一種融合蛋白、其制備方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物制品領域，更確切的講是一種融合蛋白及其應用。
【背景技術】
[0002] 細胞因子在機體免疫反應中起著不可替代的作用，白介素-21 (IL21)是2000年被 發現的一種四螺旋束細胞因子，IL21主要是由活化的CD4+化細胞分泌。其基因定位于四號 染色體長臂26-27 (4q26-27)位，編碼產生的多膚前體是由162個氨基酸組成，后經過Gly 酶切，在第31為斷開形成含131個氨基酸殘基、分子量為15KD的成熟IL21分子。IL21受 體IL21R屬于I型細胞因子受體，是由a鏈和YC鏈組成，受體分布廣泛，主要存在于T細 胞、B細胞、NKT細胞、DC細胞及角質化細胞等表面。IL21在固有免疫和適應性免疫中發揮 重要的調節作用，是一種重要的的免疫調節因子。由于IL21分子量比較小，分子不穩定，在 體內容易降解，因此大制備困難。
[0003] 現有技術中的IL21的制備方法復雜、成本高昂。現有技術中制備IL21的方法中， 直接在大腸桿菌中上清表達，使用的載體為PGEX4-T，表達產物帶有GST標簽，后期需要將 GST標簽去除，工藝復雜、成本較高。也有在畢赤酵母中表達，使用的表達載體為PPIC9K，即 通過高卡郝抗性篩選表達量價高的克隆，由于IL21穩定性較差，因此制備困難。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種具有較長半衰期且穩定性良好的細胞因子IL21融合 蛋白，及其應用。
[0005] 本發明的另一目的是提供一種制備所述IL21融合蛋白的方法。
[0006] 本發明的再一目的是提供一種制備IL21蛋白的方法。
[0007] 在本發明的第一方面，提供了一種融合蛋白，所述融合蛋白具有式la或式Ib所述 結構：
[0008]A-B-C (la)，或
[0009]C-B-A (扣）
[0010] 其中，
[0011] A為包括白介素-21的多膚元件；
[001引 B為連接膚；
[0013] C為包括血清白蛋白的多膚元件；
[0014]"-"表示連接上述各元件的膚鍵。
[0015] 在另一優選例中，所述白介素-21為哺乳動物的白介素-21。優選地，所述白介 素-21為人白介素-21。
[0016] 在另一優選例中，所述血清白蛋白為哺乳動物的血清白蛋白。優選地，所述血清白 蛋白為人血清白蛋白。
[0017] 在另一優選例中，所述元件A的長度為100-200個氨基酸。
[0018] 在另一優選例中，所述元件A包含SEQIDNO: 1中第30-162位所示的氨基酸序列 并且長度為133-170個氨基酸。
[0019] 在另一優選例中，所述元件A的氨基酸序列如SEQIDNO. : 1中第30-162位所示。
[0020] 在另一優選例中，所述的元件C包含SEQIDN0:2中第25-609位所示的氨基酸序 列，并且長度為585-650個氨基酸序列。
[002。 在另一優選例中，所述元件C的氨基酸序列如SEQIDNO. : 2中第25-609位所示。
[0022] 在另一優選例中，所述連接膚的長度為0-10氨基酸，較佳地為1-5個氨基酸。更 佳地，所述連接膚為GGGGS。
[0023] 在另一優選例中，編碼所述融合蛋白的核巧酸序列如SEQIDNO. : 4所示。
[0024] 在另一優選例中，所述融合蛋白具有W下特性：
[00巧]a)具有免疫調節活性；
[0026] 能夠調節免疫細胞分化，提高NK細胞，CTL細胞殺傷活性；
[0027] b)可抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲，促進腫瘤細胞的調亡；和
[002引C)血漿半衰期> 3天。較佳地> 4天，最佳地> 5天。
[0029] 在另一優選例中，所述免疫調節活性是指所述融合蛋白能夠調節免疫細胞分化， 提高NK細胞和/或提高CTL細胞殺傷活性。
[0030] 在另一優選例中，所述可抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲是指所述融合蛋白能夠抑制 黑色素瘤細胞遷移和侵襲和/或促進化rkat細胞調亡。
[0031] 在本發明的第二方面，提供了一種分離的多核巧酸，所述多核巧酸編碼根據本發 明第一方面的融合蛋白。
[003引在另一優選例中，所述的多核巧酸序列如SEQIDN0:4所示。
[0033] 在本發明的第H方面，提供了一種載體，所述載體包括根據本發明第二方面的多 核巧酸。
[0034] 在本發明的第四方面，提供了一種宿主細胞，
[0035] 所述宿主細胞表達根據本發明第一方面的融合蛋白；和/或
[0036] 所述宿主細胞含有本發明第H方面所述的載體；和/或
[0037] 所述宿主細胞基因組中整合有本發明第二方面所述的多核巧酸。
[0038] 在另一優選例中，所述宿主細胞為原核細胞或真核細胞（如酵母細胞）。
[0039] 在另一優選例中，所述宿主細胞為畢赤酵母GS115菌株。
[0040] 在本發明的第五方面，提供了一種制備融合蛋白的方法，包括步驟：
[0041] 在適合表達的條件下，培養第四方面所述的宿主細胞，從而表達出第一方面所述 的融合蛋白；和
[0042] 分離所述融合蛋白。
[0043] 在另一優選例中，所述宿主細胞為原核細胞或真核細胞。優選地，所述宿主細胞為 酵母細胞。更優選地，所述酵母細胞為畢赤酵母，如GS115菌株。
[0044] 在本發明的第六方面，提供了一種制備白介素-21或其類似物的方法，所述方法 選自：
[0045] (a)將本發明第一方面的融合蛋白降解為白介素-21或其類似物；和
[0046] 分離純化所述白介素-21或其類似物；和
[0047] (b)將白介素-21基因在含有稀有密碼子的大腸桿菌菌株中表達白介素-21包涵 體。
[0048] 在另一優選例中，所述化）中大腸桿菌菌株為化21 (RP)菌株。
[0049] 在另一優選例中，所述化）中還包括將所述包涵體復性的步驟。
[0050] 在本發明的第走方面，提供了一種藥物組合物，所述組合物包含：
[0051] 第一方面的融合蛋白，W及藥學上可接受的載體或賦形劑。
[0052] 在本發明的第八方面，提供了本發明第一方面所述的融合蛋白的用途，用于制備 治療疾病的藥物。
[0053] 在另一優選例中，所述的疾病選自；腫瘤和低蛋白血癥。
[0054] 在另一優選例中，所述腫瘤包括；大腸癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、腎細胞癌和/ 或結腸癌。
[0055] 應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術特征之間都可W互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[005引圖1顯示人血清白蛋白化SA)基因和IL21基因PCR、融合基因化U拼接PCR電泳 圖譜。
[0057] 圖2顯示線性化處理PPIC9-HI質粒，回收鑒定電泳圖譜。
[0058] 圖3顯示畢赤酵母表達融合蛋白（80邸左右），SDS-PAGE檢測圖譜，其中1-6泳道 為融合蛋白服A-IL21在GS115中表達鑒定電泳，可見融合蛋白在GS115中有表達。
[0059] 圖4顯示融合蛋白HSA-IL21產物純化后電泳圖譜。
[0060] 圖5顯示IL21的PCR電泳結果。
[0061] 圖6顯示IL21在大腸桿菌化21中的表達情況。
[006引圖7顯示IL21在含有稀有密碼子的化21觸）菌株中的表達情況。
[0063] 圖8顯示IL21和融合蛋白HSA-IL21的活性檢測結果。
[0064] 圖9顯示融合蛋白HSA-IL21的安全性檢測結果。
[0065]圖10顯示包涵體表達的IL21的穩定性（SDS-PAGE檢測），其中圖10A為剛復性成 功的IL21蛋白；圖10B為-2(TC保存2周的IL21蛋白；圖10C為-2(TC保存3個月的IL21 蛋白；圖10D為-2(TC保存約6個月的IL21蛋白。
[0066]圖11顯示包涵體表達的IL21的穩定性（Native-PAGE檢測），其中圖11A為剛復 性成功的IL21蛋白；圖11B為-2(TC保存2周的IL21蛋白；圖11C為-2(TC保存3個月的 IL21蛋白；圖11D為-2(TC保存約6個月的IL21蛋白。
[0067]圖12顯示融合蛋白HSA-IL21的穩定性（SDS-PAGE檢測），其中圖12A為剛純化的 融合蛋白HSA-IL21;圖12B為-20°C保存兩周的融合蛋白HSA-IL21;圖12C為-20°C保存H 個月的融合蛋白HSA-IL21;圖12D為-2(TC保存六個月的融合蛋白HSA-IL21。
[0068] 圖13顯示現純化的融合蛋白HSA-IL21的western-blot檢測其降 解情況。圖13A中一抗為鼠抗人IL21-Ab，二抗為兔抗鼠IgG-HRP;圖13B中一抗為鼠抗人 His-tag-Ab;二抗為兔抗人IgG-HRP。
[0069] 圖14顯示融合HSA-IL21的體內半衰期。
[0070] 圖15顯示了不同保存時間的融合蛋白和IL21的生物活性。
[0071] 圖16顯示IL21-linke;r-HSA融合蛋白在畢赤酵母中無法表達。
【具體實施方式】
[0072] 本發明人通過廣泛而深入的研究，意外地獲得了一種通過酵母發酵制備IL2U白 介素-21)的方法，該方法中將IL21基因與人血清白蛋白基因N端融合，構建到酵母表達載 體中，