白鮮堿在制備抗白色念珠菌藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了白鮮堿在制備抗白色念珠菌藥物中的應用，并且研究發現，白鮮堿對白色念珠菌的最小抑菌濃度為312.5μg/ml，使用體積分數≦4%Tween-80作為增溶劑。本發明的優點在于：本發明首次發現了白鮮堿抑制體外懸浮白色念珠菌的活性，且證實白鮮堿具有抗白色念珠菌生物膜潛能，是一味值得研究開發的抗真菌藥物。
【專利說明】白鮮堿在制備抗白色念珠菌藥物中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及醫藥領域，更具體的講，涉及白鮮堿在制備抗白色念珠菌藥物中的應 用。
【背景技術】
[0002] 念珠菌是一種常見條件致病菌。白色念珠菌是致病力最強的念珠菌中之一，也是 引起人類念珠菌病的主要病原體。口腔是白色念珠菌最常見的定殖部位。目前，白色念珠 菌所引起的口腔念珠菌感染已經是關乎人類健康的一個重要問題。口腔白色念珠菌感染常 見于免疫缺陷宿主，包括HIV陽性以及艾滋病人，接受器官移植的病人，化療病人等。由于 廣譜抗生素的濫用，免疫抑制劑、糖皮質激素在臨床上的廣泛應用，惡性腫瘤發病率升高， 加之目前我國艾滋病疫情處于快速上升期，口腔白色念珠菌感染的病例急劇上升。與口腔 黏膜病有關的白色念珠菌感染主要包括口腔念珠菌病、口腔扁平苔鮮、白斑等。白色念珠菌 作為口腔黏膜多種感染的致病因子的作用已得到肯定。白色念珠菌感染會使口腔黏膜許多 原有疾病的病情加重，例如口腔黏膜癌前病變因有白念的反復感染而增加了癌變幾率，其 中國際公認的口腔癌前病變白斑，伴有念珠菌感染者，其癌變傾向較大。最新的研究顯示， 白色念珠菌在4-NQ0誘導的大鼠口腔腫瘤模型中對黏膜增生起到了關鍵的促進作用。由于 口腔白色念珠菌常以生物膜形態存在，使得白色念珠菌的致病性和耐藥性明顯增加。因此， 如何有效控制口腔白色念珠菌感染成為臨床上頗為棘手而又亟需解決的重要問題。
[0003] 目前臨床常用的抗真菌藥物有多烯類（如兩性霉素 B)，唑類（如氟康唑、伊曲康 唑）以及嘧啶類（如5-FC)等。它們主要是通過影響真菌細胞膜麥角固醇的合成，以及損 害細胞膜脂質結構和功能，最終導致真菌死亡。目前，通過抗真菌藥物的藥物敏感性實驗， 選擇合適的抗真菌藥物越來越受到重視。藥物敏感性實驗方法很多，如微量稀釋法、紙片擴 散法、E-TEST法等。1982年，美國國家臨床實驗標準化委員會（NCCLS)成立了真菌藥敏試 驗分會，以期建立一個標準化藥敏實驗方案。目前國內外多采用NCCLS的M27方案為酵母 菌的標準化藥敏實驗方法。由于有效的抗真菌藥物品種很有限，而目前臨床應用的抗真菌 藥物從高效低毒、抗菌譜和耐藥性方面評價尚不能令人滿意。具有兩千多年用藥歷史和完 整理論體系的中醫藥，為新藥的發現提供了一條有效捷徑。因此，從祖國傳統醫學寶藏中挖 掘具有抗真菌潛力，并且毒副作用低的新藥是一個非常重要的研究方向。
[0004] 來源于古方的五白湯已在臨床上用于口腔白色念珠菌感染病例，前期研究應用五 白湯治療口腔黏膜糜爛病例取得滿意效果，尤其是對伴白色念珠菌感染病例，其療效與氟 康唑相似，且無明顯毒副作用。但是尚不明確五白湯抗白色念珠菌究竟是復方中的哪些藥 物起主導作用，是否可用中藥簡單成分替代原藥,形成成分處方，以提高藥效和向中藥制劑 的標準化推進？
[0005] 白鮮皮為云香科植物白鮮（Dictamnus dasycarpus Turcz)和狹葉白鮮 (Dictamnus angustifolius G.Don)的干燥根皮，具有清熱燥濕、祛風解毒的功效，主治皮 膚瘙癢，風疹，濕疹，疥癬，黃疸，風濕痹痛，筋骨痿弱，小兒驚厥。白鮮皮主要化學成分為生 物堿，而白鮮堿為其重要活性成分，同時也為其較特征性成分。中醫藥指紋圖譜研究表明， 不同產地的白鮮皮藥材中均含有白鮮堿，而且是其含量較高的主要成分。本發明選擇白鮮 皮的有效成分白鮮堿，研究其抗白色念珠菌活性。
[0006] 白鮮堿（dictamnine)，又稱白鮮胺，分子式為C15H1()0 5，分子量為270. 24,屬呋喃喹 啉類生物堿，無色棒狀結晶，熔點：129--131°C。既往有文獻(李福鳳，李果剛，吳友忠， 等·小兒哮喘花剝苔產生的免疫機制研究[JL中西醫結合學報，2005, 3(6) :446-449)報 道，白鮮堿可有效抑制有些植物致病真菌孢子的萌發。葉笑味等(地圖舌兒童血清鋅銅測 定的意義[J].浙江預防醫學，2006, 18(8) :54-54)報道了白鮮皮多種二甲氯提取物中，白 鮮堿是最有效的抑制植物致病真菌--黃瓜黑星病菌的化合物。李伏虎等(微量元素鋅等 與幼兒地圖舌的關系[J].浙江臨床醫學，2006)最新的研究顯示，從中藥兩面針根部提取 的白鮮堿對稻瘟病菌這一植物致病真菌有明確的抑制作用。Muzyka BC等（Prevalence of HIV-land oral lesions in pregnant women in rural Malawi[J]. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod，2001Jul, 92(1) :56-61)的研究發現了白鮮堿對模式真 菌啤酒酵母的抗菌活性。目前國內外尚無關于白鮮堿對白色念珠菌抑制作用的報道。關于 白鮮堿抗真菌作用的機制，國內外亦有研究。已有研究應用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察方 法，并作細胞掃描圖像分析，定量描述細胞形狀、面積和DNA，RNA含量，認為白鮮堿直接或 間接影響了真菌細胞遺傳物質的正常合成，以致不能完成正常細胞周期，從而抑制真菌生 長甚至導致死亡。Pfyffer 等（Pfyffer GE，Towers GH. Photochemical interaction of dictamnine,a furoquinoline alkaloid, with fungal DNA[J]. Can J Microbiol,1982, 28 (5) :468-73)報道了白鮮堿對真菌DNA的作用，在近紫外光下引起絲狀真菌的致死性損 傷，結果支持了以前其基于小牛胸腺DNA的體外實驗結果，認為DNA是生物堿的體內光毒性 的主要作用靶點。而白鮮堿對白色念珠菌抑制作用的機制需要更進一步的研究加以探索。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的在于提供白鮮堿在制備抗白色念珠菌藥物中的應用。
[0008] 為實現以上目的，本發明公開以下技術方案：白鮮堿在制備抗白色念珠菌藥物中 的應用。
[0009] 作為一個優選方案，白鮮堿對白色念珠菌的最小抑菌濃度為312. 5 μ g/ml。
[0010] 作為又一個優選方案，使用體積分數蘭4%Tween-80作為増溶劑。
[0011] 本發明的優點在于：本發明首次發現了白鮮堿抑制體外懸浮白色念珠菌的活性， 且證實白鮮堿具有抗白色念珠菌生物膜潛能，是一味值得研究開發的抗真菌藥物。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012] 圖1為Tween-80溶液對白色念珠菌菌懸液吸光度的影響。
[0013] 圖2為Tween-80與DMS0的混合溶液對白色念珠菌菌懸液吸光度的影響。
[0014] 圖3為白鮮堿以及氟康唑對白色念珠菌生物膜的影響。
[0015] 圖4為白鮮堿對白色念珠菌生物膜吸光度的影響。 t〇〇16] 圖5為氟康唑對白色念珠菌生物膜吸光度的影響。
【具體實施方式】
[0017] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。下述實施例中所使用的實驗方法如無 特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途 徑得到。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。
[0018] 實施例1. Tween-80對白色念珠菌體外生長的影響
[0019] 1材料與方法
[0020] 1. 1 材料
[0021] 1. 1. 1藥物及試劑
[0022] Tween-80購自國藥集團化學試劑有限公司，批號F20080324。
[0023] DMS0購自上海鼎國生物技術有限公司，Sigma分裝，批號86C00150。
[0024] 氟康唑購自中國藥品生物制品檢定所，批號100314-200503。
[0025] 1. 1. 2試驗菌株
[0026]國際標準菌株ATCC76615,由上海市口腔醫學研究所口腔微生物實驗室提供，經酵 母菌生化卡（Vitek,批號E23K)鑒定為白色念珠菌（Bionumber555017411)，見附錄1。
[0027] 1. 1. 3 培養基
[0028] ①沙保勞氏瓊脂(上海伊華醫學科技有限公司，批號20080303) 63g，加氯霉素 50mg，蒸饋水1000ml，高壓滅菌。
[0029] ②RPMI1640液體培養基：RPMI1640粉劑（GIBC0,批號1381654)(含谷氨酰胺， 不含碳酸氫鈉）10. 4g，三氮嗎啡啉丙磺酸34. 53g (SIGMA，批號018K0724)，蒸餾水900ml， 以lmol/1的NaOH調節pH至7. 0,加蒸餾水定容至1000ml，用Millipore濾過滅菌（濾膜 0. 22μπι)，置4°C冰箱備用。
[0030] 1. 1. 4主要儀器
[0031] 超凈工作臺（蘇州YJ_875DA)、麥氏比濁管（biomerieux806814701)、紫外分光光 度儀（日本島津UV-1601)。
[0032] 1. 2 方法
[0033] 參照NCCLS MW _ A2[8]推薦的肉湯常量稀釋法酵母菌藥敏性試驗進行。
[0034] 1. 2. 1藥物及標準品的制備
[0035] Tween-8〇經RPMI1Μ0液體培養基稀釋后，配制成體積分數為8%的貯存液。 Tween-80與DMS0按體積4 :1的比例混合，經RPMI1M0液體培養基稀釋后，配制成Tween-80 體積分數為8%，DMS0體積分數為2%的混合溶液貯存液。上述兩種貯存液分別用Millipore 濾過滅菌（濾膜〇· 22 μ m)，分裝后置-80°C冰箱貯存備用。
[0036] 氟康唑用無菌蒸餾水配制成1280 μ g/ml的貯存液，用Millipore濾過滅菌(濾膜 0. 22 μ m)，分裝后置-80°C冰箱貯存備用。
[0037] 1. 2. 2菌懸液制備
[0038] 將白色念珠菌(ATCC76615)接種在沙堡氏瓊脂培養基上，置35°C，傳代培養。挑取 生長24小時的菌落，用0. 85%的無菌氯化鈉水溶液制成菌懸液，經麥氏比濁管調整其濁度 達到〇· 5麥氏標準，相當于每毫升含1?5 X 106菌落形成單位（CFU/ml)，用RPMI1640液體 培養基1 :5〇稀釋后再1 :20稀釋（共稀釋1000倍）至菌含量為1?5X103，CFU/ml (2倍 于終濃度)。
[0039] 1. 2· 3藥物稀釋及接種物接種
[0040] 取無菌試管（100mm)12支。排成一排，第2至12管內分別加入lmlRPMI1640液體 培養基。在第1管加入受試藥物原液2ml，然后從第一管內吸取lml至第2管。混勻后再吸 取lml至第3管，如此連續倍比稀釋至第10管。并從第1〇管中吸取lml棄去。第η管為 不含受試藥物的生長對照，第12管為陰性對照。此時各管受試藥物濃度依次為1倍、1/2倍、 1/4倍、1/8倍、1/16倍、1/32倍、1/64倍、1/128倍、1/256倍、1/512倍的受試藥物原濃度。 然后在每管內加入制備好的菌懸液接種物各lml。使每管最終菌液濃度約為〇. 5X 103? 2. 5X103CFU/ml。第1管至第10管受試藥物達到終濃度，此時各管受試藥物濃度依次為 1/2 倍、1/4 倍、1/8 倍、1/16 倍、1/32 倍、1/64 倍、1/128 倍、1/256 倍、1/512、1/1024 倍受試 藥物原濃度。Tween-8〇溶液的體積分數為4%?0· 0〇78丨25%。Tween-80與DMS0的混合溶 液中Tween-80的體積分數為4%?〇. 0078125%，DMS0的體積分數為1%?〇. 001953125%， Tween_8〇與DMS0保持4 :1的比例不變。
[0041] 1.2. 4培養及結果判定
[0042]將上述試驗管置35°C培養48小時，觀察白色念珠菌生長情況，讀取結果。結果判 斷的前提是生長對照良好，空白對照無菌生長清晰。判讀標準如下：與生長對照管比較，對 試管內菌株生長情況進行評分，0分為肉眼觀察清晰；1分為輕度模糊；2分為濁度顯著降低 (約抑制 5〇%受試菌生長);3分為濁度輕度降低；4分為濁度不減低。并在紫外分光光度儀， 波長 55〇nm條件下測管內液體的吸光度。每種受試藥物均重復三次實驗，吸光度取平均值。 本實驗以氟康唑作為陽性對照藥物，參照NCCLS M27-A2[8]推薦的肉湯微量稀釋法酵母菌藥 敏性試驗進行，其MIC值位于M2 7-A2規定的范圍，則認為該次實驗結果有效。
[0043] 2 結果
[0044] 35°C培養48小時后，肉眼觀察各試管白色念珠菌（ATCC76615)生長情況。生長對 照管均生長良好，空白對照管無菌落生長清晰且陽性對照藥物氟康唑MIC值位于M27-A2規 定的范圍。分別加入Tween-80溶液及Tween-80與DMS0的混合溶液的試管與生長對照管 比較，其濁度不減低，均判定為4分。
[0045] 35 °C培養48小時后，紫外分光光度儀550nm波長條件下測定每一試管內液體吸光 度的均值見表1，吸光度的均值均為去除RPMI-1640液體培養基對吸光度影響后的數值。
[0046] 表lTween-80溶液及Tween-8〇與DMS0混合溶液處理后各試管內液體吸光度均值
[0047]
【權利要求】
1. 白鮮堿在制備抗白色念珠菌藥物中的應用。
2. 根據權利要求1所述的白鮮堿在制備抗白色念珠菌藥物中的應用，其特征在于，白 鮮堿對白色念珠菌的最小抑菌濃度為312. 5 μ g/ml。
3. 根據權利要求1所述的白鮮堿在制備抗白色念珠菌藥物中的應用，其特征在于，使 用體積分數=4%TWeen-80作為增溶劑。
【文檔編號】A61P1/02GK104248637SQ201310261421
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2013年6月26日 優先權日:2013年6月26日
【發明者】周曾同, 施琳俊 申請人:上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院