長效降血糖融合蛋白的制作方法

長效降血糖融合蛋白的制作方法
【專利摘要】本發明提供了重組的與人源免疫球蛋白亞型（IgG2）Fc段融合的人源胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）蛋白分子及其制備方法和用途。該融合蛋白質具有GLP-1的生物學活性，同時具有顯著延長的體內半衰期。所述融合蛋白質可以用于治療Ⅱ型糖尿病、肥胖，以及通過降低血清葡萄糖、抑制胃腸運動和排空或抑制食物攝入而受益的其它疾病。
【專利說明】長效降血糖融合蛋白

【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物制藥領域，具體地屬于治療性生物大分子藥物領域，更具體地，本 發明公開了一種融合蛋白及其制備方法和用途。

【背景技術】
[0002] II型糖尿病（Diabetes Mellitus II, DM II，胰島素抵抗型糖尿病）患者占糖尿病 患者總數的90?95%，且每年以6%的數量遞增。預計到2025年，全球II型糖尿病患者將達 到3. 8億。目前，亞洲已是糖尿病患者最多的地區，全球糖尿病增長最快的國家是中國、印 度等發展中國家。最近一次中國的大型糖尿病流行病學調查是在2002年，在10萬人中按 WHO 1999年公布的診斷標準，18歲以上人群患病率在城市和農村分別為4. 5%和1. 8%。中 國糖尿病患病率在過去20年中上升了近4倍。
[0003] 對于II型糖尿病的治療，目前主要有胰島素替代療法(胰島素、胰島素類似物）和 口服化學類降糖藥物(促胰島素分泌劑磺脲類和格列奈類，可直接刺激胰島素分泌；非促胰 島素分泌劑雙胍類、噻唑烷二酮類和a -糖苷酶抑制劑，雙胍類藥物主要減少肝臟葡萄糖 的輸出，噻唑烷二酮類藥物可改善胰島素抵抗，a -糖苷酶抑制劑主要延緩碳水化合物在腸 道內的吸收）等。以上藥物雖然能降低血糖，但是存在低血糖風險和體重增加的不良反應， 且會導致胰島P細胞功能的進行性喪失（Nature. 2001;414:821-827)。
[0004] GLP-I (Glucagon Like Peptide-1，胰高血糖素樣肽-1)作為腸促胰素之一， 其模擬生理狀態降糖作用的"腸促胰素效應"針對糖尿病兩大發病機制(胰島素分泌不 足和胰島素抵抗)，治療機理獨特，目前發達國家已將其列入二線治療方案（Diabetes Care. 2009;32:193-203)。
[0005] GLP-I的促胰島素分泌和抑制胰高血糖素分泌作用具有血糖濃度依賴性，即當 血糖濃度高于正常時，GLP-I呈現促胰島素分泌作用，而當血糖濃度正常時，GLP-I的促 胰島素分泌作用減弱。因此，外源性GLP-I治療不會由于過量而引起低血糖不良反應的 發生。這是GLP-I類似物優于其它促胰島素分泌藥物和胰島素及其類似物的最顯著特征 (Diabetologia. 1986;29:46-52)(J Clin Invest. 1993;91:301-307)(J Clin Endocrinol Metab. 2001;86:3717-3723)。
[0006] GLP-I通過與胰島a細胞的受體結合，可控制餐后胰高血糖素的分泌；通過與 胰島P細胞的作用，可促進P細胞增殖、抑制其凋亡、增加其對葡萄糖的敏感性，從而增 加葡萄糖依賴性的胰島素分泌；作用于肝臟，可減少肝糖原的輸出；作用于胃，可延緩胃 排空，減少食物攝入；作用于下丘腦，可增加飽脹感，降低食欲，從而減輕體重（Diabetes Care. 2003;26:2929-2940) (Castroenterology. 2007;132:2131-2157) (Proc Natl Acad Sci.1982;79 (2):345-349) (Diabetologia.1996;39:1546-1553) (Endocrinology. 200 3;144:5149-5158) (Diabetes. 2002;51:5434-5442) (Diabetologia. 1993;36:741-744) (Lancet. 2002;359:824-830)〇
[0007] 此外，GLP-I可改善II型糖尿病患者的病理缺陷，保護胰島@細胞和心血 管系統，同時具有保護神經的作用。因此，GLP-I可降低糖尿病患者并發癥的產生， 其在低血糖、減輕體重、胰島細胞保護和心血管保護方面的優勢和綜合作用，必定會 促進其未來在II型糖尿病治療中的地位提升（Diabetes Care. 1998;21:1925-1931) (Diabetes Spectrum.2004;17:183-190) (Lancet.2006;368:1696-1705) (PLoS ONE. 2011;6(8):e23570)。
[0008] 天然的GLP-I在體內很容易被內源性DPP_4(Dipeptidyl peptidase-4,二肽基肽 酶-4)去除N末端組氨酸（His)和丙氨酸（Ala)殘基而失活，半衰期不足2分鐘，不具備成 藥性。因此目前研究的藥物都需要采取多種措施來克服這一難題。目前以GLP-I為靶標的 已上市或在研的藥物主要有兩大類：一類是可以抑制體內DPP-4降解作用的小分子藥物； 另一類則是通過修飾天然GLP-I結構或尋找GLP-I類似物，在不損失其生物學作用的前提 下延長其半衰期（J Biol Chem. 1992;267:7402-7405) (Drug Dev Res. 2001;53:260-267) (Diabetes.2007;56:1475-1480) (Clin Ther. 2008;30:858-867) (Diabetes Obes Metab. 2008;10:82-90) (Curr Med Res Opin. 2008;24:275-286)。
[0009] 陸續成功上市或在研的GLP-I類似物、改構體、長效制劑或DPP-4抑制劑，其初衷 都是為了延長活性物質的體內半衰期。目前國內外研發的GLP-I及其類似物大多療效相 近，區別主要在于作用時間和免疫原性。其中，第一個上市的GLP-I類似物為Eli Iilly的 Exenatide (艾塞那肽)，于2005年4月在美國上市，是美洲毒蜥蜴唾液來源的GLP-I類似 物，需一日兩次皮下注射給藥。隨后上市的Liraglutide(利拉魯肽)，為Novo Nordisk開發 的人源GLP-I改構體，于2009年4月在歐洲上市，2011年10月正式在中國上市，需一日一 次皮下注射給藥。而與人免疫球蛋白IgG Fc部分結合的人源GLP-I改構體(如Eli Iilly 在研的Dulaglutide)利用了 IgG長循環半衰期的特點，可以達到一周一次給藥，是目前同 類產品中最理想的產品（Diabetes Obes Metab. 2011; 13:302 - 312)。
[0010] 本發明涉及人源GLP-I的第7-37位氨基酸序列與人IgG Fe相結合的融合蛋白， 其較Dulaglutide不同之處在于,該融合蛋白中的人IgG Fc采用的是IgG2 Fc。從安全性 角度來看：
[0011] 1)來自人源的GLP-I多肽免疫原性低，長期使用不易產生抗體；
[0012] 2)某些亞類的IgG (如IgGl)的Fc段可與巨噬細胞、NK細胞表面Fc受體結合， 發揮ADCC作用（Antibody-Dependent Cell Cytotoxicity,抗體依賴細胞介導的細胞毒性 作用）和調理作用。人IgG2的Fc段與高親和力Fc受體⑶64和低親和力Fc受體⑶32和 ⑶16都沒有結合能力，因此可降低其ADCC作用。
[0013] 綜合以上兩點，本發明的融合蛋白不僅可降低免疫原性，還可避免與GLP-I治療 作用不相關的Fc段的效應子功能。
[0014] 新生兒Fc受體（FcRn)能夠延長血液中IgG的半衰期，維持血液循環中高水平的 IgG濃度，保持抗體水平的動態平衡。FcRn在正常成人表達于血管內皮細胞，能與IgG的Fc 段結合。血管內皮是FcRn保護IgG不受分解代謝的重要場所。FcRn依賴細胞內陷作用， 不僅從細胞外酸性環境中吸收IgG，而且在細胞內參與IgG循環和穩態調節。生理狀態下， 當血清中IgG濃度低于正常時，更多的FcRn與Fc結合，IgG降解減少，使得IgG濃度得以 維持；當血清中IgG濃度高于正常時，內皮細胞表面的FcRn已經飽和，不能繼續結合更多的 IgG,從而造成IgG降解加強，血清IgG濃度下降。利用FcRn與Fc結合保護含Fc蛋白不受 降解，可借以維持融合蛋白在血漿中的較高濃度的動態平衡，從而延長該蛋白的體內半衰 期。
[0015] 本發明利用了免疫球蛋白IgG特有的清除緩慢的代謝途徑，采取將人源GLP-I多 肽與人免疫球蛋白IgG2的Fc段融合表達的方法，制成融合蛋白，在保留GLP-I生物學活性 的同時，使GLP-I的體內半衰期接近IgG的體內半衰期。
[0016] 該融合蛋白皮下注射可以吸收，由于較長的體內半衰期（IgG2類型的Fc段，其體 內半衰期較 IgG4 和 IgGl 類型的 Fc 段更長）（Nature Biotechnology. 2007; 25 (12) : 1369 - 1372)，可支持每1-2周一次皮下注射給藥，并長時間維持體內有效血藥濃度，減少了患 者必須接受頻繁注射給藥的痛苦，提高了治療的依從性，并能降低治療成本。
[0017] 盡管此途徑對于GLP-I療法是可行的，但是融合蛋白質長時期反復使用會產生抗 體，而糖尿病患者一經確診必須終生接受治療，如果所述融合蛋白的Fc段保留了不需要的 效應子功能，GLP-I-Fc融合蛋白質療法可能有安全方面的顧慮。本發明嘗試克服與使用 GLP-I-Fc融合物相關的關于潛在免疫原性和效應子活性的問題，本發明的融合蛋白質在 GLP-I部分和Fc部分中具有多個氨基酸殘基的替換，此替換提供了更大的潛能以增加體內 穩定性，降低免疫原性并消除效應子功能。


【發明內容】

[0018] 本發明提供了重組的人源胰高血糖素樣肽-I (GLP-I)的第7-37位氨基酸序列與 人源免疫球蛋白亞型（IgG2)的Fc段融合的蛋白分子及其制備方法和用途，所述GLP-I的C 末端通過富含甘氨酸（Gly)的肽接頭（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-G ly-Gly-Gly-Ser，SEQ ID勵:11)與1§62?(：段連接。所述融合蛋白質具有61^-1的生物學 活性，同時具有顯著延長的體內半衰期。所述融合蛋白質可以用于治療和/或預防II型糖 尿病、肥胖，以及通過降低血清葡萄糖、抑制胃腸運動和排空或抑制食物攝入而受益的其它 疾病。
[0019] 本發明利用基因工程技術構建了 GLP-I與IgG2 Fc部分融合的融合蛋白，具體地， 本發明公開了：
[0020] 1. -種融合蛋白，其由胰高血糖素樣肽-1的C末端通過肽接頭與IgG2 Fc部分的 N末端融合而成，所述融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:6 所示。
[0021] 2. -種編碼如1所述融合蛋白的基因，在一個實施方案中，所述基因的核苷酸序 列如 SEQ ID NO: 1 或 SEQ ID NO:2 或 SEQ ID NO:3 所示。
[0022] 3. -種制備如1所述融合蛋白的方法，其包括：
[0023] a.構建如上述2所述的基因；
[0024] b.將步驟a所述基因克隆至真核表達載體，得到可表達如上述1所述融合蛋白的 真核表達載體；
[0025] c.用步驟b所述表達載體轉染細胞，使其表達所述重組融合蛋白，然后分離純化 得到所述重組蛋白。
[0026] 4. 一種制劑，其含有如1所述融合蛋白作為其活性成分，其還可以含有一種或多 種本領域所熟知的可藥用載體。
[0027] 5.如上述1所述融合蛋白或含有其的制劑在制備用于治療和/或預防II型糖尿 病、肥胖以及通過降低血清葡萄糖、抑制胃腸運動和排空或抑制食物攝入而受益的其它疾 病的藥物中的用途。
[0028] 在一個實施方案中，將編碼本發明所述融合蛋白的基因克隆到真核表達載體293。
[0029] 在一個實施方案中，用包含編碼本發明所述融合蛋白的基因的真核表達載體轉染 FreeStyle 293F細胞，從而使其表達本發明所述融合蛋白。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 圖1顯示了用于本發明所述融合蛋白表達的重組真核表達載體 293-GLP-l-Fc(IgG2)的結構，三種融合蛋白（GLP-l-Fc-l、GLP-l-Fc-2 和 GLP-l-Fc-3)重組 真核表達載體結構在基因插入位點上相同。
[0031] 圖2A顯示了表達載體293經EcoR I、BamH I雙酶消化線性化后的片段和編碼所 述融合蛋白GLP-I-Fc-I的基因片段自pGEM-T質粒載體（由捷瑞合成）上酶切后的DNA瓊 脂糖電泳圖；圖2B顯示了經聚合酶鏈反應（PCR)獲得的編碼所述融合蛋白GLP-l-Fc-2和 GLP-l-Fc-3的基因片段；圖2C和圖2D分別顯示了構建完成的編碼三種所述融合蛋白的 293表達載體經EcoR I、BamH I雙酶消化后鑒定的DNA瓊脂糖電泳圖。
[0032] 圖3A顯示了所述三種融合蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)圖；圖3B顯示 了所述三種融合蛋白的免疫印跡（Western-blot)檢測結果圖。
[0033] 圖4顯示了所述三種融合蛋白在P -TC-6細胞上的結合實驗結果圖。
[0034] 圖5顯示了所述三種融合蛋白促進e -TC-6細胞內cAMP (腺苷-3'，5'-環化 一磷酸）釋放的實驗結果圖。
[0035] 圖6顯示了所述三種融合蛋白促進P -TC-6細胞分泌胰島素的實驗結果圖。
[0036] 圖7A和圖7B分別顯示了所述三種融合蛋白在高葡萄糖灌注大鼠模型中升高血清 胰島素水平的實驗結果圖。
[0037] 圖8顯示了所述三種融合蛋白與FcRn蛋白結合的實驗結果圖。
[0038] 圖9顯示了所述三種融合蛋白與Fe Y R III a (⑶16a)蛋白結合的實驗結果圖。

【具體實施方式】
[0039] 除非另有說明，本文使用的所有技術和科學術語與本發明所屬領域普通技術人員 的通常理解具有相同的含義。
[0040] 在一個實施方案中，產生本發明所述融合蛋白的具體技術解決方案如下：
[0041] -、構建編碼本發明融合蛋白的表達載體
[0042] 根據文獻公開的 GLP-I (7-37)序列（Diabetes Metab Res Rev. 2010;26:287 -296.)和Pubmed上公開的IgG2型Fe序列（AJ250170)，本發明人合成了編碼人 GLP-I (7-37)、編碼15個氨基酸肽接頭以及編碼IgG2型Fc的cDNA序列。將所述cDNA中 對應于所述人GLP-I (7-37) C末端的基因序列通過所述肽接頭基因序列與編碼人IgG2型 Fc部分的基因相連接，從而得到編碼本發明所述融合蛋白的融合基因序列。發明人對所 述GLP-I (7-37)氨基酸序列進行了修飾，其中第8位氨基酸由丙氨酸(Ala)替換為甘氨酸 (Gly)，第22位氨基酸由甘氨酸（Gly)替換為谷氨酸（Glu)，第36位氨基酸由精氨酸(Arg) 替換為甘氨酸(Gly)。
[0043] 本發明所述融合蛋白中人IgG2型Fe部分的氨基酸序列有三種不同修飾形 式，從而對應三個不同序列的融合蛋白，本文中分別稱為GLP-l-Fc-1、GLP-l-Fc-2和 GLP-l-Fc-3,其對應的氨基酸序列分別如SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所 示，其對應的基因序列分別如SEQ ID N0:1，SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3所示。其中在 GLP-I-Fc-I的氨基酸序列（SEQ ID N0:4)中，第1-19位為分泌信號肽序列（分泌信號肽指 通常出現在較大多肽N末端區域的氨基酸序列，其功能是啟動所述多肽與細胞內質網的結 合以及該多肽通過質膜分泌)，第20-50位為GLP-I (7-37)序列，第51-65位為肽接頭序列， 第 66-288 位為 IgG2 的 Fe 序列（其鉸鏈區為 VECPPCP，SEQ ID NO: 12);在 GLP-l-Fc-2 的氨 基酸序列（SEQ ID N0:5)中，第1-19位為信號肽序列，第20-50位為GLP-I (7-37)序列，第 51-65位為肽接頭序列，第66-292位為IgG2的Fe序列（其鉸鏈區為ERKCCVECPPCP(SEQ ID N0:13)，且C端去除K);在GLP-l-Fc-3的氨基酸序列（SEQ ID N0:6)中，第1-19位為信號 肽序列，第20-50位為GLP-I (7-37)序列，第51-65位為肽接頭序列，第66-287位為IgG2的 Fe序列(其鉸鏈區為VECPPCP(SEQ ID N0:12)，且C端去除K)。在GLP-I-Fc-I的基因序列 (SEQ ID NO: 1)中，第1-57位為信號肽基因序列，第58-150位為GLP-I (7-37)基因序列， 第151-195位為肽接頭基因序列，第196-864位為IgG2 Fe基因序列；在GLP-l-Fc-2的基 因序列（SEQ ID N0:2)中，第1-57位為信號肽基因序列，第58-150位為GLP-I (7-37)基因 序列，第151-195位為肽接頭基因序列，第196-876位為IgG2 Fe基因序列；在GLP-l-Fc-3 的基因序列（SEQ ID NO: 3)中，第1-57位為信號肽基因序列，第58-150位為GLP-I (7-37) 基因序列，第151-195位為肽接頭基因序列，第196-861位為IgG2的Fe基因序列。
[0044] 在獲得如上編碼所述融合蛋白的三個融合基因后，采用分子克隆技術，進一步將 上述融合基因克隆至真核表達載體293,構建真核表達載體293-GLP-l-Fc (IgG2)。
[0045] 對于本發明，可以使用任何合適的真核表達載體。
[0046] 二、表達本發明融合蛋白的一般方法
[0047] 用如上所述獲得的表達載體293-GLP-l-Fc(IgG2)轉染宿主真核細胞FreeStyle 293F，使其產生融合蛋白。用重組DNA轉染宿主細胞的技術是本領域熟知的。
[0048] 三、收獲并純化重組產生的融合蛋白
[0049] 三個亞類的IgG (IgGl，IgG2和IgG4)的非抗原結合部分，即Fe段，可與葡萄球菌 蛋白A (Staphylococci Protein A, SPA)結合，借此可純化上述亞類的抗體或含相應亞類 Fe段的融合蛋白，為其工業化制備提供便利純化方法。用Protein A親和柱分離純化得到 Fe融合蛋白。通過SDS-PAGE及Western-blot鑒定融合蛋白。
[0050] 四、本發明所述融合蛋白的體內外活性檢測
[0051] (一）本發明所述融合蛋白在體外與小鼠 P胰腺瘤細胞結合活性檢測
[0052] 用融合蛋白與GLP-I受體（GLP-IR)陽性的小鼠 P胰腺瘤細胞P -TC-6進行直接 結合活性的檢測（方法參考PLoS ONE. 2010; 5(9) :el2734)，結果顯示本發明的融合蛋白與 細胞上GLP-IR的結合呈現特異性的濃度梯度依賴性的增加。本結果提示，本發明所述與Fe 融合的GLP-I可與細胞表面的相應受體特異性地結合。
[0053] (二）本發明所述融合蛋白在體外對cAMP水平的影響
[0054] 將本發明的融合蛋白加入到@ -TC-6細胞中，按文獻所述方法 (Diabetes. 2004;53:2492-2500)測定cAMP水平，結果顯示本發明的融合蛋白在體外引起 cAMP水平升高，效果與利拉魯肽相當。本結果提示，在與細胞表面相應受體結合以后，本發 明所述與Fc融合的GLP-I可激活該受體介導的細胞內信號傳遞。
[0055] (三）本發明所述融合蛋白在體外對小鼠 P胰腺瘤細胞胰島素分泌水平的影響
[0056] 將本發明的融合蛋白加入到P-TC-6細胞中，按文獻所述方法（Shi-Ying Ding, et al. JBC. 2011; 286 (19) :16768-16774, PLoS ONE. 2010; 5(9) :el2734)測定細胞分泌胰島素 的水平，結果顯示在低濃度葡萄糖的培養基中，本發明所述的三種融合蛋白或利拉魯肽對 小鼠 P胰腺瘤細胞P-TC-6的促胰島素分泌作用不明顯；而在含高濃度葡萄糖的培養基 中，濃度為3、30、300和IOOOnM的三種融合蛋白均可不同程度地顯著增加 P -TC-6細胞的 胰島素分泌水平，其效果與利拉魯肽相當，均呈現出濃度梯度依賴性的增加。
[0057] (四）本發明所述融合蛋白對高糖灌注下大鼠血清中胰島素水平的影響
[0058] 根據文獻所述（Diabetes Metab Res Rev. 2010; 26:287-296) (Diabetes. 2004; 53:2492-2500),用正常 SD (Sprague-Dawley)大鼠建立高糖灌注模型以 測定藥物促進血清中胰島素水平升高的方法，為檢測GLP-I類促胰島素藥物常用的藥效檢 測方法。本發明即利用該模型，給SD大鼠皮下注射本發明的融合蛋白（3nM/kg)或利拉魯 肽（3nM/kg，陽性對照）或生理鹽水（陰性對照)，禁食過夜（16-18h)后依次靜脈持續灌注生 理鹽水20分鐘、低濃度葡萄糖（50mg/kg/min)30分鐘、高濃度葡萄糖（150mg/kg/min)30分 鐘。以生理鹽水灌注結束的時間點為0點，分別在_20、0、30和60分鐘時采血。結果顯示， 在皮下注射生理鹽水的健康大鼠組中，靜脈灌注生理鹽水或低濃度葡萄糖后，與無靜脈灌 注組相比，血清胰島素水平無明顯升高，而在靜脈灌注高濃度葡萄糖后，血清胰島素水平顯 著升高。在給予皮下注射本發明的三種融合蛋白或利拉魯肽的健康大鼠組中，對其靜脈灌 注生理鹽水依然不能誘導血清胰島素水平升高，而在低濃度和高濃度葡萄糖靜脈灌注后， 血清胰島素水平均比皮下注射生理鹽水組相應濃度葡萄糖灌注所誘導的胰島素水平有不 同程度的升高。實驗動物體內這種葡萄糖濃度依賴性的促胰島素分泌作用，提示本發明的 GLP-I (7-37)與Fc融合的蛋白皮下注射可吸收，且能夠發揮與利拉魯肽相同的藥理作用。 [0059](五）本發明所述融合蛋白與新生兒受體（FcRn)蛋白結合能力的檢測
[0060]按文獻所述方法（The Journal of Biological Chemistry. 2001; 276 (9) : 6591 - 6 604)，將本發明的融合蛋白包被于酶標板上，加入His標記的FcRn蛋白，在酸性（pH=6. 0)條 件下孵育，用鼠源抗His單抗和辣根過氧化酶（HRP)標記的羊抗鼠抗體（Goat anti-human IgG-HRP)檢測結合于所述融合蛋白上的FcRn。結果顯示，與IgGl型對照抗體的Fe段相 t匕，本發明融合蛋白的Fc段具有與IgGl相當的結合FcRn的能力。由于在血管內皮細胞上 FcRn介導的含Fc段蛋白的細胞內吞和循環能維持血清中該蛋白濃度的穩態，本實驗結果 提示所述GLP-I-Fc融合蛋白的體內半衰期可能與IgGl型抗體相當，遠高于利拉魯肽(需一 天注射一次),將達到1-2周注射一次的頻率。
[0061](六）本發明所述融合蛋白的效應子活性檢測
[0062]按文獻所述方法（Angiogenes i s. 2004 ; 7 : 335-345，Cancer Res. 2010:4481-4489)，將Fe Y Rma (CD16a)蛋白包被于酶標板上，將本發明的融合蛋白加 入板中，檢測其與Fe Y RIIIa (⑶16a)蛋白的結合能力。結果顯示，與IgGl型對照抗體的Fc 段相比，本發明融合蛋白的Fc段與Fe Y RIIla (CD 16a)蛋白的結合能力極低，從而可避免其 Fe段的效應子功能(如ADCC)。
[0063] 如上所述，體外及體內生物學活性的檢測結果表明，本發明制備的三種融合蛋白 不僅具有GLP-I (7-37)多肽正常的生物學活性，其生物半衰期較GLP-I (7-37)多肽明顯 延長，而且其Fe段的效應子功能低，不會發生與治療目的不相關的效應子功能，使藥物的 使用更安全。
[0064] 本發明的積極效果在于：融合蛋白中GLP-I (7-37)可保持其天然功能，人IgG2型 Fe部分則能夠延長其半衰期，而且有利于融合蛋白的純化，同時不引起與治療作用不相關 的效應子作用。
[0065] 本發明中融合蛋白半衰期延長的原因如下：
[0066] DGLP-I (7-37)部分的第8位氨基酸由丙氨酸(Ala)替換為甘氨酸（Gly)，可降低 DPP-4對其的降解，從而延長半衰期。
[0067] 2)所述融合蛋白的Fe部分可與FcRn結合，從而使該融合蛋白的半衰期與IgGl型 和IgG2型抗體相當。
[0068] 下列實施例用于幫助描述如何實施本發明的各實施方案。這些實施例是為了舉例 說明，而不是以任何方式限制本發明的范圍。
[0069] 實施例1本發明所述融合蛋白表達載體的構建
[0070] 編碼本發明所述融合蛋白GLP-I-Fc-I的基因 （SEQ ID NO: 1)由上海捷瑞生物工 程有限公司合成并克隆至PGEM-T質粒載體，該基因5'端含有EcoR I、Not I、Hind III酶 切位點，3'端含有TGA終止密碼子和Pme I、Xho I、BamH I酶切位點，將所述pGEM-T質粒 載體命名為GLP_l_Fc_l _T。
[0071] 用EcoR I和BamH I (購自NEB公司）按照說明書對GLP-I-Fc-I-T進行雙酶消化 (37°C，4小時)，1%瓊脂糖凝膠電泳（圖2A)顯示，雙酶消化后產生長度為950bp左右的編碼 GLP-I-Fc-I融合蛋白的基因片段和長度為3000bp左右的pGEM-T質粒載體片段。使用膠 回收試劑盒按照說明書說明回收基因片段GLP-I-Fc-I (膠回收試劑盒購自Axygen公司）。 同時將 293 表達載體（FreeStyle MAX293Expression System，K900-20,購自 Invitrogen 公 司）用EcoR I和BamH I雙酶消化（37°C，4小時)。圖2A示出了雙酶消化后長度為4300bp 左右的293-EcoR I/BamH I片段，使用上述膠回收試劑盒回收該片段。
[0072] 將上述酶切獲得的兩個基因片段GLP-I-Fc-I和293-EcoRI/BamHI用T4DNA連 接酶(購自NEB公司）進行連接（16°C，16小時)，連接產物使用熱休克法轉化到大腸桿菌中 (42 °C，90秒)，鋪板(Amp+LB培養基，即氨芐抗性的Lur ia-Bertan i培養基)，挑取克隆并提取 質粒。將質粒用EcoR I/BamH I雙酶消化（37°C，2小時)進行鑒定篩選，篩選得到的陽性克 隆即含有構建成功的真核表達載體293-GLP-l-Fc-l (如圖2C所示)。
[0073] 以GLP-I-Fc-I-T質粒為模板，分別以1，2和3, 4為引物，經聚合酶鏈反應（PCR)擴 增獲得GLP-l-Fc-2對應基因的兩段中間產物；再以所述兩段中間產物為模板，1，4為引物， 經overlap-PCR (重疊 PCR)擴增獲得GLP-l-Fc-2的基因片段。
[0074] 以GLP-I-Fc-I-T質粒為模板，1，4為引物，經PCR擴增獲得GLP-l-Fc-3的基因片 段。
[0075] PCR引物如下：
[0076] L 5, -GCGGCCGCGAATTCATGGAGTTGGGACTGTCTTG-3' （SEQ ID N0:7)
[0077] 2. 5'-CCACCGCCACCGTCGCTCGCGTTTACAACACAGCTC-3'（SEQ ID N0:8)
[0078] 3. 5,-GGTGGCGGTGGCAGCGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGC-3，（SEQ ID N0:9)
[0079] 4. 5,-GTTTAAACGGATCCTCAACCCGGAGACAGGGAGAG-3'（SEQ ID N0:10)
[0080] 圖2B顯示的分別是長度均為950bp左右的編碼GLP-l-Fc-2和GLP-l-Fc-3融合 蛋白的基因片段。使用上述方法回收基因片段GLP-l-Fc-2和GLP-l-Fc-3,用EcoR I和 BamH I雙酶消化（37°C，4小時)，與同樣用EcoR I和BamH I雙酶消化（37°C，4小時）后的 293-EcoR I/BamH I片段用T4DNA連接酶連接（16°C，16小時)，將連接產物使用熱休克法轉 化大腸桿菌（42°C，90秒)，鋪板(Amp +LB培養基)，挑取克隆并提取質粒。將質粒用EcoR 1/ BamH I雙酶消化（37°C，2小時）進行鑒定篩選，篩選得到的陽性克隆即分別含有構建成功 的真核表達載體293-GLP-1-FC-2和293-GLP-1-FC-3 (如圖2D所示)。
[0081] 圖1為構建成功的融合蛋白表達載體293-GLP-l-Fc (IgG2)的基因結構圖。 293-GLP-l-Fc-l、293-GLP-1-FC-2 和 293-GLP-1-FC-3 三種表達載體的基因結構相同， 不同的是在EcoR I和BamH I酶切位點之間950bp左右的基因分別編碼GLP-I-Fc-I、 GLP-l-Fc-2和GLP-l-Fc-3融合蛋白，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO: 1，SEQ ID NO:2和 SEQ ID NO: 3所示，其編碼的氨基酸序列分別如SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6 所示。圖2C和圖2D的結果則分別顯示了真核表達載體293-GLP-l-Fc-l、293-GLP-l-Fc-2 和293-GLP-l-Fc-3經EcoR I/BamH I雙酶消化后鑒定的結果，其在950bp和4300bp左右 處分別有正確的融合蛋白基因片段和293-EcoR I/BamH I片段。
[0082] 實施例2本發明所述融合蛋白的表達
[0083] 實施例1中所構建的重組表達載體293-GLP-l-Fc-l、293-GLP-l-Fc-2和 293-GLP-1-FC-3 的表達，可采用瞬時轉染 FreeStyle293F 細胞（R790-07,購自 Invitrogen 公司）的方法。轉染前24小時，將FreeStyle293F細胞按6 X IO5個細胞/毫升（ml)傳代，于 恒溫搖床135轉，37°C，8%C02條件下培養，使得轉染當天的細胞密度約為1. 2?I. 5 X IO6/ ml。用FreeStyle293F培養基（12338-018,購自Invitrogen公司）稀釋細胞，至密度為 I X IOfVml。為確保最佳轉染效果，細胞活力應大于95%。
[0084] 將轉染用試劑FreeStyle Max Reagent( 16447-500,購自 Invitrogen 公司）輕度顛 倒混勻4次。在轉染用培養液OptiPRO SFM (12309-050,購自Invitrogen公司）中分別加 入 625 ii g293-GLP-l-Fc-l 或 293-GLP-1-FC-2 或 293-GLP-1-FC-3 載體質粒，并用 OptiPRO SFM補充體積至IOml,混勻。另取一支離心管，用OptiPRO SFM稀釋625 u I FreeStyleMax Reagent至IOml,輕度顛倒混勻。將稀釋的質粒和稀釋的FreeStyle Max Reagent混勻，室 溫孵育15分鐘。緩慢將20ml混合液加入裝有500ml FreeStyle293F培養基的搖瓶中。搖 瓶于恒溫搖床培養7天（135轉，37°C，8%C0 2)。
[0085] 7天后，將分別表達GLP-I-Fc-I或GLP-l-Fc-2或GLP-l-Fc-3三種融合蛋白的細 胞用冷凍離心機以9000轉/分的速度離心20分鐘，收集上清液進行下一步蛋白純化。
[0086] 實施例3本發明所述融合蛋白的純化
[0087] 將上述實施例2獲得的分別含本發明的三種融合蛋白的FreeStyle293F細 胞上清液，在AKTA儀器（購自GE Healthcare Bio-Sciences公司）上過Protein A柱 (71-5000-09AD，購自GE Healthcare Bio-Sciences公司），分別捕獲三種融合蛋白，用 50mM檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（PH=3. 3)洗脫，分別收集洗脫物(各約0. 5ml)，在其中加 入100 iillM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸（TriS-HCL)緩沖液（PH=ILO)中和至中性。經 0D280nm測定各自的蛋白含量后，分別經IOK透析膜在磷酸鹽緩沖液PBS (0. OlM Na2HPO4 .12H20+0. 002M KH2P04P+0. 14M NaCl+0. 002M KC1，PH=7. 2)中透析，經 0? 22 ii m 濾器(購自 Millipore公司）過濾除菌后-80°C保存。
[0088] 實施例4本發明所述融合蛋白的SDS-PAGE和Western-blot檢測
[0089] 純化后的三種融合蛋白經50mM DTT (二硫蘇糖醇，DL-Dithiothreitol)還原 后用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測其純度和分子量大小，同時通過Western-blot進一 步鑒定其性質和分子量。將電泳后的膠通過電轉移方法（300mA，80分鐘）轉移至PVDF (Polyvinylidene Fluoride,聚偏氟乙烯）膜上，將膜用10%脫脂奶粉封閉后加入Iii g/ml 抗人GLP-I (7-37)鼠單抗(購自BioPorto公司），4°C孵育過夜，PBST (含0.02%吐溫-20 的PBS緩沖液）洗兩遍，加入HRP標記的羊抗鼠 IgG (H+L)抗體（I ii g/ml，購自R&D公司）， 室溫孵育45分鐘后再用PBST洗兩遍，最后用電化學發光法（Electrochemiluminescence， ECL)顯色。聚丙烯酰胺凝膠電泳（圖3A)和Western-blot (圖3B)的結果均顯示，在還原條 件下，所述的三種融合蛋白GLP-l-Fc-1、GLP-l-Fc-2、GLP-l-Fc-3均呈現分子量為約40KDa 的條帶，與所述融合蛋白的理論分子量一致。這些結果表明，本發明所構建的三種融合蛋 白，其結構和性質均正確。
[0090] 實施例5本發明所述融合蛋白體外結合P -TC-6細胞的活性測定
[0091] 收集小鼠 P胰腺瘤細胞P-TC-6 (購自ATCC) 8. 5 X IO6個，離心后用8.5ml固定 液（IC Fixation buffer,購自Invitrogen公司）固定（4°C，10分鐘）。再次離心后用3.4ml PBS重懸，以2.5X10 5/孔（IOOiil)接種于96孔U型板。同時分別將本發明的三種融合蛋 白各從500 ii g/ml開始，用PBS進行4倍比稀釋共10個梯度。
[0092] 96孔U型板的細胞經離心后棄上清，按照100 iil/孔加入稀釋后的融合蛋白，4°C 孵育1小時。再次將細胞離心，棄上清，用200 iil/孔PBS洗滌兩次，加入I ii g/ml( 100 iil/ 孔)HRP標記的羊抗人抗體IgG (購自Bethyl laboratories公司)，并在4°C孵育45分鐘。 細胞離心后，用200 iil/孔PBS洗滌三次，加入100 iil/孔顯色液(底物緩沖液9ml+底物顯 色液lml+0. 3%H202溶液10 iil，其中底物緩沖液為0. 02M檸檬酸+0. OlM Na2HPO4. 12H20,底 物顯色液為2mg/ml的TMB，即3,3'，5,5'-四甲基聯苯胺)，室溫孵育15分鐘顯色后加入 50 iil/孔終止液（1M硫酸)，在M5多功能酶標儀(購自Molecular Devices公司)450/570nm 波長下讀出吸光值，結果在圖4示出。
[0093] 如圖4所示，本發明的三種融合蛋白GLP-l-Fc-l、GLP-l-Fc-2和GLP-l-Fc-3均與 3 -TC-6細胞表面的GLP-IR呈現特異性的結合活性。
[0094] 實施例6本發明所述融合蛋白在體外對P -TC-6細胞cAMP水平的影響
[0095] P-TC-6細胞以IXlO4/孔（5 iil/孔，無血清不含葡萄糖的DMEM培 養基，購自Gibco公司）接種于384孔板，加入含5000 ii M cAMP抑制劑IBMX (3-isobutyl-l_methylxanthine，3-異丁基-1-甲基黃噪呤，購自Sigma公司）的無血清不 含葡萄糖的DMEM培養基5 iil/孔(使IBMX終濃度為2500 ii M)，使所述細胞在37 °C孵箱饑 餓4-5小時。
[0096] 將384孔板以800轉/分鐘離心1分鐘，棄5 iil/孔上清后，加入250mM葡萄糖及 25mM IBMX各I iil/孔，再分別加入本發明的三種融合蛋白和對照藥物利拉魯肽(購自Novo Nordisk公司）各I iil/孔，使三種融合蛋白和利拉魯肽的終濃度均為2、10、50和250nM四 個濃度，以不加蛋白或加入利拉魯肽的組（OnM)為對照，最后加入I iU/孔無血清不含葡萄 糖的DMEM培養基，輕搖384孔板混勻，室溫作用30分鐘。
[0097] 根據cAMP檢測試劑盒（dynamic2Kit，購自Cisbio公司）的實驗步驟設立對照及 標準曲線，M5多功能酶標儀讀數（Flu668/620nm)，結果在圖5示出。
[0098] 圖5的結果顯示，不同濃度的本發明的三種序列的融合蛋白在體外均可不同程度 地升高小鼠 P胰腺瘤細胞P-TC-6內的cAMP水平，其效果與利拉魯肽相當，均呈現出濃度 梯度依賴性的增加。本結果提示，繼與細胞表面相應受體結合以后，與Fc融合的GLP-I可 激活該受體介導的細胞內信號傳遞。
[0099] 實施例7本發明所述融合蛋白在體外對P -TC-6細胞胰島素分泌水平的影響
[0100] 將培養在含10%FBS(胎牛血清，購自Gibco公司）的DMEM培養基中的P-TC-6細胞 以2. 5X105/孔（500 ill)接種于24孔板，37°C培養過夜。棄上清，用Krebs-Ringer Buffer (KRB 緩沖液，125mM NaCl+5.9mM KCl+1.28mM CaCl2+1.2mM MgCl2+25mM HEPES+0.1%BSA， pH7. 4)洗滌一次后再加入KRB緩沖液，37°C饑餓細胞2小時。棄上清，分別加入不同濃度 的所述三種融合蛋白和對照藥物利拉魯肽，使四種樣品的終濃度均為〇、3、30、300、IOOOnM 四種(稀釋液均為KRB緩沖液+16. 8mM葡萄糖)，以不加所述四種樣品的低濃度葡萄糖組(含 KRB緩沖液+2. 8mM葡萄糖）作為陰性對照組（neg)，37°C作用1小時。
[0101] 根據胰島素檢測試劑盒（Insulin Kit,購自Cisbio公司）的實驗步驟設立對照及 標準曲線。胰島素標準品的初始濃度為20ng/ml，以二倍比稀釋7個梯度，同時用KRB緩沖 液稀釋樣品(所述細胞上清）至〇?20ng/ml (稀釋10倍)，分別取10 ill的KRB緩沖液、稀 釋的標準品、稀釋的樣品加至384孔板中，再分別加入5 iU/孔兩種熒光標記的抗體抗胰島 素 Ab-cryptate和抗膜島素 Ab_XL665 (均來自Insulin Kit，購自Cisbio公司），輕搖384 孔板混勻，室溫孵育2小時。M5多功能酶標儀讀數(波長1 :激發/發射=314nm/668nm ;波 長 2 :激發 / 發射=314nm/620nm)。
[0102] 數據處理如下：比值（Ratio) =A668nm/A620nmX 104，Deta F=(標準品或樣品比 值-KRB比值）/KRB比值，繪制標準曲線，并計算出樣品胰島素的值。
[0103] 圖6的結果顯示，在體外普通細胞培養基(結果未顯示）或含低濃度葡萄糖 (2. 8mM)的培養基中（neg)，本發明所述的三種融合蛋白或利拉魯肽對小鼠 P胰腺瘤細胞 3 -TC-6的促胰島素分泌作用不明顯（以此為對照）；而在含高濃度葡萄糖（16. 8mM)的培養 基中，不含樣品的陰性對照組（〇. 〇)對0 -TC-6細胞的促胰島素分泌作用有所增加，3、30、 300、IOOOnM的三種融合蛋白則均可不同程度地顯著升高P -TC-6細胞的胰島素分泌水平， 其效果與利拉魯肽相當，均呈現出濃度梯度依賴性的增加。本結果提示，與Fc融合的GLP-I 激活細胞表面相應受體的最終效應為葡萄糖濃度依賴性地促進胰島素的分泌。
[0104] 實施例8本發明所述融合蛋白對高糖灌注下大鼠血清中胰島素水平的影響
[0105] 給SD (Sprague-Dawley)大鼠皮下注射本發明的三種融合蛋白（3nM/kg)或利拉 魯肽（3nM/kg)或生理鹽水（陰性對照)，禁食過夜（16-18h)后依次靜脈持續灌注生理鹽水 20分鐘、低濃度葡萄糖（50mg/kg/min)30分鐘、高濃度葡萄糖（150mg/kg/min)30分鐘。以 生理鹽水灌注結束的時間點為0點，分別在_20、0、30和60分鐘時采血。將血液以4000 轉/分鐘離心10分鐘，分離血清，用文獻（Diabetes Metab Res Rev. 2010;26:287-296) (Diabetes. 2004;53:2492-2500)所述方法測定血清中胰島素水平。
[0106] 圖7A和圖7B的結果顯示，在皮下注射生理鹽水的健康大鼠組（陰性對照組）中， 靜脈灌注生理鹽水或低濃度葡萄糖后，與無靜脈灌注組（0)相比，血清胰島素水平無明顯升 高；而在靜脈灌注高濃度葡萄糖后，血清胰島素水平顯著升高。在給予皮下注射本發明的三 種融合蛋白或利拉魯肽的健康大鼠組中，對其靜脈灌注生理鹽水依然不能誘導血清胰島素 水平的升高；而在低濃度和高濃度葡萄糖靜脈灌注后，血清胰島素水平均比皮下注射生理 鹽水組相應濃度葡萄糖灌注所誘導的胰島素水平有不同程度的顯著升高。實驗動物體內這 種葡萄糖濃度依賴性的促胰島素分泌作用，提示本發明所述的融合蛋白皮下注射可吸收， 且能夠發揮與利拉魯肽相同的藥理作用。
[0107] 實施例9本發明所述融合蛋白與FcRn結合能力的檢測
[0108] 將本發明的三種融合蛋白和IgGl型對照抗體（Remicade，購自西安楊森公司）分 別用PBS稀釋至5 ii g/ml，按照100 iil/孔加入酶標板中，4°C包被過夜。PBST洗板4次后加 入1%BSA(牛血清白蛋白）300iU/孔，室溫封閉1小時。PBST(PH=6.0)洗板4次后，將FcRn 蛋白（購自Sino Biological公司）用PBS緩沖液從5 ii g/ml開始二倍比稀釋共7個梯度， 按照100 Ul/孔加入酶標板中，在酸性（pH=6. 0)條件下室溫孵育1小時。PBST (PH=6. 0)洗 板4次，將抗His的鼠單抗(購自R&D公司）用PBS緩沖液稀釋至I ii g/ml，按照100 iil/孔 加入酶標板中，室溫孵育1小時。PBST (PH=6. 0)洗板4次，將HRP標記的羊抗鼠抗體（Goat anti-mouse IgG-HRP,購自R&D公司）用PBS緩沖液稀釋至I ii g/ml，按照100 ii 1/孔加入 酶標板中，室溫孵育1小時。PBST (PH=6. 0)洗板4次，加入100 iil/孔TMB顯色液，室溫孵 育15分鐘顯色，加入50 iil/孔終止液，在M5多功能酶標儀上450/570nm波長下讀出吸光 值，結果在圖8示出。
[0109] 圖8的結果顯示，本發明的三個序列融合蛋白的Fc段均具有與IgGl型對照抗體 的Fc段相當的結合FcRn的能力。由于在血管內皮細胞上FcRn介導的含Fc段蛋白的細胞 內吞和循環能維持血清中該蛋白濃度的穩態，本實驗結果提示GLP-I-Fc融合蛋白的體內 半衰期可能與IgGl型抗體相當，遠高于利拉魯肽(需一天注射一次)，將達到1-2周注射一 次的頻率。
[0110] 實施例1〇本發明所述融合蛋白的Fc段效應子活性檢測
[0111] 將 Fe Y RIIIa(CD16a)蛋白（購自 Sino Biological 公司）用 PBS 緩沖液稀 釋至0. 25iig/ml，按照IOOiil/孔加入酶標板中，4°C包被過夜。PBST洗板4次后加 入l%BSA300iil/孔，室溫封閉1小時。本發明的三種融合蛋白和對照品IgGl型抗體 (Herceptin，購自Roche公司)從200 ii g/ml開始4倍比稀釋共7個梯度，分別與從100 ii g/ ml開始4倍比稀釋的兔抗人K鏈抗體（Rabbit Anti-Human K，購自R&D公司，共7個梯 度）按1:1混勻，室溫孵育1小時。PBST洗板4次后，將孵育后的混合溶液以100 iil/孔 加入所述包被有Fe Y RHIa(⑶16a)蛋白的酶標板中，室溫孵育2小時。PBST洗板4次后， 以100 Ul/孔加入PBS稀釋的I ii g/ml HRP標記的羊抗人IgG H&L鏈的F(ab'）2抗體片 段（Goat anti-Human IgG H&L chain F(ab，）2Fragment_HRP，購自 CalBiochem 公司），室 溫孵育1小時。PBST洗板4次，加入100 iil/孔TMB顯色液，室溫孵育15分鐘顯色后加入 50 iil/孔終止液，在M5多功能酶標儀上450/570nm波長下讀出吸光值，結果在圖9示出。
[0112] 圖9的結果顯示，與IgGl型對照抗體的Fc段相比，本發明的三種融合蛋白的Fc段 與Fe Y RIIIa (⑶16a)蛋白的結合能力均很低，從而可避免其Fe段的效應子功能(如ADCC)， 降低藥物的副作用。
【權利要求】
1. 一種融合蛋白，其由胰高血糖素樣肽-1的C末端通過肽接頭與IgG2Fc部分的N末 端融合而成。
2. 如權利要求1所述融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5或SEQ ID NO :6所示。
3. -種編碼如權利要求1或2所述融合蛋白的基因。
4. 如權利要求3所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2或SEQ ID NO:3所示。
5. -種制備如權利要求1或2所述融合蛋白的方法，其包括： a. 構建如權利要求3或4所述的基因； b. 將步驟a所述基因克隆到真核表達載體，得到可表達如權利要求1所述融合蛋白的 真核表達載體； c. 用步驟b所述表達載體轉染細胞，使其表達所述重組融合蛋白，然后分離純化得到 所述融合蛋白。
6. 如權利要求5所述的方法，其中真核表達載體為293。
7. 如權利要求5所述的方法，其中所用細胞為Freestyle 293F細胞。
8. -種制劑，其含有如權利要求1或2所述融合蛋白作為其活性成分，其還可以含有一 種或多種可藥用載體。
9. 如權利要求1或2所述融合蛋白或含有其的制劑在制備用于治療和/或預防II型糖 尿病、肥胖以及通過降低血清葡萄糖、抑制胃腸運動和排空或抑制食物攝入而受益的其它 疾病的藥物中的用途。
10. 如權利要求3或4所述基因在制備用于治療和/或預防II型糖尿病、肥胖以及通 過降低血清葡萄糖、抑制胃腸運動和排空或抑制食物攝入而受益的其它疾病的藥物中的用 途。
【文檔編號】A61K48/00GK104277112SQ201310280199
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年7月4日 優先權日:2013年7月4日
【發明者】周新華, 周清, 陳如雷, 石姝, 粘偉紅, 閆洪濱 申請人:嘉和生物藥業有限公司