一種體外誘導擴增nk細胞的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及利用三葉青提取物的一種體外誘導擴增NK 細胞的方法。
【背景技術】
[0002] 近年來，腫瘤的生物治療已經成為腫瘤治療領域研究的熱點。NK細胞是一類獨立 的淋巴細胞群，NK細胞主要通過細胞毒活性而顯示生物學效應，可直接殺傷腫瘤細胞、病毒 感染的細胞，胞內寄生菌等。NK細胞可以識別自身正常細胞和異常組織細胞，其僅殺傷異 常細胞而對宿主正常組織細胞沒有細胞毒作用。此外，NK細胞通過分泌多種細胞因子，在 免疫調節和某些免疫細胞分化中發揮重要作用。NK細胞主要以組織相容性復合物（major histocompatibility complex,MHC)非限制性方式識別腫瘤，通過顆粒酶B(granzyme B)和 穿孔素（perforin)等途徑殺傷腫瘤細胞，而T細胞表面的⑶107aPb分子，與T細胞活化以 后脫顆粒過程相關，其比值可以直接反應該效應細胞具有的特異性殺傷活性。
[0003] 同時，NK細胞還能與其它固有免疫細胞和適應性免疫細胞相互作用，協同發揮抗 腫瘤作用。目前NK細胞已經成為腫瘤患者過繼免疫治療的重要效應細胞。由此可見，為滿 足生物學功能研究和臨床過繼細胞免疫治療需要，擴增出高效和較多數量的NK細胞是許 多學者共同研究的課題。
[0004] 現階段體外擴增NK細胞主要采取飼養層細胞共培養法和免疫磁珠分選法，但飼 養層細胞共培養是將NK細胞添加到經改造后的腫瘤細胞株，這樣改造在臨床上應用的安 全性沒有得到保障，而免疫磁珠分選法操作過程繁瑣，成本高，不適合臨床大規模應用。
【發明內容】
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[0005] 為了解決現有技術中存在的問題，本發明提供一種體外誘導擴增NK細胞的方法， 可在體外培養條件下獲得大量的、應用安全的、純度較高的以及殺傷活性強的NK細胞，從 而使得該細胞達到能夠安全有效的應用于臨床的質量指標。
[0006] 為實現該發明目的，本發明采用的技術方案為：一種體外誘導擴增NK細胞 的方法，包括向NK細胞培養液中添加三葉青提取物，所述的三葉青提取物的濃度為 0. 00625 u g/ml ~9. 76 u gg/ml。
[0007] 更具體的，本發明的體外誘導擴增NK細胞的方法，包括以下步驟：
[0008] (1)單個核細胞分離：靜脈穿刺采集患者外周血，轉移至含肝素鈉的抗凝瓶中，上 下混勻，將外周血樣本移至離心管進行離心，棄上層血漿，生理鹽水稀釋血樣，淋巴分離液 分離單個核細胞，生理鹽水重懸單個核細胞，離心收集單個核細胞；
[0009] (2)細胞種瓶：將上述單個核細胞用含rhIL-2的NK細胞培養液稀釋至NK細胞濃 度為2X10 5~lX106/ml，接種于6孔細胞培養板中，每孔5ml，于37°C、5% C02培養箱培 養；
[0010] ⑶細胞擴增：每2天半量換液1次，并調整細胞密度為4X 104~6X 10 4/mL，NK 細胞培養至第7天，向培養液中添加三葉青提取物，濃度為0. 00625 y g/ml~9. 76 y g/ml， 此后繼續培養；
[0011] ⑷細胞收集：培養3至21天，收集培養的NK細胞。
[0012] 優選的，步驟⑵中的rhIL-2的濃度為500U/ml。
[0013] 優選的，步驟（2)中NK細胞濃度為3. 5X 105ml。
[0014] 優選的，步驟（3)中調整細胞密度為5X104/ml。
[0015] 優選的，步驟（3)中三葉青提取物的濃度為0? 01 ii g/ml~2. 44 ii g/ml。
[0016] 優選的，所述的三葉青提取物為三葉青總提取物，其制備方法為用乙醇溶液加熱 回流三葉青而提取得到的。
[0017] 優選的，所述的三葉青提取物為水煮脫糖部位Th-W3,其制備方法為經有機溶劑提 取后的三葉青藥材用水煮后減壓回收蒸干。
[0018] 優選的，所述的三葉青提取物為石油醚部位Th-P，取三葉青總提取物，用石油醚進 行分步萃取得到。
[0019] 優選的，所述的三葉青提取物為水部位脫糖部位Th-W2,其制備方法為三葉青總提 取物的水部位除去糖分，用30%乙醇水洗脫溶液蒸干后得到。
[0020] 本發明通過向NK細胞培養液中加入三葉青提取物擴增自然殺傷細胞的方法的在 于：
[0021] 三葉青的有效成分主要為含黃酮類化學成份，其性涼，味辛、苦，無毒，具有清熱解 毒、活血止痛、祛風化痰、活血止痛等功效，常用于高熱驚厥，小兒感冒發熱、喉癢腫痛、咳 嗽、肺炎、肝炎、腸炎、痢疾等疾病。現代藥理研究表明，三葉青提取物具有較好的抗腫瘤、抗 炎、鎮痛及解熱作用等。本發明人通過對三葉青的成分進行提取分離和鑒定分析，發現不 同部位的三葉青提取物，只要很低的劑量即能明顯促進人NK細胞增殖，提高NK細胞的殺瘤 活性。
[0022] 本發明從大規模生產的可操作性，臨床應用安全性以及有效性角度出發，優化出 三葉青提取物誘導NK細胞的最佳方案，與其他方法相比，本發明有以下優點：
[0023] 1.本方法可在體外培養條件下獲得大量的、應用安全的、純度較高的以及殺傷活 性強的NK細胞，從而使得該細胞達到能夠安全有效的應用于臨床的質量指標，同時該方法 操作簡便，成本低，適用于大規模應用；
[0024] 2.利用本發明所獲得的NK細胞，在細胞數量、純度、殺傷活性、細胞因子分泌水平 均有顯著提高，利用本方法培養，細胞數量提高了幾千倍。
【附圖說明】
[0025] 圖1?三葉青提取技術路線圖；
[0026] 圖2.不同濃度三葉青提取物TH-t對NK細胞增殖影響圖；
[0027] 圖3.不同濃度三葉青提取物TH-p對NK細胞增殖影響圖；
[0028] 圖4.不同濃度三葉青提取物TH-a對NK細胞增殖影響圖；
[0029] 圖5.不同濃度三葉青提取物TH-b對NK細胞增殖影響圖；
[0030] 圖6.不同濃度三葉青提取物TH-W對NK細胞增殖影響圖；
[0031] 圖7.不同濃度三葉青提取物TH-wl對NK細胞增殖影響圖；
[0032] 圖8.不同濃度三葉青提取物TH_w2對NK細胞增殖影響圖；
[0033] 圖9.不同濃度三葉青提取物TH-w3對NK細胞增殖影響圖；
[0034] 圖10.濃度0. 62 ii g/ml的三葉青提取物Th-t對NK細胞增殖影響圖；
[0035] 圖11.濃度0. 62 ii g/ml三葉青提取物Th-p對NK細胞增殖影響圖；
[0036] 圖12.濃度0. 166 ii g/ml三葉青提取物Th-W2對NK細胞增殖影響圖；
[0037] 圖13.濃度0. 62 ii g/ml三葉青提取物Th_W3對NK細胞增殖影響圖；
[0038] 圖14.三葉青總提取物誘導的NK細胞對三株腫瘤細胞殺傷活性圖；
[0039] 圖15.0. 15iig/ml三葉青總提取物（TH-t)誘導后的NK細胞顆粒酶、穿孔素和 CD107a的表達圖。
【具體實施方式】
[0040] 為了使本領域的技術人員更好地理解本發明的技術方案，下面結合具體實施例對 本發明作進一步的詳細說明。
[0041] 實施例1 :三葉青藥材提取分離實驗
[0042] 提取液分組：根據提取時所選用的制劑將提取液分為9組，分別命名為：TH_t、 TH-p、TH-a、TH-b、TH-w、TH-wl、TH-w2、TH-w3 和 TH-w4;
[0043] 各組三葉青提取物的提取方法：參照文獻[楊陽.甘西鼠尾草及頭花寥化學成分 研究.第二軍醫大學碩士學位論文.上海：第二軍醫大學，2009]分離純化得到，經高效液 相色譜（HPLC)檢查。可參考圖1關于三葉青提取技術路線圖。
[0044] TH-t部分：取三葉青干燥藥材200g，加5倍體積80 %乙醇水溶液浸泡24h后，加熱 回流提取，共3次，每次40min，合并提取液，過濾，減壓回收蒸干，得總提取物TH-t 21. 6g， 得率10. 8%。TH-p部分：取此總提取，加水混懸，分別采用10倍體積的石油醚（水飽和） 進行分步萃取。分別得到石油醚部位TH-p 0. 15g，得率0.075%。
[0045] TH-a部分：乙酸乙酯部位TH-a 0? 58g，得率0? 29%
[0046] TH-b部分：正丁醇部位TH-b 2g，得率1 %
[0047] TH-w部分：以及水部位TH-w 18. 9g，得率9. 45 %
[0048] THil部分：取水部位進行大孔吸附樹脂色譜，先使用純水進行洗脫，除去糖分， 再使用10 %、30 %、60 %、95 %乙醇水溶液分別依次洗脫。其中，10 %乙醇水洗脫溶液減壓回 收蒸干后得到水部位脫糖流分1^110.14§，得率0.07%
[0049] THi2部分：取水部位進行大孔吸附樹脂色譜，先使用純水進行洗脫，除去糖分， 再使用10 %、30 %、60 %、95 %乙醇水溶液分別依次洗脫。其中，30 %乙醇水洗脫溶液蒸干后 得到水部位脫糖流分THil 0. 3g，得率0. 15%
[0050] TH_w3部分：將上述經有機溶劑提取后的三葉青藥材用水煮后減壓回收蒸干，獲 得脫水物2. 1克。
[0051] TH-w4部分：將上述經有機溶劑提取后的三葉青藥材用減壓回收蒸干脫水，再使 用10%、30%、60%、95%乙醇水溶液分別依次脫糖，其中，獲得了10%乙醇水部位脫糖流 分。
[0052] 可參考圖1關于三葉青提取技術路線圖。
[0053] 實施例2:不同濃度的三葉青提取物對NK細胞增殖的影響實驗
[0054] NK細胞培養及鑒定：
[0055] 取健康獻血者外周抗凝血10ml，淋巴細胞分離液分離單個核細胞，用含500U/ml rhIL-2的NK培養基調整細胞密度為3. 5 X 105/mL，接種于6孔細胞培養板中，每孔5ml，于 37°C、5% C02培養箱培養，每2天半量換液1次，并調整細胞密度為5X105/mL，收集培養7 天的NK細胞，加入PE標記的⑶3、FITC標記的⑶56進行細胞表面標志檢測。
[0056] CCK8法檢測不同三葉青提取物對人NK細胞生長的影響：
[0057] 取培養7天的NK細胞配成5 X 104/mL的細胞懸液，加入96孔細胞培養板，200 ill/ 孔。實驗組：共設11個濃度組，分別加入5 X104/mL的NK細胞，180 yl/孔。然后加入不 同濃度的三葉青提取物（終濃度分別為〇. 〇〇〇625、0. 0025、0. 01、0. 039、0. 155、0. 62、2. 44、 9. 76、39、156 y g/ml)每組設5個復孔，同時高末加藥物空白對照組：于培養箱中培養24h、 48h、72h。培養結束前4個小時每孔加入CCK8 20 iil，繼續培養4h后于酶標儀450nm處檢 測各孔吸光值（0D)記錄結果。增殖率（％ )=(實驗0D值）一（對照0D值V(對照0D 值）X100%。
[0058] 各階段三葉青提取物對NK細胞生長影響：
[0059] 各提取階段三葉青提取物對NK細胞生長影響有較大差異，在藥物濃度相同條件 下，以水煮脫糖部位（Th_w3)時促NK細胞生長活性最強；總提取物（Th-t)、石油醚部位 (Th-p)和水部位脫糖部位（Th-w2)次之，與對照組比較均有統計學差異（p < 0. 05)。其他 結果均有一定的促NK細胞增殖作用。提取物Th-