含人間充質干細胞外泌體提取物的矽肺病治療霧化劑及其制備方法與流程

本發明涉及干細胞外泌體提取物，尤其是一種含人間充質干細胞外泌體提取物的矽肺病治療霧化劑及其制備方法。
背景技術：
：間充質干細胞(mesenchymalstemcells,msc)是一組源于基質的異質細胞群，可以從人體大多數組織獲取。它們具有自我更新能力、組織修復、免疫調節能力，可以向中胚層譜系分化，例如：脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞等，此外還能夠向及其它胚層譜系細胞分化，例如向表皮細胞、血管內皮細胞分化。間充質干細胞培養體系中含有多種大量的活性成分，如：干細胞生長因子(scf)、成纖維細胞生長因子(fgf)、內皮細胞生長因子(vegf)、表皮細胞生長因子(egf)、細胞集落刺激因子、白細胞介素(il)、膠原蛋白、透明質酸等80余種活性物質。研究證明干細胞分泌的活性物質大多是以外泌體的形式存在，外泌體能夠很好的與細胞膜融合，從而將內部的活性物質運輸到靶向細胞的內部發揮作用。目前，已經有將間充質干細胞應用于肺損傷及肺纖維化修復的報道,但是由于活性細胞的存活條件比較苛刻，很容易死亡，因此由活細胞所起的作用也會大打折扣。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是，提供一種含間充質干細胞外泌體提取物的矽肺病治療霧化劑及其制備方法，利用高濃度的間充質干細胞分泌外泌體提取物，為矽肺病的治療提供了安全、有效、使用方便的霧化劑。為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：一種含人間充質干細胞外泌體提取物的矽肺病治療霧化劑的制備方法，包括以下步驟：(1)人間充質干細胞培養：從細胞庫中選取p2-p6的人間充質干細胞復蘇，接種批次記為第一批次、第二批次、第三批次，接種密度分別為最大融合度的50％-60％、35％-45％、20％-30％；培養細胞所用完全培養基為無酚紅dmem/df12和體積比濃度為10％胎牛血清；細胞接種完成，放于二氧化碳培養箱培養，溫度37℃，二氧化碳體積比濃度5％；(2)第一批次細胞融合度達到70％-80％時，以生理鹽水清洗細胞2次，用復方電解質注射液進行饑餓培養；(3)饑餓培養12-24小時后，第一批次細胞融合度達90％-95％，收取細胞培養上清，3000-4500g條件下離心5-8min除去沉淀，取離心后上清備用；(4)取培養的第二批次細胞，當細胞融合度達到70％-80％，以生理鹽水清洗第二批次細胞2次，用步驟(3)中細胞培養上清進行饑餓培養；(5)饑餓培養12-24小時后，第二批次細胞融合度達90％-95％，收取細胞培養上清，3000-4500g條件下離心5-8min除去沉淀，取離心后上清備用；(6)取培養的第三批次細胞，當細胞融合度達到70％-80％，以生理鹽水清洗第三批次細胞2次，用步驟(5)中細胞培養上清進行饑餓培養；(7)饑餓培養12-24小時后，第三批次細胞融合度達90％-95％，收取細胞培養上清，3000-4500g條件下離心5-8min除去沉淀，取離心后上清備用；(8)連續饑餓三次后將收集的步驟(7)上清以0.22um濾膜過濾，提取其中的干細胞外泌體，以20-40ml的生理鹽水重懸分離獲得的外泌體制備成霧化劑，放于4℃冰箱中保存。所述人間充質干細胞為人臍帶間充質干細胞、脂肪間充質干細胞、骨髓間充質干細胞、胎盤間充質干細胞、月經血間充質干細胞或牙髓間充質干細胞。上述的制備方法制得的含人間充質干細胞外泌體提取物的矽肺病治療霧化劑。本發明有益效果：將細胞進行饑餓培養，使得細胞分泌的含有各種活性成分的外泌體的濃度得到了提高，并且在短時間內使用饑餓上清重復饑餓間充質干細胞，使細胞提取物中外泌體的濃度進一步增加。而高濃度的間充質干細胞外泌體提取物可促進內膜組織分化、血管新生、肉芽組織生長，促使損傷組織結構再生修復，減少組織的纖維化，調節肺部免疫微環境，顯著改善組織纖維化問題，減少創面組織的細菌感染及炎癥反應。附圖說明圖1為本發明的方法培養的間充質干細胞圖；圖2為不同饑餓次數人臍帶間充質干細胞外泌體提取物中有效因子分泌量比較圖；具體實施方式下面結合附圖和具體實施方式對本發明作進一步詳細說明：本發明的含人間充質干細胞外泌體提取物的矽肺病治療霧化劑的制備方法，包括以下步驟：(1)人間充質干細胞培養：從細胞庫中選取p2-p6的人間充質干細胞復蘇，接種批次記為第一批次、第二批次、第三批次，接種密度分別為最大融合度的50％-60％、35％-45％、20％-30％；培養細胞所用完全培養基為無酚紅dmem/df12和體積比濃度為10％胎牛血清；細胞接種完成，放于二氧化碳培養箱培養，溫度37℃，二氧化碳體積比濃度5％；(2)第一批次細胞融合度達到70％-80％時，以生理鹽水清洗細胞2次，用復方電解質注射液進行饑餓培養；(3)饑餓培養12-24小時后，第一批次細胞融合度達90％-95％，收取細胞培養上清，3000-4500g條件下離心5-8min除去沉淀，取離心后上清備用；(4)取培養的第二批次細胞，當細胞融合度達到70％-80％，以生理鹽水清洗第二批次細胞2次，用步驟(3)中細胞培養上清進行饑餓培養；(5)饑餓培養12-24小時后，第二批次細胞融合度達90％-95％，收取細胞培養上清，3000-4500g條件下離心5-8min除去沉淀，取離心后上清備用；(6)取培養的第三批次細胞，當細胞融合度達到70％-80％，以生理鹽水清洗第三批次細胞2次，用步驟(5)中細胞培養上清進行饑餓培養；(7)饑餓培養12-24小時后，第三批次細胞融合度達90％-95％，收取細胞培養上清，3000-4500g條件下離心5-8min除去沉淀，取離心后上清備用；(8)連續饑餓三次后將收集的步驟(7)上清以0.22um濾膜過濾，并以細胞培養上清中外泌體快速提取器(中國申請號201720177150.9)提取其中的干細胞外泌體，以20-40ml的生理鹽水重懸分離獲得的外泌體，放于4℃冰箱中保存待用。所述間充質干細胞為臍帶間充質干細胞、脂肪間充質干細胞、骨髓間充質干細胞、胎盤間充質干細胞、月經血間充質干細胞或牙髓間充質干細胞。本發明的培養間充質干細胞，在間充質干細胞生長融合度達到70％-80％時進行及饑餓處理，使細胞分泌含有大量生物活性物質的外泌體，并使用饑餓上清多次饑餓細胞，短時間大幅度的增加了外泌體濃度。將干細胞外泌體提取物通過霧化的方式直接肺部給藥，能夠最大限度地發揮治療效果。制備的修復霧化劑用于矽肺病造成的肺損傷及肺纖維化的治療和修復。實施例1(1)人臍帶間充質干細胞培養：從細胞庫中選取p4的人臍帶間充質干細胞復蘇，細胞總數8.4*107。接種批次記為第一批次、第二批次、第三批次，接種密度分別為最大融合度的60％(每瓶接種細胞數：9*106,接種細胞六瓶)、40％(每瓶接種細胞數：6*106，接種細胞四瓶)、20％(接種細胞數：3*106，接種細胞兩瓶),培養體系均為40ml。培養細胞所用完全培養基為無酚紅dmem/df12和體積比濃度為10％胎牛血清，接種細胞瓶為t-175培養瓶。細胞接種完成，放于二氧化碳培養箱培養，溫度37℃，二氧化碳體積比濃度5％；(2)培養30小時,此時第一批次細胞融合度達到75％時，見(圖1)，以生理鹽水清洗細胞2次，每瓶用40ml復方電解質注射液(中國大冢制藥有限公司生產的復方電解質葡萄糖mg3注射液)進行饑餓培養；(3)饑餓培養18小時后，第一批次細胞融合度達95％，收取細胞培養上清，4000g條件下離心8min除去沉淀，取離心后上清放于4℃備用；(4)取培養的第二批次細胞，此時細胞融合度達到70％，以生理鹽水清洗第二批次細胞2次，每瓶用步驟(3)中細胞培養上清40ml進行饑餓培養；(5)饑餓培養18小時后，第二批次細胞融合度達95％，收取細胞培養上清，4000g條件下離心8min除去沉淀，取離心后上清放于4℃備用；(6)取培養的第三批次細胞，此時細胞融合度達到70％，以生理鹽水清洗第三批次細胞2次，每瓶用步驟(5)中細胞培養上清40ml進行饑餓培養；(7)饑餓培養24小時后，第三批次細胞融合度達90％，收取細胞培養上清，4000g條件下離心8min除去沉淀，取離心后上清放于4℃備用。(8)將步驟(3)、步驟(5)和步驟(7)中的備用上清各40ml使用外泌體提取器分泌其中的干細胞外泌體，并以10生理鹽水清洗2次后以40ml生理鹽水重懸外泌體，超聲破碎外泌體檢測其中的細胞因子含量，見(圖2)。(9)將步驟(3)、步驟(5)和步驟(7)中的備用上清各40ml使用外泌體提取器分泌其中的干細胞外泌體，并以10生理鹽水清洗2次后以30ml生理鹽水重懸外泌體保存于無菌西林瓶中，放于4℃冰箱中保存待用,即分別得到饑餓一次、饑餓二次和饑餓三次間充質干細胞外泌體提取物的霧化劑。(10)選取健康雄性wistar大鼠50只，體重200g左右，隨機分成5組，分別為空白對照組(正常培養)、陽性對照組(矽肺病模型，以生理鹽水霧化治療)、實驗組ⅰ(矽肺病模型，以饑餓一次外泌體提取物制備的霧化劑霧化治療)、實驗組ⅱ(矽肺病模型，以饑餓二次外泌體提取物制備的霧化劑霧化治療)、實驗組ⅲ(矽肺病模型，以饑餓三次外泌體提取物制備的霧化劑霧化治療)，每組10只。通過氣管內染塵的方法制備矽肺病模型，每只大鼠染塵20mg，染塵后1周給予霧化治療，治療時間持續30天，每日霧化一次，霧化量為1ml/次。治療結束后培養30日，通過大鼠全肺干重、濕重對比(表1)，以及對肺組織進行病理形態學檢查(he染色、azann三重染色、gomori銀染色),大鼠實驗性矽肺采用四級分類法(表2)對治療效果進行評價。結果顯示，本發明制備的間充質干細胞外泌體提取物的霧化劑能夠很好的對矽肺病進行預防和治療。表1表1大鼠矽肺病預防性治療評價結果：t/c為各組指標數值與陽性對照組的比值；經q檢驗，與陽性對照組相比，p<0.05。表2組別動物數病理分級空白對照組10n/a陽性對照組10ⅱ-ⅲ實驗組ⅰ10ⅰ+-ⅱ實驗組ⅱ10ⅰ-ⅱ實驗組ⅲ10ⅰ表2大鼠矽肺病病理分級結果：ⅰ級為細胞性矽結節；ⅱ級為纖維性結節；ⅲ級為纖維性結節，呈融合病變。綜上所述，本發明的內容并不局限在上述的實施例中，相同領域內的有識之士可以在本發明的技術指導思想之內可以輕易提出其他的實施例，但這種實施例都包括在本發明的范圍之內。當前第1頁12