印跡時，在長角果、吸漲種子和莖的泳道可觀察到淺帶。在長角果和莖泳道中可觀察到損傷-誘導AteIF-5A可能是由于采集組織導致的損傷所引起。因為采集長角果和莖的操作困難，它們并沒有被速凍，使得損傷-誘導AteIF-5A同工型一定程度增量調節。當用生長αAteIF-5A抗體作探針檢測印跡時，只有吸漲種子顯示有帶，支持了這個同工型參與細胞分裂的觀點。在幾個時間點采集未處理株、用MgCl2模擬接種株、無致病力或有致病力的丁香假單孢菌處理株的組織以分析AteIF-5A在病原體入侵時的表達。植株識別無致病力菌株并誘導過敏反應，導致感染區域的細胞死亡或壞死，因而抵御了病原體引起的疾病。而且，局部性反應逐步變成系統性反應以保護植物不受進一步的侵犯。這種作用被稱為系統獲得性抗性(SystemicAcquiredResistance，SAR)，它包括一套基因的表達，這套基因稱為病原體應答(PathogenResponse，PR)基因。另一方面，植株不能識別有致病力的菌株，因而不產生過敏反應并會導致疾病。擬南芥病態癥狀包括葉子變黃和感染后幾天細胞死亡。感染后72h，采集對照株、模擬感染株、無致病力的菌種處理株和有致病力的菌株處理株組織，用三種αAteIF-5A抗體(圖9)為探針進行蛋白雜交印跡分析。在這個時間點，SAR和疾病分別在無致病力的菌種處理株和有致病力的菌種處理株中都被觀察到。當用衰老-誘導αAteIF-5A抗體為探針時，在所有樣品中均可觀察到一條大致相同的帶。既然所有植株均為4周齡，所以這并不奇怪，因為衰老同工型在3周齡開始可被觀察到(圖8)。當用損傷-誘導αAteIF-5A抗體為探針檢測印跡時，在未處理對照株、模擬處理株和無致病力的菌種處理株可檢測到一條淺帶，而在有致病力的菌種處理株可檢測到一條顏色很深的帶。這種損傷同工型的增量調節可歸咎于疾病導致的細胞死亡(也是一種細胞損傷)。用生長αAteIF-5A抗體為探針檢測印跡時未顯示任何帶，因此圖中未反映。在這些處理株中衰老-誘導AteIF-5A的表達未見變化，證明其特異于自然衰老。損傷-誘導AteIF-5A表達的提高也證明它特異于損傷引起的死亡。為了進一步探索這種可能性，用擬南芥的損傷葉進行實驗。損傷實驗顯示了與病理實驗相似的結果(圖10)。用RNA雜交印跡分析顯示衰老-誘導AteIF-5A、損傷-誘導AteIF-5A、生長AteIF-5A的轉錄變化。探針特異于每種AteIF-5As并且含有各自的3’UTR序列。觀察到與病理實驗結果相似，衰老-誘導AteIF-5A表達未變化，因為這些為4周齡株且樣品采集僅間隔9h。這再次與衰老-誘導AteIF-5A是特異的自然衰老同工型的事實一致。然而損傷-誘導AteIF-5A的表達9h后上升。很可能發生了一些翻譯控制，因為未誘導時轉錄物表現為組成型(圖10)，但是不誘導蛋白不表現出高表達(圖9)。生長AteIF-5A轉錄物在所有樣品中幾乎都檢測不到，并且表現出損傷后的表達下降。實施例21過量表達三種eIF-5A同工型的擬南芥轉化植株的產生從基因組DNA用PCR分離AteIF-5A(圖11)。PCR產物連接到pGEM(圖12)上，并且序列經證實適合在植物中過表達。用XhoI和SacI雙酶切將損傷-誘導AteIF-5A和生長AteIF-5A基因從pGEM上切下，以正義方向連接到pKYLX71上，位于花椰菜鑲嵌病毒雙35S啟動子后。用酶切和PCR確定陽性連接反應產物(圖13)。然后用pKYLX71損傷-誘導AteIF-5A和pKYLX71生長AteIF-5A電穿孔轉化根瘤土壤桿菌GV3010，再用轉化的菌株通過真空滲入感染野生型擬南芥哥倫比亞生態型植株。采集轉化后植株的種子并用含卡那霉素的MS平板上選擇轉化植株。過量表達損傷-誘導AteIF-5A(正義損傷-誘導AteIF-5A)的擬南芥植株T1代植株種于含50μg/ml卡那霉素的MS平板上，4℃貯存3天，在生長室中7天(圖14)。有14棵轉化植株移植到土中。這14棵T1代植株的一個共同表型是發育障礙。品系1、4、6、8、10、11、12、13和14的生長被嚴重阻礙而且品系6、8、10、13和14不產種。品系2和3中度受阻而品系5、7和9的生長與野生型相似(圖15和16)。T1代正義損傷-誘導AteIF-5A植株的其它一些表型包括黃色葉子、紫色子葉、卷曲葉和花形差異。值得注意的是，直到植株被移植到土壤中才觀察到生長受阻的現象。這一點可能的一個解釋是，在移植時根發生了輕微損傷(移植不可避免的一個后果)而且不能恢復。事實上在預備實驗里，用卡那霉素溶液浸泡種子并直接播種到土壤中，未見生長受阻的現象(而上文70％的植株在一定程度上生長受阻)，是因為沒有移植所以根沒有被損傷。品系1、2、3、4、5、7、8、11和12產生T2種子(圖17)。除了只長出一株轉化植株的品系12，每個T2品系中有8個亞品系A-H并用于當前分析。過量表達生長AteIF-5A(正義生長AteIF-5A)的擬南芥植株正義生長AteIF-5A植株的T1代種子長于選擇培養基上，長出16棵轉化植株(圖18)。用照片記錄這些轉化植株的整個生命階段。其表型從與野生型相似(品系1、2、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15和16)到生長中度受阻且植株顯黃色(品系2、4和9，圖19)間變化。所有品系都用于產生T2代種子，每個品系有8個用A-H標記的亞品系。品系12未產生轉化植株，認為是野生型。T2代植株有比T1代植株更大的表型。產生T3代的品系將被詳細討論。根據轉入的生長AteIF-5A基因的表達水平來分組描述正義生長AteIF-5A植株T2代的性質。從每個品系的莖生葉提取蛋白并進行蛋白質雜交印跡(圖20)。因為在同一品系內A-H這些亞品系的大多數有相似表型，所以只對每個品系的亞品系A進行蛋白質雜交印跡分析以從總體上概括生長AteIF-5A的表達水平。從野生型植株和空白二元載體轉化植株的莖生葉提取的蛋白作為凝膠電泳的對照。這些亞品系中觀察到的表達水平可分類為高(品系1、2、3、10和13)、中(品系4、5、6和15)、低(品系7、8、9和14)或無表達(品系11和16，以及野生型和空白載體對照株)。也用抗衰老-誘導AteIF-5A和抗損傷-誘導AteIF-5A的抗體為探針作印跡。蛋白質雜交印跡結果顯示正義生長AteIF-5A植株中表達提高的是由于生長AteIF-5A，而未見另兩種AteIF-5A同工型的總體增量調節，因為未檢測到可觀數量的任一種AteIF-5A同工型。這也證明了同工型特異抗體的特異性是可以接受的。根據表型和生長AteIF-5A表達水平(見表1對每個品系表型的概要)來選擇產生T3代種子的正義生長AteIF-5A品系。每種表達水平組中各選出兩個品系。這些將被使用的品系為1A、2D、4D、15A、8D、9H、11C和16C。根據圖20中的蛋白雜交印跡結果，品系1高水平表達生長AteIF-5A。該品系植株相比野生型植株有大而深綠色的蓮座，而且葉子相當圓(圖21)。品系1的蓮座也有渦旋狀表型，其上的葉都向同一方向卷曲。這些正義生長AteIF-5A植株比野生型植株稍晚些抽苔。品系2也高水平表達生長AteIF-5A，但與品系1不同的是這些植株小且黃(圖22)。品系2也比野生型和空白載體對照植株稍晚些抽苔，并產生較小的花苔(約一半大小)和較少的長角果。在中等水平表達品系中，品系4表現出與野生型相似的葉子/蓮座大小和花苔大小，雖然它比野生型和空白載體對照株早幾天抽苔。第二個中等水平表達生長AteIF-5A的是品系15。這些植株如同品系14，與野生型非常相似，但是蓮座所占區域大于對照組(圖23和24)，蓮座的葉的尖端也比對照組更圓。但是它的花苔未表現出任何與眾不同的表型。低水平表達品系中準備用來產生T3代的為品系8和9。品系8與對照組植株相比有很大的葉子和蓮座(圖25)，葉子也比對照組植株更寬、更圓。而抽苔時間，花苔大小和數目似乎與對照組一致。正義生長AteIF-5A品系9的葉子形狀與品系8相似，但遠比品系8的黃而且小(圖26)。如同品系2(高水平表達品系之一)，這些品系的植株表現出發育障礙和更短的花苔，但不同于品系2的是品系9約與對照組同時抽苔。根據蛋白質雜交印跡結果(圖20)，正義生長AteIF-5A植株的兩個品系11和16沒有增量調節表達生長AteIF-5A。這可能歸咎于轉基因和內源基因的共抑制。盡管這些植株看起來與對照組相像(圖27和28)，但由于幾個原因相信轉基因被整合到品系11和16植株的基因組中。首先，通過卡那霉素MS平板的選擇性說明它們確實有卡那霉素抗性。其次，品系16的蓮座、花苔和葉(圖28)比對照組至少大50％。但最有力的證據是它們產生的T3代種子的大小和組成。測量所有正義生長AteIF-5A植株的T2代品系的T3種子。每個品系種子均被拍照(圖29中突出顯示了最大和最小者)，用照片上的測微計為標度使用計算機(insilico)測量大小。對于每個品系和對照組，測量視野中最大的10粒種子并用以計算。發現高水平表達的品系2的種子是野生型和空白載體對照株的3倍大。而表達水平最低的品系(品系11和16)有一些最小的種子，大小僅為野生型和空白載體對照株的88％。每個品系種子的平均大小以nm3為單位(圖30)表示。由于擬南芥的種子近似橢圓體，計算時使用橢圓體體積計算公式。測得的對照組種子大小與Boyes等人(2001)確定并發表的指導方針是一致的。由單個種子大小的測量值和種子總產量(重量和體積)，計算單個種子的平均重量并繪圖(圖31)。可見大多數品系的種子大小都與對照組不同，但在單個種子重量上有與對照組相同的趨勢。事實上，當用種子重量對種子大小(體積)作圖時，關系基本是線性的，R2＝0.7142。有5個品系例外要么是密度提高(其中3個)，要么是密度減小(其中兩個)。密度提高的品系之一為8D，將用來產生T3代。所有T2植株的種子總產量變化很大，幾乎無趨勢。然而值得注意是一個中等水平表達正義生長AteIF-5A的品系4D，它的種子產量最大(重量和體積都是)。事實上，它的種子產量比對照組高2.5倍并用來產生T3代。T3種子按前所述種于選擇平板上。品系1A、2D、4D、15A、8D、9H、11C和16C被移植到土中。正義生長AteIF-5A植株的品系1的其它幾個亞品系的種子未發芽。品系2H也沒有發芽，它是未發芽亞品系種子中最大的。來自品系11(發生共抑制的品系之一)的植株沒有這個年齡典型植株那樣健康。產自它的種子也是所測種子中最小的種子之一。可見這些品系仍然在分離，因為所有品系仍然有無卡那霉素抗性的植株和產生不發芽種子的植株。這很可能是轉基因的副作用而非由技術引起，因為相同方式處理的對照組種子全發芽。實施例22擬南芥衰老-誘導eIF-5A的鑒定制備全長擬南芥衰老-誘導eIF-5A的方法學基于幾種植物eIF-5A基因的簡并引物與T3&T7載體引物組合用以從擬南芥cDNA文庫里PCR擴增出eIF-5A基因。具體的說，eIF-5A基因的5’區域通過使用T3引物(定位于載體中eIF-5A基因的上游)和一個下游(反向)簡并引物進行PCR擴增得到。同樣的，3’區域通過使用T7引物(定位于文庫載體中eIF-5A基因的下游)和一個下游(正向)簡并引物進行PCR擴增得到。全長eIF-5A基因源自對該基因5’和3’區域的序列對比分析。每個PCR反應有2-3個主要產物。這些片段被克隆到pBluescript質粒并測序。依靠Genbank進行作圖分析來鑒定eIF-5A基因陽性PCR片段。對擬南芥只有一個上游和下游陽性eIF-5A基因PCR片段。根據5’和3’PCR片段測序結果來設計特異的5’和3’末端引物。通過使用特異的5’和3’末端引物和相應cDNA文庫為模板來擴增得到全長擬南芥eIF-5A基因。所得全長基因通過測序被進一步確認。最后，我們克隆到一個擬南芥eIF-5A同工型基因，它被稱作衰老-誘導eIF-5A。T3和T7引物T35’-ATTAACCCTCACTAAAG-3’T75’-AATACGACTCACTATAG-3’擴增擬南芥eIF-5A基因的簡并引物正向(上游)引物5’-AAARRYCGMCCYTGCAAGGT-3’反向(下游)引物5’-TCYTTNCCYTCMKCTAAHCC-3’將全長衰老-誘導eIF-5A基因的反義序列亞克隆到pKYLX71載體(含SAG12啟動子)為擬南芥衰老-誘導eIF-5A反義全長構建體使用的特異(同源)引物正向全長衰老-誘導eIF-5A引物(30mer)5’-CCGAGCTCCTGTTACCAAAAAATCTGATCC-3’(注下劃線部分為SacI識別位點，用以將PCR片段的5’末端連接到pBluescript的多克隆位點(MCS))。反向全長衰老-誘導eIF-5A引物(36mer)5’-ACCTCGAGCGGCCGCAGAAGAAGTATAAAAAACCATC-3’(注下劃線部分為NotI識別位點，用以將PCR片段連接到pBluescript的多克隆位點(MCS))。在pBluescript的多克隆位點(MCS)中，SacI和NotI位點的排列方向必須保證基因以反義方向插入(也就是NotI位點在SacI的上游)。實施例23使用SAG12啟動子反義表達全長擬南芥衰老-誘導eIF-5A實驗證據表明一套“衰老-相關基因”(″senescence-associatedgenes″)或SAG的轉錄在衰老起始時提高(Lohman等1994；Weaver等1998)。事實上，衰老首先表現于新mRNA的合成而且很可能減量調節其它mRNA，這提示選擇性合成蛋白對衰老來說是必需的(Nooden，1988)。Watanabe和Imaseki(1982)使用體外翻譯并隨后以凝膠電泳，來探測發生在可譯mRNA群體上的改變，從而首先證明衰老程序伴隨著基因表達的改變。這項最早的工作和后續的體外翻譯蛋白分析揭示在衰老過程中，大部分mRNA量顯著減少而其余可譯mRNA量則增加(WatanabeandImaseki，1982；DaviesandGrierson，1989；BeckerandApel，1993Buchanan-Wollaston，1994；Smaretal，1995)。對來自衰老葉組織的mRNA的cDNA文庫的差示篩選也證明在衰老過程中許多基因表達受到減量調節，而其它基因受到增量調節。已經從多種植物中鑒別出SAG，包括擬南芥(Henseletal.1993；Taylor等1993；Lohman等1994；Oh等1996)、蘆筍(King等1995)、大麥(BeckerandApel，1993)、歐洲油菜(Brassicanapus)(Buchanan-Wollaston，1994)、玉米(Smart等1995)、蘿卜(AzumiandWatanabe，1991)和番茄(DaviesandGrierson，1989；Drake等1996)。可從形態學上鑒別衰老，如葉片特征性模式的變黃，從葉邊緣開始最終到達葉脈(Weaker等1998)。擬南芥蓮座葉的明顯衰老表現在發芽后的約21天，同時伴隨SAG12的劇烈增量調節(NohandAmasino，1996)。SAG12是最接近自然衰老的特異性基因，因而被稱作衰老標志。SAG在嫩葉沒有可探測到的表達，而在～20％變黃后的較老葉子中被誘導，但是不被不能誘導葉子變黃的處理所誘導(Weaker等1998)。它高度特異于自然衰老過程，可用以下事實解釋SAG12的產物與半胱氨酸蛋白酶相似，并且可能參與衰老過程中的蛋白質周轉(proteinturnover)(Lohman等1994；Weaker等1998)。轉基因株的描述生產轉基因擬南芥植株，表達轉入的全長衰老-誘導eIF-5A反義序列，這個反義序列處于SAG12(特異于葉衰老)的啟動子控制下。這個啟動子在葉自然衰老起始時被活化，約為發芽后21d(NohandAmasino，1996)。但在環境壓力誘導的衰老事件中不被活化。在這個時間點，轉基因植株表現出全長衰老-誘導eIF-5A被抑制的表型。在轉基因擬南芥反義全長衰老-誘導eIF-5A株的3-8周齡采集蓮座葉。制備純合SAG12啟動子控制的反義全長衰老-誘導eIF-5A的轉基因擬南芥方法學將SAG12-反義全長衰老-誘導eIF-5A構建體插入pKYLX71首先，用EcoRI和HindIII雙酶切pKYLX71質粒以除去雙35S啟動子，所得粘末端用Klenow酶處理以得到平末端。然后連接不含該啟動子的pKYLX71以再次環化質粒。第二步，用以下描述的含SacI和XbaI位點的引物從基因組DNAPCR擴增得到擬南芥SAG12啟動子。然后使用限制性酶SacI和XbaI酶切并用T4DNA連接酶將啟動子序列插入到pBluescript的多克隆位點(MCS)。正向SAG12引物為5’-GGCCGTCGACGATATCTCTTTTTATATTCAAAC-3’(下劃線部分為SacI識別位點，用以將PCR片段的5’末端連接到pBluescript的多克隆位點(MCS)的SacI位點上)。反向SAG12引物5’-CGTCTAGACATTGTTTTAGGAAAGTTAAATGA-3’(下劃線部分為XbaI識別位點，用以將PCR片段的5’末端連接到pBluescript的多克隆位點(MCS)的XbaI位點上)。第三步，為構建pBluescript-SAG12反義全長衰老-誘導eIF-5A構建體，使用如下描述的含SacI和NotI位點的引物，從擬南芥cDNA文庫PCR擴增得到全長衰老-誘導eIF-5A基因，并如上文描述亞克隆到pBluescript-SAG12上。注意，pBluescript-SAG12載體的MCS中的SacI和NotI位點方向必須使基因以反義方向亞克隆入(也就是NotI位點在SacI的上游)。正向全長衰老-誘導eIF-5A引物5’-CCGAGCTCCTGTTACCAAAAAATCTGTACC-3’(注下劃線部分為SacI識別位點，用以將PCR片段的5’末端連接到pBluescript-SAG12的多克隆位點(MCS))。反向全長衰老-誘導eIF-5A引物5’-ACCTCGAGCGGCCGCCAGAAGAAGTATAAAAACCATC-3’(下劃線部分為NotI識別位點，用以將PCR片段連接到pBluescript-SAG12的多克隆位點(MCS))。最后，通過用SacI和XhoI消化pKYLX71，也用SacI和SalI從pBluescript-SAG12消化SAG12全長衰老-誘導eIF-5A盒，在二元載體pKYLX71中構建所需構建體。XhoI和SalI形成的粘末端部分互補，因此這兩個消化得到結構的突出端(具體的是XhoI和SalI、SacI和SacI)能夠在T4連接酶的作用下連接起來，構成最終構建體(pKYLX71上的SAG12反義衰老-誘導eIF-5A)。轉化和T1種子采集在大腸桿菌DHα細胞中擴大培養pKYLX71-SAG12反義eIF-5A構建體，隨后分離并電穿孔轉入土壤桿菌感受態細胞。然后將土壤桿菌轉化菌株滲入4.5周齡的擬南芥野生型植株，所得滲入植株記為“T0”株，它們被培養到生命末期。采集種子，記為T1種子。用10個卡那霉素平板(1/2MS鹽、50μg/ml卡那霉素)篩選T1種子，以野生型作為對照，只有含pKYLX71-SAG12反義eIF-5A構建體的種子可以存活并在卡那霉素(K50)培養基上生長。從這些平板中選出24株T1幼苗并種于土中。從T1轉基因植株采集的種子記為T2種子。每株幼苗產生一個植株品系(#1＝含一植株的一個品系，#2＝含一植株的一個品系，等等)表型篩選和鑒定一旦鑒別出卡那霉素抗性的T1種子，就連續長出T2，T3和T4代植株。通過在K50培養基上篩選種子，使區別開繼承了遺傳構建體的植株和具有純合的該構建體的植株成為可能。當在罐中培養時，在T3代植株中觀察到一個表現發育障礙表型的品系。但是，當同樣的種子組在相同條件下再次培育時，未見到這個表型。根據種子高產，從24棵T1代植株中選出4個品系(品系T2.14、T2.18、T2.19和T2.23)種于K50培養基平板上，用野生型種子作為對照。每個品系約有75％的種子在K50培養基上存活并按外形分成小、中、大三類。每個品系的小、中、大幼苗從平板上轉移到土中。在溫室條件下，小幼苗恢復不如中和大幼苗快。在第6周，小幼苗剛開始有抽苔征兆，而其它植株已經抽苔和開花。共有6棵T2代植株(來自共3個品系×8棵＝96棵轉基因植株)表現明顯的抽苔推遲，被認為是“晚花苔”(latebolt)株。這些植株的種子產量也顯著低于其它轉基因植株。從96棵T2代植株中選出3個品系以產生T3代植株(品系T3.19.S8和T3.14.L7是晚抽苔株；T3.23.S3是非晚抽苔株)。當種于K50培養基上時，這些植株表現出純合性存活。移植13株幼苗到罐中(每罐10株)。在這組植株中，可觀察到T3.14.L7品系的一個醒目的矮小表型。采集T4代種子，并且觀察到該品系有更低的種子產量。在品系T3.19.S8中觀察到一個密集生長表型(長角果密集生長，有更多的枝)，而在T3.23.S3中觀察到與野生型相似的表型。比較了來自3個轉基因品系的種子大小，但沒能找到顯著的統計差異。也進行了葉綠素水平分析，但沒有發現與野生型對照的顯著差異。品系T3.19.S8、T3.14.L7和T3.23.S3的T4代種子用K50培養基篩選以得到下一代植株。與死亡的野生型種子相比，篩選結果顯示這些種子繼承基因構建體的證據(在平板上均綠色生長)。但是當幼苗移植到單獨的平臺上時，沒有矮小表型出現，這提示轉入的反義eIF-5A已經丟失。最后，收集所有T5代植株的種子并在K50平板上篩選，它們表現出對卡那霉素的抗性。現正進行研究以確認轉入的反義序列已經丟失和T4代植株中轉入的基因不成對。從母系T2.14、T2.19和T2.23中選出8個子品系，并在K50培養基平板上用野生型種子作為對照進行篩選。根據低種子產量選出3個品系T3.14.S8、T3.14.L8和T3.23.S1。另5個選出品系為T3.18.S7、T3.18.S2、T3.19.S1、T3.18.S5和T3.23.S6。在K50培養基平板上篩選的所有品系均表現出純合性存活，而T3.14.L8、T3.14.S8和T3.23.S1的幼苗表現出雜合性存活。品系T3.14.L8和T3.14.S8的幼苗存活，表現白色上有綠色脈管組織，而T3.23.S6則表現為完全深綠色存活。這些幼苗被選出進行移植。共有來自每個品系的28株幼苗被移植到生長單元，在溫室條件下生長。在第3周，除了品系T3.14.L8和T3.23.S1的所有植株和T3.14.S7、T3.14.S2、T3.19.S1、T3.19.S5、T3.23.S1和T3.23.S6中的一些植株外，所有植株開始抽苔。在T3.14.S8和T3.14.L8中觀察到不規則的蓮座葉外形(第二對葉變長的表型)。第5周，在T3.18.S7和T3.23.S6中觀察到另外的不規則葉外形(蓮座葉增多和皺邊緣蓮座葉的表型)。第7周，在T3.18.S7、T3.18.S2、T3.19.S1、T3.19.S5、T3.23.S1、T3.23.S6中觀察到紡錘形莖和無延長莖的表型。分別在第5和第6周采集所有植株的第一和第二莖生葉，以研究衰老-誘導eIF-5A蛋白的表達。實施例24產氧量的確定采集葉子，測重量前先測量面積。使用1ml冷脫氣研磨緩沖液、研缽和研杵將葉子仔細磨碎。隨后將勻漿轉移到一個EP管中并立即置于冰上。分離番茄葉勻漿還需要用Miracloth膜過濾。所有樣品均取50μl勻漿，加入到盛有5ml研磨緩沖液和25μlDCPIP(2，6-二氯靛酚)的10ml試管中。充分振蕩，然后一組樣品置于一對燈光照下15min，另一組置于黑暗15min。溫育15min后，向兩組樣品中均加入50μlDCMU(3-(3，4-二氯苯基)-1，1-二甲基脲)以停止反應，隨后用微量離心機以14,000g離心2min。以研磨緩沖液為空白對照，讀取所得上清液在590nm處的吸光度。該分析所用的摩爾消光系數為16×103，也就是1mol/L的濃度變化所改變的溶液吸光度為16×103μmolDCPIP減少(/h/ml)，即＝(吸光度差值)×[1/16×103(umol/L)]×[反應體積(ml)]×[106(ml/L)]×[60(min/h)/反應時間(min)]×[1/樣品體積(ml)]。每減少2molDCPIP，產生1molO2。參考文獻AllenJ.F.andHolmesN.g.1986.ElectronTransportandRedoxTitrationsinPhotosynthesisEnergyTransduction.EditedbyM.F.Hipkins&N.R.Baker，IRLPress，OxfordPp107-108.實施例25淀粉含量的確定使用改進的Lustinec等人所提出的方法來確定番茄莖中的淀粉含量。使用玻璃纖維紙來確定植物組織中的淀粉、支鏈淀粉、直鏈淀粉的含量。使用Omnimixer(每5s12reps)，和3倍體積的水使番茄莖組織勻漿化。隨后用Polytron勻漿機處理30s。勻漿分裝成10ml一份，分析前保存于-20℃。分析時，取10ml勻漿解凍并與等體積高氯酸(HClO4，70％w/w)混合，室溫溫育20min以溶解淀粉。同時準備一些馬鈴薯淀粉溶液(濃度范圍為0.1-1.0mg/ml)以得到標準曲線。攪拌勻漿(或馬鈴薯淀粉標準溶液)，并使用一個真空燒瓶和一臺吸氣器，將勻漿于WhatmanGF/A玻璃微纖維紙(直徑9.0cm)上過濾。每1ml濾液與3ml碘溶液(8mMI2、17mMKI、514mMNaCl)混合，4℃溫育30min以形成淀粉-碘沉淀。在WhatmanGF/A玻璃微纖維紙(直徑9.0cm)上收集沉淀，使用一個真空燒瓶和一臺吸氣器。然后如下洗滌并過濾10ml碘溶液B(83mMI2、180mMKI、8％高氯酸(HClO4))一次，5ml乙醇-NaCl液(67％乙醇、342mMNaCl)一次，3ml乙醇-NaOH液(67％乙醇、250mMNaOH)兩次。一旦乙醇揮發干凈，從吸氣器移走微纖維紙并插入到有可調蓋的玻璃管中。取9ml硫酸(0.75MH2SO4加入這個玻璃管，然后將管子置于沸水浴30min。三次吸取洗提液每次1ml，加入到玻璃試管中，向每只試管加入1ml5％苯酚并迅速加入濃硫酸5ml。旋轉試管并于室溫溫育30min以充分顯色。同時準備分光光度計空白樣將1ml0.75M硫酸和1ml5％苯酚混合，并迅速加入5ml濃硫酸。空白同樣于室溫混合30min。在480nm處用空白校準光度計，測量所有樣品和馬鈴薯淀粉標準溶液并記錄結果。通過馬鈴薯淀粉標準溶液準備標準曲線，來讀出每個樣品的淀粉含量。實施例26用擬南芥正義衰老-誘導eIF-5A(AteIF-5A)和番茄正義衰老-誘導eIF-5A基因各自轉化擬南芥哥倫比亞生態型植株。這些基因在轉基因植株整個生命周期中組成型表達。這些植株的開花莖的木質部發育明顯提高。見圖89-94。轉基因植株和對照植株的種子種于1/2MS培養基瓊脂平板上，置于生長室在22℃，80％rh，16h光照/天條件下生長9d。隨后，將幼苗移植到有32個生長單元的平臺上的商品土壤中，生長48d，維持如上條件。選出主要開花莖進行顯微觀察。在蓮座上方2mm內從主莖上橫切，將切面用間苯三酚-HCl染色。我們發現，莖的木質部在這個年齡達到發育的最高峰。對比了轉基因植株和對照植株的木質部大小(切面面積)。此外，也測了轉基因植株和對照的韌皮部和木髓。組織面積如下測量。橫切面用Zeiss顯微鏡拍照，顯微照片用Photoshop數字化處理。這些照片打印在紙上，并切下不同組織。它們的面積用面積測量計加以測量。為計算每個組織的實際面積，使用以下公式實際面積＝(單個組織的紙面面積)/(放大倍率)2。結果顯示衰老-誘導eIF-5A也涉及聯系于木質部發生作用的細胞程序性死亡。在擬南芥中組成性的反義抑制衰老-誘導AteIF-5A，減小了開花莖的密集度，也減小了木質部細胞層的數目。與此對比，擬南芥或番茄衰老-誘導eIF-5A組成性過量表達的植株的莖平均比相應野生型植株密1.7倍，而且開花莖每個橫切面的總木質部面積是野生型植株的2倍。具有過量表達的轉基因植株也有顯著提高的蓮座葉生物量，并比野生型株生長快，這可能反映了營養攝取的增強。當番茄衰老-誘導eIF-5A在擬南芥中過量表達時，也可觀察到相同的表型。這些結果共同表明衰老-誘導eIF-5A不僅調節葉和花的衰老，也參與木質部發生。實施例27脫氧羥丁賴氨酸合酶的抑制推遲大氣環境下預包裝萵苣切段的褐變可買到的有包裝的沙拉通常保存在氣調(controlledatmosphere)條件下，其中氧含量水平較大氣濃度被大幅度降低，以延長產品的儲藏時間。最普通的預包裝沙拉的腐敗征兆為萵苣切開面的褐變。盡管氣調包裝可推遲褐變，但這也可導致香氣和滋味的變淡。在這項研究里，脫氧羥丁賴氨酸合酶(DHS)的減量調節表現了可作為推遲萵苣切面褐變可選策略的潛力。DHS催化真核起始因子5A(eIF-5A)的活化，eIF-5A作為一個核-質穿梭蛋白對mRNA進行選擇。DHS涉及萵苣切面的褐變，因為對DHS表達的抑制(通過反義技術)導致大氣條件下褐變起始的顯著推遲。具體的，80％的野生型萵苣段在被切下后6d顯示褐變，而在來自5個處于表型分離過程中的品系的轉基因植株中，平均僅有27％的萵苣段在相同時間褐變，甚至有一些植株不表現褐變。見圖51，53。實施例28油菜脫氧羥丁賴氨酸合酶的抑制提高種子產量脫氧羥丁賴氨酸合酶(DHS)催化從無活性真核起始因子5A(eIF-5A)轉化為活性形式的兩個反應的第一個，而活性eIF-5A促進翻譯。從衰老葉cDNA文庫中分離一個油菜DHS編碼基因的全長cDNA克隆。通過在花椰菜鑲嵌病毒(CaMV-35S)啟動子控制下反義表達油菜DHScDNA的3’UTR，在油菜轉基因植株中抑制DHS。反義表達該轉入基因的植株的葉DHS蛋白水平下降，并表現出葉的自然衰老的推遲。DHS表達抑制也使蓮座葉變大了1.5-2倍，提高種子產量90％。油菜中這些抑制DHS引起的多種影響與前文所得的擬南芥的實驗結果一致(Wang等2003，PlantMol.Biol.521223-1225)，這提示這個蛋白在植物生長和衰老中扮演重要角色。實施例29通過抑制物和反義技術抑制DHS延長康乃馨的花瓶保鮮時間從康乃馨花瓣中分離編碼DHS的全長cDNA克隆(AF396079)。DHS催化從無活性真核起始因子5A(eIF-5A)轉化為活性形式的兩個反應的第一個。RNA雜交印跡技術分析揭示DHS表達相關于康乃馨花瓣衰老。用DHS反應抑制物處理采摘下的康乃馨花，包括二氨基丁烷(腐胺)，二氨基丙烷，二氨基己烷，二氨基辛烷和精胺，如此延長花的保鮮時間83％。為了更好的評估DHS在康乃馨花衰老中的作用，通過土壤桿菌轉化菌株將組成性花椰菜鑲嵌病毒雙35S啟動子控制下的康乃馨DHScDNA的3’UTR反義序列導入轉基因植株，以抑制蛋白的表達。分析三個DHS表達減少的轉基因植株品系，發現它們比野生型有相對較長的花瓶保鮮時間。事實上，其中一個品系的花瓶保鮮時間延長程度大于100％。這些發現表明DHS在花的衰老中扮演重要角色。實施例30GA3處理擬南芥以挽回抑制脫氧羥丁賴氨酸合酶(DHS)引起的抽苔推遲的表型脫氧羥丁賴氨酸合酶(DHS)是一種普遍存在的真核起始因子5A(eIF-5A)翻譯后活化所必需的酶，它是正常植物生長和發育的基本要素。通過在衰老特異SAG12啟動子控制下在擬南芥中反義表達全長擬南芥DHScDNA，來抑制DHS。表達轉入基因的植株的葉中DHS蛋白水平下降，并表現出抽苔推遲和葉的衰老起始的顯著推遲(約2-5周)。花苔(bolter)也變短，盡管這并不引起生物量或種子產量的降低。用GA3處理轉基因植株可反轉抽苔推遲表型。通過在GCT控制下反義表達DHS得到一個相似表型，GCI是一個糖皮質激素-誘導啟動子，可被地塞米松(DEX)活化。GA3處理再次反轉這個表型，也就是說，GA3處理過的轉基因植株抽苔正常，花苔大小正常，葉的衰老起始不推遲。這些結果共同證明DHS通過在擬南芥中活化三個eIF-5A同工型中的一個或更多，影響了GA代謝。參考文獻Azumi，YandWatanabe，A(1991)Evidenceforasenescence-associatedgeneinducedbydarkness.PlantPhysiol95577-583.BeckerW，ApelK(1993)Differencesingeneexpressionbetweennaturalandartificiallyinducedleafsenescence.Planta18974-79Bevec，D.，Jaksche，H.，Oft，M.，Wohl，T.，Himmelspach，M.，Pacher，A.，Schebesta，M.，Koettnitz，K.，Dobrovink，M.，Csonga，R.，Lottspeich，F.，andHauber，J(1996)InhibitionofHIV-1replicationinlymphocytesbymutantsoftheRevcofactorofeIF-5A.Science2711858-1860.Bevec，D，andHauber，J(1997)Eukaryoticinitiationfactor5AactivityandHIV-1Revfunction.BiolSignals6124-133.Bleecker，A.B.，andPatterson，Se(1997)LastexitSenescence，abscission，andmeristemarrestinArabidopsis，PlantCell.91169-1179.Buchanan-Wollaston，V(1997)Themolecularbiologyofleafsenescence.JExpBot48181-191.Buchanan-WollastonV(1994)IsolationofcDNAclonesforgenesthatareexpressedduringleafsenescenceinBrassicanapus.PlantPhysiol105839-846Chen，KY，andLiu，AYC.(1997)Biochemistryandfunctionofhypusineformationoneukaryoticinitiationfactor5A.BiolSignals6105-109.DaviesKM，andGriersonD(1989)IdentificationofcDNAclonesfortomato(LycopersiconesculentumMill.)mRNAsthataccumulateduringfruitripeningandleafsenescenceinresponsetoethylene.PlantCell17973-80.DrakeR，JohnI，FarrellA，CooperW，SchuchW，andGriersonD(1996)IsolationandanalysisofcDNAsencodingtomatocysteineproteasesexpressedduringleafsenescence.PlantMolBiol30755-767Gan，SandAmasino，RM(1997).Moleculargeneticregulationandmanipulationofleafsenescence.PlantPhysiol113313-319.Gan，SandAmasino，RM(1995)Inhibitionofleafsenescencebyautoregulatedproductionofcytokinin.Science2701986-1988.Hanauske-Abel，H.M.，Hanauske，A.-R.，Popowicz，A.M.，Lalande，M.，andFolk，J.E.InhibitionofG1-Stransitionbyinhibitorsofdeoxyhypusinehydroxylation.BiochemBiophysActa1221115-124，1994.Henderson，BR，andPercipalle，P.(1997)InteractionsbetweenHIVRevandnuclearimportandexportfactorstheRevnuclearlocalizationsigualmediatespecificbindingtohumanimportin-beta.JMolBiol274693-707.Hensel，L.L.，V.Grbic，D.B.Baumgarten，andA.B.Bleecker.(1993).Developmentalandage-relatedprocessesthatinfluencethelongevityandsenescenceofphotosynthetictissuesinArabidopsis.PlantCell5553-564.Jakus，J.，Wolff，E.C.，Park，M.H.，andFolk，J.E.Featuresofthespermidine-bindingsiteofdeoxyhypusinesynthaseasderivedfrominhibitionstudieseffectiveinhibitionbybis-andMono-guanylateddiaminesandpolyamines.JBiolChem26813151-13159，1993.Kang，HA，andHershey，JWB(1994)EffectofinitiationfactoreIF-5AdepletiononproteinsynthesisandproliferationofSaccharomycescerevisiae.JBiolChem2693934-3940.Katahira，J，Ishizaki，T，Sakai，H，Adachi，A，Yamamoto，K，andshida，H.(1995)EffectsoftranslationinitiationfactoreIF-5AonthefunctioningofhumanT-cellleukemiavirustypeIRexandhumanimmunodeficiencyvirusRevtransdominantlybyaRexmutantdeficientinRNAbinding，JVirol693125-3133Kemper，WM，Berry，KW，andMerrick，WC(1976)PurificationandpropertiesofrabbitreticulocyteproteinsynthesisinitiationfactorsM2BαandM2Bβ.JBiolChem2515551-5557.Lohman，KN，Gan，S，John，MCandAmasino，R(1994)MolecularanalysisofnaturalleafsenescenceinArabidopsisthaliana.PhysPlant92322328.Lipowsky，G.，Bischoff，F.R.，Schwarzmaier，P，Kraft，R.，Kostka，S.，Hartmann，E.，Kutay，U.，andGorlich，D.(2000)Exportin4amediatorofanovelnuclearexportpathwayinhighereukaryotes.EMBOJ.194362-4371.Liu，YP，Nemeroff，M，Yan，YP，andChen，KY.(1997)Interactionofeukaryoticinitiationfacto4Awiththehumanimmunodeficiencyvirustype1RevresponseelementRNAandU6snRNArequiresdeoxyhypusineorhypusinemodification.BiolSignals6166-174.Marinez-Zapater，JMandSalinas，J(1994)ArabidopsisProtocols.HumanPress；p.197.Mattaj，LW.，andEnglmeier，L.(1998)NucleocytoplasmictransportThesolublephase.AnnuRevBiochem67265-306Mehta，AM，Saftner，RA，Mehta，RA，andDavies，PJ(1994)Identificationofposttranslationallymodified18-kilodaltonproteinfromriceaseukaryotictranslationinitiationfactor5A.PlantPhysiol1061413-1419.Noh，Y-SandAmasino，R(1999)Identificationofapromoterregionresponsibleforthesenescence-specificexpressionofSAG12.PlantMolBiol41181-194.Noodén，LD，Guaimét，JJandJohn，I(1997)Senescence，mechanisms.PhysiolPlant101746-753.Noodén，LDandLeopold，AC(eds)(1988)Thephenomenaofsenescenceandaging.SenescenceandAginginPlants.AcademicPresspp.1-50.Ober，DandHartmann，T(1999)Deoxyhypusinesynthasefromtobacco.JBiolChem27432040-32047.OhSA，LeeSY，ChungIK，LeeCH，andNamHG(1996)Asenescence-associatedgeneofArabidopsisthalianaisdistinctivelyregulatedduringnaturalandartificiallyinducedleafsenescence.PlantMolBiol30739-754Page，DRandGrossniklaus，U(2002)TheartanddesignofgenticscreensArabidopsisthaliana.NatureReviewsGenetics3124-136Park，MH，Joe，YA，andKangKR(1998)DeoxyhypusinesynthaseactivityisessentialforcellviabilityintheyeastSaccharomysesCerevisiae.JBiolChem161677-1683.Park，MH，Wolff，EC，Lee，YBandFoIK，JE(1994)AntiproliferativeeffectsofinhibitorsofdeoxyhypusinesynthaseinhibitionofgrowthofChinesehamsterovarycellsbyguanyldiamines.JBiolChem26927827-27832.Park，M.H.，WolffE.C.，andFolkJ.E.(1993)Hypusineitspost-translationalformationineukaryoticinitiationfactor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GluGlyAspLeuGlyLysGluIleGluGlnLysTyr151015Asp<210>69<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>69aaaggaatgacttccagctgacctgtctc29<210>70<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>70aatcagctggaagtcattcctcctgtctc29<210>71<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>71aagatcgtcgagatgtctactcctgtctc29<210>72<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>72aaagtagacatctcgacgatccctgtctc29<210>73<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>73aaggtccatctggttggtattcctgtctc29<210>74<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>74aaaataccaaccagatggacccctgtctc29<210>75<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>75aagctggactcctcctacacacctgtctc29<210>76<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>76aatgtgtaggaggagtccagccctgtctc29<210>77<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>77aaagtcgaccttcagtaaggacctgtctc29<210>78<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>78aatccttactgaaggtcgactcctgtctc29<210>79<211>20<212>RNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>79aagcuggacuccuccuacac20<210>80<211>21<212>RNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>80aaacacauccuccucaggucg21<210>81<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>81aaaggaatgacttccagctga21<210>82<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>82aagatcgtcgagatgtctact21<210>83<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>83aaggtccatctggttggtatt21<210>84<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>84aagctggactcctcctacaca21<210>85<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>85aaagtcgaccttcagtaagga2權利要求1.一種分離的擬南芥損傷-誘導eIF-5A。2.一種分離的番茄損傷-誘導eIF-5A。3.一段擬南芥損傷-誘導eIF-5A的反義多核苷酸。4.一段番茄損傷-誘導eIF-5A的反義多核苷酸。5.一種用于轉化植物的表達載體，該表達載體包含權利要求3的反義多核苷酸和操作性連接在該反義多核苷酸上的調節序列，用以提供所述反義多核苷酸的轉錄。6.一種用于轉化植物的表達載體，該表達載體包含權利要求4的反義多核苷酸和操作性連接在該反義多核苷酸上的調節序列，用以提供所述反義多核苷酸的轉錄。7.一種抑制植物體內內源損傷-誘導eIF-5A表達的方法，該方法包括將載體整合進植株的至少一個細胞的基因組內，該載體包含損傷-誘導eIF-5A的反義多核苷酸和操作性連接在該反義多核苷酸上的調節序列，用以提供所述反義多核苷酸的轉錄，由此所述反義多核苷酸的所述轉錄抑制該植株體內內源損傷-誘導eIF-5A的表達。8.權利要求7的方法，其中所述抑制表達賦予植物體比野生型植株更高的對病原體入侵引起的致病損害的抗性。9.一種分離的擬南芥生長eIF-5A。10.一種分離的番茄生長eIF-5A。11.一種分離的油菜生長eIF-5A。12.一種用于轉化植物的表達載體，該表達載體包含正義方向的生長eIF-5A多核苷酸和操作性連接在該多核苷酸上的調節序列，用以提供所述多核苷酸的轉錄。13.一種提高植物體內生長eIF-5A表達的方法，該方法包括將載體整合進植株的至少一個細胞的基因組內，該載體包含生長eIF-5A的多核苷酸和操作性連接在該多核苷酸上的調節序列，用以提供所述多核苷酸的轉錄，由此所述多核苷酸的所述轉錄提高該植株體內生長eIF-5A的表達。14.一種分離的油菜DHS。15.一種分離的苜蓿DHS。16.一種分離的香蕉DHS。17.一種分離的三角葉楊DHS。18.一段油菜DHS的反義多核苷酸。19.一段苜蓿DHS的反義多核苷酸。20.一段香蕉DHS的反義多核苷酸。21.一種用于轉化植物的表達載體，該表達載體包含權利要求18的反義多核苷酸和操作性連接在該反義多核苷酸上的調節序列，用以提供所述反義多核苷酸的轉錄。22.一種用于轉化植物的表達載體，該表達載體包含權利要求18的反義多核苷酸和操作性連接在該反義多核苷酸上的調節序列，用以提供所述反義多核苷酸的轉錄。23.一種用于轉化植物的表達載體，該表達載體包含權利要求20的反義多核苷酸和操作性連接在該反義多核苷酸上的調節序列，用以提供所述反義多核苷酸的轉錄。24.一種抑制植物體內內源DHS表達的方法，該方法包括將載體整合進植株的至少一個細胞的基因組內，該載體包含DHS的反義多核苷酸和操作性連接在該反義多核苷酸上的調節序列，用以提供所述反義多核苷酸的轉錄，由此所述反義多核苷酸的所述轉錄抑制該植株體內內源DHS的表達。25.一種通過抑制DHS表達來推遲萵苣褐變的方法，該方法包括將載體整合進萵苣的至少一個細胞的基因組內，該載體包含a)萵苣DHS的反義多核苷酸，和b)操作性連接在該反義多核苷酸上的調節序列，使該反義多核苷酸表達，且這種表達抑制內源DHS的表達，用以產生DHS表達被抑制的轉基因萵苣，并且其中所述抑制內源DHS的表達得到的所述轉基因萵苣與野生型萵苣相比，表現出褐變推遲。全文摘要本發明涉及真核起始因子5A(“eIF－5A”)的獨特的同工型衰老－誘導eIF－5A；損傷－誘導eIF－5A和生長eIF－5A以及編碼這些因子的多核苷酸。本發明還涉及調節這些因子表達的相關方法。本發明還涉及脫氧羥丁賴氨酸(hypusine)合酶(“DHS”)、編碼DHS的多核苷酸以及調節DHS表達的相關方法。文檔編號C07K14/47GK1839154SQ200480023751公開日2006年9月27日申請日期2004年6月21日優先權日2003年6月20日發明者J·E·湯普遜申請人:森尼斯科技術公司