新穎乳酸菌株及其調節免疫反應的用途
【專利摘要】本發明是關于新穎乳酸菌株MP137及MP108，及其調節免疫反應的用途。特定而言，本發明的乳酸菌株可促進Th1反應及抑制Th2反應。
【專利說明】新穎乳酸菌株及其調節免疫反應的用途
[0001]本申請是發明創造名稱為新穎乳酸菌株及其調節免疫反應的用途，申請號為201110404611.9，申請日為2011年12月7日的發明專利申請的分案申請。
【技術領域】
[0002]本發明是關于新穎乳酸菌株及其用于調節免疫反應的用途。
【背景技術】
[0003]免疫系統是身體用來抵抗外來微生物或毒素的防御系統。在免疫系統中，T細胞受刺激后可能分化成第I型輔助T細胞(Thl)、第2型輔助T細胞(Th2)、以及調控型T細胞(Treg)。其中，Thl細胞主導細胞調節的免疫反應，可分泌干擾素-Y (IFN-Y)，以及促進樹突細胞和巨噬細胞分泌細胞激素-12 (IL-12)與細胞毒殺T淋巴細胞的增生，有助于對抗病毒感染及癌細胞。Th2細胞則主導體液免疫反應，可分泌細胞激素-4 (1L-4)、細胞激素-5(1L-5)及細胞激素-13 (1L-13)，促使B細胞增生及刺激免疫球蛋白E(IgE)的產生，可對抗游離的病菌；但過度的Th2反應可能導致發炎及過敏反應，例如，氣喘、過敏性鼻炎、濕疹、蕁麻疹、及胃腸疾病等。另，調控型T細胞是負責調節Thl及Th2細胞的平衡，可透過分泌TGF-β或IL-10來執行此調節能力。已有報導指出調控型T細胞可抑制自體免疫與過敏或氣喘反應，目前認為可用于過敏疾病的預防與治療。
[0004]許多研究顯示乳酸菌(Lactobacillus sp.)具免疫調節功效，可抑制發炎或緩和異位性皮膚炎、過敏性鼻炎或氣喘等過敏疾病，其作用機制包括調節細胞激素的分泌、控制Thl與Th2反應的平衡及影響抗體的產生等。然而，乳酸菌功效具有菌株特異性(strain-specific effects),根據菌株種類的不同而有不同表現,且自然界尚有許多乳酸菌株尚未被發現或予以充分地研究。
【發明內容】
[0005]本發明是從臺灣健康幼兒糞便檢體分離出新穎乳酸菌株MP137及MP108，其與現有已知的菌株不同。本發明的新穎乳酸菌株具有免疫調節功效，特別是使個體的免疫反應趨向于Thl免疫反應，抑制Th2免疫反應，有助于對抗病菌感染及降低過敏反應。
[0006]因此，在一方面，本發明提供一種經分離的乳酸菌株，其中該乳酸菌株具有選自以下所組成的群的菌株的特性:MP137菌株，寄存于中國臺灣財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC910484 ；以及MP108菌株，寄存于中國臺灣財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC910483。特定而言，本發明提供新穎的乳酸菌株MP137及MP108。
[0007]在另一方面，本發明提供一種包含前述乳酸菌株的組合物。該組合物可為藥物或食品，可用于調節個體的免疫反應，特別是促使個體的免疫反應趨向于Thl免疫反應，避免Th2免疫反應,更特別是降低個體的過敏反應。本發明的組合物具治療氣喘或過敏性鼻炎或對抗腸道致病菌感染的功效。
[0008]在又一方面，本發明亦提供一種此處所描述的乳酸菌株的用于制備用于調節個體的免疫反應、治療氣喘或過敏性鼻炎或對抗腸道致病菌感染的藥物或食品的用途。
[0009]本發明亦包括一種于所需個體調節免疫反應、提升腸道免疫力、抑制免疫反應、治療氣喘或過敏性鼻炎、或對抗腸道致病菌感染的方法，其包括將有效量的所述乳酸菌株投與至該個體中。
[0010]本發明的各個具體實施例的細節說明如后。本發明的其他特征將會經由以下各個具體實施例中的詳細說明及申請專利范圍而清楚呈現。
[0011]無須進一步的闡述，皆相信本發明所屬【技術領域】技術人員基于前述說明即可利用本發明至最廣的程度。因此，可以理解以下的說明僅僅是作為例示說明的用，而非以任何方式限制其余的揭露內容。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]為說明本發明的目的，圖式中顯示的具體實施例是目前最佳的。然而，應理解的是本發明不限于所示的具體實施例。
[0013]圖1系本發明分離株MP137在顯微鏡下觀察到的型態。
[0014]圖2系本發明分離株MP108在顯微鏡下觀察到的型態。
[0015]圖3顯示實施例3.2的小鼠試驗流程。
[0016]圖4A和圖4B顯示經本發明的MP108菌株及MP137處理的小鼠呼吸道阻力變化測
定的結果。
[0017]圖5顯示小鼠的肺沖洗液中發炎細胞種類分析結果，Mon表示單核細胞、Eos表示是酸性白血球、Neu表示是中性白血球以及Lym表示淋巴球細胞。
[0018]圖6A和圖6B顯示實施例4的排除實驗結果，其中圖4A針對沙門氏菌的實驗結果，以及圖4B是針對大腸桿菌的實驗結果。
[0019]圖7A和圖7B顯示實施例4的置換實驗結果，其中圖7A針對沙門氏菌的實驗結果，以及圖7B是針對大腸桿菌的實驗結果。
【具體實施方式】
[0020]除非另有說明，否則此處使用的全部技術和科學名詞與本發明所屬【技術領域】技術人員通常所了解的意義相同。
[0021]此處所使用的冠詞“一”是指該冠詞的一或一個以上(即，至少一個)的文法受
[0022]本發明提供新穎乳酸菌株MP137及MP108，其具免疫調節功效。MP137菌株于2010年11月19日寄存于德國微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH, DSMZ, Inhoffenstra β e7B, 38124 布倫瑞克市，德國)，寄存編號為DSM24230。MP108菌株于2010年11月19日寄存于德國微生物保藏中心(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ, Inhoffenstra e7B,38124布倫瑞克市，德國)，寄存編號為DSM24229。
`[0023]本發明的乳酸菌株MP137及MP108系由臺灣健康幼兒糞便來源經分離取得。經初步試驗，此等菌株為革蘭氏陽性桿菌(圖1及2)，且不具觸酶`、氧化酶活性及運動性，不產生內生孢子，于好氧及厭氧環境下皆會生長，再進一步進行16S rDNA序列分析及API50CHL系統鑒定，結果如SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:4以及表I及表2 (實施例2)所示。綜合鑒定結果，MP137確認為一種新穎的酪乳桿菌副干酪亞種(Lactobacillus paracaseisubsp.paracasei)菌株，而MP108確認為一種新穎的鼠李糖乳酸桿菌(Lactobacillusrhamnosus)菌株。
[0024]本發明的MP137及MP108菌株可以任何方式存在，包括活菌或死菌形式，亦包括具相同特征的等同菌株及由該等菌株衍生所得的菌體或產物。
[0025]本文所使用的“免疫調節” 一詞，當用于形容一物質時，是指該物質具有改變或調整至少一種免疫系統的功能的能力，包括但不限于，改變或調整免疫系統的成員細胞或作用分子(例如，細胞激素及抗體)的數量(或含量)及/或活性。相關領域已發展各種測試方法,評估一種物質的免疫調節功能。
[0026]本文所使用的“治療”一詞包括為了治愈、愈合、減輕、舒緩、改變、矯正、改善、改進或影響該疾病、該疾病的癥狀、該疾病引起的殘疾或罹患該疾病的傾向的目的，而將包含一或多種活性劑的組合物施用或投與至患有該疾病、該疾病的癥狀或有罹患該疾病的傾向的個體，或對該等個體進行其他處理。例如，根據本發明，治療氣喘或過敏性鼻炎包括施予需要的個體一活性成分，以達到降低或減緩氣喘或過敏性鼻炎的癥狀，例如，降低呼吸道收縮現象、減少肺部發炎及改善鼻部癥狀(如流鼻水、鼻塞、鼻子癢、打噴嚏等)或非鼻部癥狀(如眼睛或耳朵癢、喉嚨癢、眼睛紅、流眼淚等)。
[0027]本發明的乳酸菌株具免疫調節功效。在一具體實施例中，本發明的乳酸菌株可調節細胞激素的產生，例如，提升個體的IL-12、IL-10或IFN-Y的產生，以及抑制個體的IL-4、IL-5或IL-13的產 生。在另一具體實施例中，本發明的乳酸菌株可調節個體的免疫球蛋白的產生，例如，提升個體的IgG2a及抑制IgE的產生。本領域具通常知識者可了解細胞激素IL-12及IFN- Y與免疫球蛋白IgG2a的產生代表Thl免疫反應；細胞激素IL-4、IL-5及IL-13與免疫球蛋白IgE的產生代表Th2免疫反應；以及細胞激素IL-10的產生代表調節型T細胞的活化，其負責調節Thl及Th2反應的平衡，可用于過敏疾病的預防與治療。
[0028]因此，本發明的乳酸菌株可促使個體的免疫反應趨向于Thl免疫反應，抑制Th2免疫反應，有助于對抗病菌感染及降低過敏反應。
[0029]又在本發明的特定實施例中，本發明的乳酸菌株可提升個體的IgA的產生。本領域具通常知識者已知IgA在腸道免疫系統扮演重要角色，其會被分泌至腸道黏膜外，與抗原形成免疫復合體(immune complex),以此種方式防止細菌侵入。因此，本發明的乳酸菌株可提升個體腸道免疫力。
[0030]在又一具體實施例中，本發明的乳酸菌株可對抗腸道致病菌的感染，包括但不限于沙門氏菌及大腸桿菌。在特定實施例中，本發明的乳酸菌株可抑制或取代腸道致病菌吸附于腸道上，因此，具有預防或治療腸道致病菌感染的功效。
[0031]此外，在另一具體實施例中，本發明的乳酸菌株可降低呼吸道阻力的產生及/或降低肺部發炎。因此，本發明的乳酸菌株尚可用于治療氣喘。氣喘是一種呼吸道發炎疾病，支氣管因發炎細胞及黏液增加，且管壁水腫，因此，造成呼吸道阻力增加，病患呼吸困難、胸悶，嚴重時造成猝死。本領域已發展出標準動物模式測試呼吸道阻力，可參見以下實施例。
[0032]再者，本領域技術人員已知，過敏性鼻炎呈現Th2細胞增多的趨勢，而且，近年來Thl/Th2免疫調節劑已為預防與治療過敏性鼻炎的重點研究之一。根據本發明，此處所描述的乳酸菌株尚可用于對抗過敏性鼻炎。
[0033]在一具體實施例中，本發明的乳酸菌株可與其他抗過敏藥物并用。此處所述抗過敏藥物可為此領域已知可用于治療過敏的藥物，特別是治療過敏性鼻炎藥物，包括但不限于抗組織胺、去充血劑及抗發炎藥物(如，白三烯素拮抗劑、類固醇、肥大細胞穩定劑、色甘酸鈉、酮替芬等)。在一特定實施例中，本發明的乳酸菌株與抗組織胺并用。本發明的乳酸菌株可視需要與抗過敏藥物同時使用或依序先后使用。
[0034]在另一方面，本發明亦提供一種包含前述乳酸菌株的組合物。在一實施例中，本發明的組合物包括MP137菌株。在另一實施例中，本發明的組合物包括MP108。
[0035]特定而言，本發明的組合物可用于調節個體的免疫反應。在一具體實施例中，本發明的組合物可調節細胞激素的產生，例如，提升個體的IL-12、IL-10或IFN-Y的產生，以及抑制個體的IL-4、IL-5或IL-13的產生。在另一具體實施例中，本發明的組合物可調節個體的免疫球蛋白的產生，例如，提升個體的IgG2a及抑制IgE的產生。因此，本發明的組合物可促使個體的免疫反應趨向于Thl免疫反應，抑制Th2免疫反應，有助于對抗病菌感染及降低過敏反應。
[0036]另，本發明的組合物尚可抑制個體呼吸道阻力的產生及/或降低肺部發炎，可用以治療氣喘。本發明的組合物也可用以治療過敏性鼻炎。
[0037]在又一具體實施例中，本發明的組合物可提升個體的IgA的產生，具提升個體腸道免疫力的功效。
[0038]本發明的組合物還可用于對抗腸道致病菌的感染，包括但不限于沙門氏菌及大腸桿菌。
[0039]典型地，本發明的組合物包含有效`量的乳酸菌株，以達此處所述功效。該有效量可視各種因素而變動，例如，投用途徑、個體的體重及種類，以及投予目的。技術人員可根據此處的揭示及此現有技術已建立的方法依經驗決定個案的劑量。較佳地，本發明的組合物含有IO8Cfu以上的乳酸菌株。在一具體實施例中，本發明的組合物含有IO9-1O12Cfu的乳酸菌株；特定而言，本發明的組合物含有2.5xl09-5xl0ncfu的乳酸菌株；更特定而言，本發明的組合物含有5xl09cfu的乳酸菌株(cfu代表菌落形成單位(colony-forming unit))。
[0040]為有利于達到所述功效及/或傳輸目的，本發明的組合物可進一步與生理上可接受的載劑調配成所需形式。此處“生理上可接受的載劑”系指該載劑與本發明組合物內所含有效成分兼容，其較佳為能穩定該活性成分并且對欲投予的個體或欲施用的環境無害。本發明的組合物可利用各種已知的常規方法與適當載劑調配成所需形式。
[0041]生理上可接受的載劑的實施例包括但不限于賦形劑或稀釋劑，例如，羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、滑石、葡聚糖、乳糖、蔗糖、甘露醇及其類似物；黏結劑，例如，阿拉伯膠、海藻酸鈉、乙基纖維素、洋菜、明膠、淀粉、羥基纖維素、羥丙基纖維素及其類似物；潤滑劑，包括硬脂酸、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、滑石、氫化油、蠟及其類似物；濕潤劑；乳化和懸浮劑等。
[0042]本發明組合物的形式可為錠劑、丸劑、粉末、糖錠、片劑、懸浮液、乳劑、溶劑、糖漿及軟和硬明膠膠囊。在一特定實施例中，本發明的組合物系粉末形式。在另一特定實施例中，本發明的組合物系膠囊形式。此外，本發明組合物較佳以口服方式投予。
[0043]本發明的組合物可被制成藥物或食品，例如，優格、奶酪及乳酸菌粉等。本發明的組合物亦可包括其他添加物，包括但不限于，抗氧化劑，例如，生育醇、二丁基羥基甲苯、丁基羥基甲氧苯、抗壞血酸；甜味劑，例如，甜菊糖、代糖、糖精；著色劑，例如，甜菜紅、桅子藍、姜黃素；以及防腐劑，例如，鈉苯酸鹽、亞硫酸鹽、苯甲酸、己二稀酸等。
[0044]在一具體實施例中，本發明的組合物進一步包括一或多種其他抗過敏藥物，包括但不限于抗組織胺、去充血劑及抗發炎藥物(如，白三烯素拮抗劑、類固醇、肥大細胞穩定齊U、色甘酸鈉、酮替芬等)。
[0045]本發明亦提供一種套組，其包括一或多個第一劑量單位，其包括有效量的本發明的乳酸菌株，以及一或多個第二劑量單位，其包括有效量的其他抗過敏藥物。特定而言，其中的乳酸菌株可與抗過敏藥物同時使用或依序先后使用。
[0046]本發明亦包括一種于所需個體調節免疫反應、提升腸道免疫力、抑制免疫反應、治療氣喘或過敏性鼻炎、或對抗腸道致病菌感染的方法，其包括將有效量的所述乳酸菌株投與至該個體中。在一實施例中，所述乳酸菌株是MP137菌株。在另一實施例中，所述乳酸菌株是MP108。較佳地，所述乳酸菌株系以口服投與至所需個體中。在本發明的方法中，月艮用劑量可視需要予以調整。較佳地，服用劑量為每日IO8Cfu以上的乳酸菌株。在一具體實施例中，服用劑量為每日IO9-1O12Cfu的乳酸菌株；在另一具體實施例中，服用劑量為每日
2.5xl09-5xl0ncfu的乳酸菌株；在又一具體實施例中，服用劑量為每日5xl09cfu的乳酸菌株。
[0047]本領域的技術人員可基于本文揭示的內容，使用任何公知方法及技術依需要調配本發明的組合物。
[0048]本發明將由下列實施例做進一步的說明，但實際發明并不局限于此說明書所陳述的實施例。
[0049]現在將參考下列 作為說明而非限制目的的具體實施例而更明確地描述本發明。
[0050]實施例1:菌株的分離及培養
[0051]采集臺灣健康幼兒糞便檢體，于37°C下，以乳酸桿菌(Lactobacillus)選擇性培養基的Rogosa平板培養基培養48至72小時,培養得乳酸桿菌疑似菌株的各菌落。取該培養物涂布于MRS平板上，于37°C下厭氧培養48至72小時，挑選生長于平板上的單一菌落進一步純化，并依實施例2的敘述進行菌株鑒定，獲得分離菌株MP137及MP108。
[0052]將分離菌株接種于MRS平板上，厭氧培養48至72小時后，挑取單一菌落接種至新鮮MRS培養液中，待菌株生長狀況良好(肉眼可判斷的濁度)，再取I %菌液轉移至另一新鮮MRS培養液中，于適合溫度培養18至24小時，重復該步驟活化菌體二次，培養所得菌液供進行后續試驗。實施例2:菌株鑒定
[0053]2.1初步分析
[0054]依標準方式進行初步分析，結果顯示本發明的分離菌株MP137及MP108為革蘭氏陽性桿菌(圖1及2)，且不具觸酶、氧化酶及運動性，不產生內生孢子，于好氧及厭氧環境下皆會生長。
[0055]2.216S rDNAPCR 分析
[0056]針對本發明的分離菌株MP137及MP108進行16S rDNAPCR分析。使用商業套組(AxyPrep Bacterial Genomic DNA Miniprep Kit,Anxygen Bioscience)抽取菌株的基因組DNA作為模版，在PCR離心管中添加正反引子(16S-F:GGAGTTTGATCCTGGCTCAG(SEQ IDNO:1);及 16S-R2:AAGGAGGTGAT CCAGCCGCA (SEQ ID NO:2))、DNA 聚合酶、緩沖液、dNTPs 等
試劑，含量如下:
[0057]
【權利要求】
1.一種經分離的乳酸菌株，其中該乳酸菌株具有以下菌株的特性MP108菌株，寄存于德國微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH, D SMZ)，寄存編號為 DSM24229。
2.如權利要求1所述的乳酸菌株，其中該乳酸菌株是MP108菌株，寄存于德國微生物保藏中心，寄存編號為DSM24229。
3.一種組合物，其包括如權利要求1或2的乳酸菌株。
4.如權利要求3所述的組合物，其中該乳酸菌株為活菌或死菌。
5.如權利要求3所述的組合物，其為粉末或膠囊形式。
6.如權利要求3所述的組合物，其用于調節個體的免疫反應。
7.如權利要求3所述的組合物，其用于調節個體的細胞激素的產生。
8.如權利要求 7所述的組合物，其用于提升個體的IL-12或IFN-Y的產生。
9.如權利要求7所述的組合物，其用于提升個體的IL-1O的產生。
10.如權利要求7所述的組合物，其用于抑制個體的IL-4、IL-5或IL-13的產生。
11.如權利要求3所述的組合物，其用于調節個體的免疫球蛋白(Ig)的產生。
12.如權利要求11所述的組合物，其用于提升個體的IgG2a的產生。
13.如權利要求11所述的組合物，其用于提升個體的IgA的產生。
14.如權利要求11所述的組合物，其用于抑制個體的IgE的產生。
15.如權利要求3所述的組合物，其用于提升個體的腸道免疫力。
16.如權利要求3所述的組合物，其用于抑制個體的過敏反應。
17.如權利要求3所述的組合物，其用于治療氣喘或過敏性鼻炎。
18.如權利要求3所述的組合物，其用于對抗腸道致病菌感染。
19.如權利要求18所述的組合物，其中該腸道致病菌為沙門氏菌或大腸桿菌。
20.如權利要求3所述的組合物，其為藥物或食品。
21.如權利要求3所述的組合物，其為口服形式。
22.—種如權利要求1或2的乳酸菌株用于制備降低過敏的藥物的用途。
23.如權利要求22的用途，其中該藥物可降低過敏性鼻炎癥狀。
24.一種如權利要求1或2的乳酸菌株用于制備對抗腸道致病菌感染的藥物的用途。
25.如權利要求24的用途，其中該腸道致病菌為沙門氏菌或大腸桿菌。
26.—種如權利要求1或2的乳酸菌株用于制備治療氣喘的藥物的用途。
27.如權利要求26的用途，其中該藥物可降低氣喘個體的呼吸道阻力。
【文檔編號】A61P37/08GK103436461SQ201310269240
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2011年12月7日 優先權日:2010年12月8日
【發明者】陳慶源, 邱雪惠, 宋璧君, 莊雅惠 申請人:益擎生技有限公司, 財團法人食品工業發展研究所