一種hcv多表位肽與截短型ns3、dc活化分子eda重組蛋白疫苗及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種HCV多表位肽與截短型NS3、DC活化分子EDA重組蛋白及其應用，該重組蛋白疫苗包括以下EDA，ΔNS3以及3個HCVmulti-epitopes：其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。HCVEDA-ΔNS3-VAL-44蛋白可以誘導出特異性的體液免疫應答以及T細胞免疫應答，T細胞經過特異性抗原刺激以后可以迅速產生IFN-γ并產生高效的CTL，該種HCV多表位肽及其與截短型NS3、DC活化分子EDA重組蛋白疫苗可能是較理想的HCV預防/治療性候選疫苗。
【專利說明】—種HCV多表位肽與截短型NS3、DC活化分子EDA重組蛋白疫苗及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于HCV疫苗【技術領域】，涉及一種HCV多表位肽與截短型NS3、DC活化分子EDA重組蛋白疫苗及其應用。
【背景技術】
[0002]丙型肝炎病毒(h印atitis C virus，HCV)，為黃病毒屬的單股正鏈嗜肝RNA病毒，是引發慢性肝病的主要病原體，全球約有1.7億感染者，發病人數以每年三百萬速度遞增。慢性HCV感染與肝硬化和肝癌直接相關，嚴重影響患者生活質量。由于HCV標準治療方案費用高昂，療效不理想使得發展中國家大多數HCV感染患者難以承受。因此研發HCV疫苗成為降低HCV所引發的肝硬化，肝癌發生率最為有效的策略之一。
[0003]HCV基因組分別編碼核心蛋白C，包膜蛋白El、E2，p7和6種非結構蛋白(NS2、NS3，NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。但由于HCV病毒RNA聚合酶缺乏校對功能，病毒變異率高，尤其是位于包膜糖蛋白E2的中和抗原位點存在高變區，傳統的以產生保護性抗體為主的疫苗研發面臨重重困難。
[0004]研究表明，急性病患體內多特異性CTL可以使病情逐漸轉歸、自愈。慢性HCV病人T細胞應答雖然具有多克隆以及多特異性，但強度遠不如急性病人的免疫應答強烈，相對較弱的抗HCV免疫應答導致病毒難以被清除。與此同時，肝內大量的HCV特異性CD8+T細胞分泌Y干擾素的水平受到抑制，因此，慢性HCV感染時CD8+T細胞功能障礙是造成免疫系統不能控制HCV復制，導致疾病慢性化的主要原因。
[0005]近10年來，對HCV感染發病機制、保護性免疫應答和病毒持續感染機制的認識取得了較大進展。中和抗體以及CD4+和CD8+T細胞所引發強烈的T細胞免疫應答已被證明與HCV的清除相關，這將是研制丙型肝炎疫苗的希望所在。
[0006]大量證據表明，HCV非結構蛋白介導的持續性、強烈的、多特異性的Thl型細胞免疫應答水平直接關系到病毒是否能被清除以及疾病的預后。由于大多數慢性患者HCV亞型的差異，成功的疫苗應該誘導產生強烈的多特異性免疫應答，包括CD4+及CD8+T細胞免疫應答。因此，HCV表位疫苗更傾向于選取保守區域。
[0007]本研究前期將篩選出的HCV 2個CTL表位:NS5A(1991-1999) VLSDFKVWL以及NS4B (1793-1801) SMMAFSAAL,加入一個通用 Th 表位 KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRL 進行了不同的組合，包括是否含有Th表位，共合成了 8條不同排列組合方式的多肽，經過小鼠體內試驗，合成肽與HLA-A*0201相對親和力和穩定性檢測以及與HCV病人PBMC相作用3部分實驗初步確定了 VLSDFKVWLKKKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLKKSMMAF
SAAL (簡稱VAL-44)這種排列組合方式效果最優，將這種HCV多肽疫苗皮下免疫HHD-2小鼠后，可以引起脾細胞增殖，⑶4+、⑶8+T淋巴細胞百分比增高以及以Thl型反應為主的細胞免疫應答，但總體來說，免疫效果尚不十分理想，為了克服肽疫苗免疫源性較弱的缺陷，我們最終選擇了纖連蛋白外部結構域A (Fibronectin Extra Domain A,EDA),聯合截短的NS3插入到3個多表位的上游，構建起EDA-ANS3-VAL-44原核表達載體，經過誘導蛋白表達，純化得到EDA- A NS3-VAL-44目的蛋白，輔以能夠活化To 11樣受體 3 的免疫佐劑 poly (1: C) (Yu-sheng Cheng and Feng Xu.Anticancer function ofpolyinosinic-polycytidylic acid.Cancer Biology & Therapy.2010;10:1219-1223)對小鼠進行免疫。 [0008]纖連蛋白外部結構域A (Fibronectin Extra Domain A, EDA)是一種DC活化因子，主要起著募集DC并激發其成熟的作用；EDA通過與Toll樣受體4相互作用產生共刺激因子，使DC遷移至淋巴結，輔助DC發揮較強的攝取加工抗原的作用，并誘導DC成熟，從而激活抗病毒以及抗腫瘤的T細胞應答(Mansilla C，Gorraiz M, Martinez M, CasaresN， Arribillaga L, Rudilla F， et al.1mmunization against hepatitis C viruswith a fusion protein containing the extra domain A from fibronectin and thehepatitis C virus NS3 protein.Journal of Hepatology.2009; 51:520-7.)? 由于DC細胞的成熟是效應T細胞啟動的必要環節，目前多種活化DC的分子成為疫苗研發的熱點。近幾年，相繼有將抗原與不同促DC成熟刺激物混合的免疫策略，并發現在這些刺激物的作用下可以激發更為顯著的免疫應答(Liu QH, Bohlen H，Titzer S，Christensen0, Diehl V, Hescheler J, et al.Expression and a role of functionally coupledP2Y receptors in human dendritic cells.FEBS Lett.1999;445:402-8.和 SchwarzK, Storni T, Manolova V, Didierlaurent A, Sirard JC, Rothlisberger P, et al.Role of Toll-like receptors in costimulating cytotoxic T cell responses.Eur JImmunol.2003;33:1465-70.和Resta R, Yamashita Y, Thompson LF.Ecto-enzyme andsignaling functions of lymphocyte CD73.1mmunol Rev.1998;161:95-109.X
[0009]HCV NS3蛋白編碼基因全長共1893個核苷酸。截短的NS3是編碼絲氨酸蛋白酶區域，該區域在多聚蛋白前體的加工和成熟方面起著非常重要的作用。針對NS3的CD4+T細胞免疫應答能夠有效刺激IFN- y的生成，增強對IFN- a治療的敏感性，與HCV感染的自限性和良好轉歸密切相關。有研究發現，14例HCV感染患者中的8例自限性患者均具有NS3特異性免疫應答，而65例發展為慢性丙型肝炎的患者中僅有5例具有NS3特異性免疫應答，提示抗NS3免疫應答與病毒的清除相關(Di印older HM, Zachoval R, HoffmannRM, Wierenga EA, Santantonio T, Jung MC, et al.Possible mechanism involvingT-1ymphocyte response to non—structural protein 3 in viral clearance in acutehepatitis C virus infection.Lancet.1995; 346:1006-7.)? 目前已證實，ANS3 上集中了多個 T 細胞表位(如 NS3 1073-1081，HCV NS3 1038-1047，NS3 1100-1107 等)，因此它也是HCV疫苗研發中備受重視的主要靶點抗原之一。
【發明內容】
[0010]本發明解決的問題在于提供一種HCV多表位肽與截短型NS3、DC活化分子EDA重組蛋白疫苗及其應用，該重組HCV蛋白疫苗可以誘導出特異性的體液免疫應答，以及特異性細胞免疫應答，包括特異性CTL發生，T細胞經過特異性抗原刺激以后可迅速產生IFN- y o
[0011]本發明是通過以下技術方案來實現:一種HCV多表位肽與截短型NS3、DC活化分子EDA重組蛋白疫苗，其特征在于:包括以下纖連蛋白外部結構域A，ANS3以及VAL-44:其核苷酸序列如SEQ.1D.N0.1所示。
[0012]所述的一種HCV多表位肽與截短型NS3、DC活化分子EDA重組蛋白疫苗在制備針對丙型肝炎病毒的預防性/治療性疫苗的應用。
[0013]所述的一種HCV多表位肽與截短型NS3、DC活化分子EDA重組蛋白疫苗的構建在制備抗丙型肝炎病毒的藥物中的應用。
[0014]所述的藥物為誘發針對丙型肝炎病毒的體液免疫應答的藥物。
[0015]所述的藥物為誘發針對丙型肝炎病毒的細胞免疫應答的藥物。
[0016]所述的藥物為刺激分泌IFN-Y的細胞增殖的藥物。
[0017]與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果:
本發明提供的一種HCV多表位肽與截短型NS3、DC活化分子EDA重組蛋白疫苗，采用前期經體內、外試驗篩選出的3個HCV多表位最優的排列組合方式，為了使所設計的疫苗可以使靶抗原被樹突狀細胞所遞呈，引發強烈的體液、細胞免疫應答，特在3個多表位上游引入EDA以及經截短的NS3。經體內試驗表明該蛋白疫苗具有強的免疫原性，表現出了良好的免疫效果包括:
可以誘發機體產生特異性體液免疫應答；
可以誘導出特異性的T細胞免疫應答；
經過 特異性抗原刺激以后可以迅速產生IFN-Y ；
該HCV多表位肽與截短型NS3、DC活化分子EDA重組蛋白疫苗疫苗可能是較理想的HCV預防/治療性候選疫苗。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1為pET32a載體的示意圖；
圖2為重組質粒pET32a-EDA-ANS3-VAL-44酶切鑒定的瓊脂糖凝膠電泳后的成像圖； 圖3為HCV EDA-ANS3-VAL-44蛋白原核表達的可溶性分析圖；
圖4為HCV EDA-A NS3-VAL-44蛋白的純化結果圖；
圖 5 為 Western blot 法鑒定 HCV EDA-A NS3-VAL-44 蛋白結果圖；
圖6 HCV疫苗免疫程序示意圖；
圖7為ELISA法檢測免疫小鼠血清特異性抗體效價結果；
圖8為各組免疫小鼠CTL活性檢測比較；
圖9為ELISP0T法檢測小鼠脾細胞分泌IFN-Y情況；
圖10為ELISP0T法檢測小鼠脾細胞分泌IFN-Y情況統計圖。
【具體實施方式】
[0019]下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。
[0020]在HCV的表位中篩選的3個表位串聯，并在其上游插入EDA以及截短的NS3，通過構建的原核表達載體對大腸桿菌BL21進行轉化、誘導，純化出HCV EDA- A NS3-VAL-44目的蛋白作為疫苗進行免疫，以達到針對HCV的免疫效果，從而達到預防/治療性丙型肝炎的目的，這些免疫效果包括:引發包括體液免疫應答，引發分泌IFN-Y細胞因子為主的細胞免疫應答及特異性的CTL反應。
[0021]1、鑒于上述目的，首先進行一種HCV多表位肽與截短型NS3、DC活化分子EDA重組蛋白疫苗的構建。
[0022]具體的基因為:
該目的基因由三部分組成，包括EDA，A NS3以及3個HCV多表位。3個多表位按照:NS5A( 1991-1999)-KK-Th表位-KK- NS4B(1793-1801)順序排列。為了使所構建的蛋白疫苗靶向遞呈至樹突狀細胞，特在上游插入EDA，所選擇截短的NS3是編碼絲氨酸蛋白酶的序列。
[0023]N0.1:HCV EDA-A NS3-VAL-44 核苷酸序列 AACATTGATCGCCCTAAAGGACTGGCATTCACTGATGTGGATGTCGATTCCATCAAAATTGCTTGGGAAAGC
CCACAGGGGCAAGTTTCCAGGTACAGGGTGACCTACTCGAGCCCTGAGGATGGAATCCGGGAGCTTTTCCCTGCACCTGATGGTGAAGACGACACTGCAGAGCTGCAGGGCCTCAGGCCGGGGTCTGAGTACACAGTCAGTGTGGTTGCCTTGCACGATGATATGGAGAGCCAGCCCCTGATTGGAATCCAGTCCACAGCGCCCATCACGGCTTACTCCCAACAGACGCGGGGCTTGCTTGGTTGTATCATCACCAGCCTCACAGGCCGGGACAAGAACCAAGTCGAGGGGGAGGTTCAAGTGGTTTCCACCGCAACACAATCTTTCCTGGCGACCTGCGTCAACGGCGTGTGTTGGACCGTCTATCATGGCGCTGGCTCAAAGACCTTAGCCGGCCCAAAAGGCCCAATTACCCAAATGTACACTAATGTAGATCAGGACCTCGTCGGCTGGCCGGCGCCCTCTGGGGCGCGTTCCTTGACACCATGCACTTGCGGCAGCTCGGACCTTTACTTGGTCACGAGATATGCCGATGTCATTCCGGTGCGCCGGCGGGGTGACAGTAGGGGGAGTCTACTCTCCCCCAGGCCTGTCTCCTACTTGAAGGGCTCTTCGGGTGGCCCACTGCTCTGCCCTTCGGGGCACGCTGCGGGTATCTTCCGGGCTGCTGTGTGCACCCGAGGGGTTGCGAAGGCGGTGGACTTCGTACCCGTTGAGTCTATGGAAACTACCATGCGGTCTCCGGTCTTCACAGACAACTCATCCCCCCCGGCCGTGCTGTCTGACTTCAAAGTCTGGCTCAAGAAAAAGTTTCCAGGCGGAGGGCAGATCGTGGGTGGCGTCTACCTGCTCCCCAGGAGAGGACCTCGGCTGAAAAAGAGCATGATGGCCTTCTCCGCCGCTCTCN0.2 =EDA的核苷酸序列
AACATTGATCGCCCTAAAGGACTGGCATTCACTGATGTGGATGTCGATTCCATCAAAATTGCTTGGGAAAGCCCACAGGGGCAAGTTTCCAGGTACAGGGTGACCTACTCGAGCCCTGAGGATGGAATCCGGGAGCTTTTCCCTGCACCTGATGGTGAAGACGACACTGCAGAGCTGCAGGGCCTCAGGCCGGGGTCTGAGTACACAGTCAGTGTGGTTGCCTTGCACGATGATATGGAGAGCCAGCCCCTGATTGGAATCCAGTCCACAN0.3: ANS3的核苷酸序列
GCGCCCATCACGGCTTACTCCCAACAGACGCGGGGCTTGCTTGGTTGTATCATCACCAGCCTCACAGGCCGGGACAAGAACCAAGTCGAGGGGGAGGTTCAAGTGGTTTCCACCGCAACACAATCTTTCCTGGCGACCTGCGTCAACGGCGTGTGTTGGACCGTCTATCATGGCGCTGGCTCAAAGACCTTAGCCGGCCCAAAAGGCCCAATTACCCAAATGTACACTAATGTAGATCAGGACCTCGTCGGCTGGCCGGCGCCCTCTGGGGCGCGTTCCTTGACACCATGCACTTGCGGCAGCTCGGACCTTTACTTGGTCACGAGATATGCCGATGTCATTCCGGTGCGCCGGCGGGGTGACAGTAGGGGGAGTCTACTCTCCCCCAGGCCTGTCTCCTACTTGAAGGGCTCTTCGGGTGGCCCACTGCTCTGCCCTTCGGGGCACGCTGCGGGTATCTTCCGGGCTGCTGTGTGCACCCGAGGGGTTGCGAAGGCGGTGGACTTCGTACCCGTTGAGTCTATGGAAACTACCATGCGGTCTCCGGTCTTCACAGACAACTCATCCCCCCCGGCCN0.4:3個多表位核苷酸序列
GTGCTGTCTGACTTCAAAGTCTGGCTCAAGAAAAAGTTTCCAGGCGGAGGGCAGATCGTGGGTGGCGTCTACCTGCTCCCCAGGAGAGGACCTCGGCTGAAAAAGAGCATGATGGCCTTCTCCGCCGCTCTC
將編碼纖連蛋白外部結構域A，截短的NS3以及所前期篩選的3個HCV表位的基因上下游分別插入EcoRI和Sal I兩個酶切位點，目的基因序列經化學合成后與原核載體pET-32a(+ )載體(見圖1)連接。重組pET-32a ( + )/HCV EDA-ANS3-VAL-44由南京金斯瑞生物科技有限公司構建并提供。
[0024]將含有目的基因的菌劃線接種于含Amp抗性的LB平板上，37°C培養。次日挑取單菌落于含Amp抗性LB液體培養基中培養，采用質粒小量提取試劑盒提取質粒DNA。提取的質粒用EcoRI和Sal I于37 °C水浴進行3h雙酶切。
[0025]酶切產物取10 Ul在1%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，凝膠成像系統觀察并保存結果。陽性克隆應該切出大約978 bp的條帶(見圖2)，而載體的大小為5900 bp。圖中廣2為pET32a-EDA- A NS3-VAL-44經EcoRI和Sal I雙酶切后的結果圖，3是pET32a空載體對照，M是DNA marker.篩選出的含978 bp的陽性重組質粒送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司，用T7引物進行DNA測序加以確認。
[0026]2、誘導表達目的蛋白。以熱休克法轉化大腸桿菌BL21感受態細胞:取IOiU陽性重組質粒加入100 U I感受態DH5a中輕柔混勻在冰上放置30min，快速移至42°C水浴，熱休克90s，勿搖動離心管，迅速冰浴2min。加入800 預溫至37°C的LB培養基37°C，160 rpm/min緩搖40min左右使細菌復蘇，并表達抗生素抗性基因。離心2，500gX5min，吸去700 U I上清，保留100 U I用于重懸沉淀。將細菌懸液分別涂于LB(Amp+)平板上，待液體完全吸收后，倒置平皿，于37°C培養12~16h，觀察菌落。
[0027]挑選4個陽性克隆分別接種于5mL含氨芐青霉素的LB培養液中，37°C振蕩培養18h,分別取50uL加到5mL`含氨芐青霉素的LB培養液中，37°C振蕩培養2~3h，0.5M IPTG誘導4h，取ImL誘導表達菌液以及未誘導的菌液離心，回收菌體沉淀。將誘導前后的樣本重懸到去離子水中，加入2 X SDS上樣緩沖液，100°C沸水浴5min，12，OOOrpm離心lOmin，取10 u I上清進行SDS-PAGE，電泳條件為150V恒壓。凝膠用考馬斯亮藍染色液染色2h，脫色液脫色f3h，觀察目的蛋白表達條帶以及表達產物的表達形式。
[0028]含pET-32a-EDA- A NS3-VAL-44質粒的重組菌經IPTG誘導后，SDS-PAGE分析在相對分子量約為55kD處有明顯的特異性蛋白表達條帶，其大小與預測的目的蛋白的大小相符。表達的目的蛋白大多以可溶形式存在于上清中(圖3)，圖3為HCV EDA-ANS3-VAL-44蛋白原核表達的可溶性分析圖。圖中I是未經IPTG誘導的蛋白表達;M是低分子量蛋白marker ；2是經IPTG誘導的全細菌裂解物，3是經IPTG誘導的裂解上清，4是經IPTG誘導的裂解沉淀。
[0029]3、采用活性條件進行親和層析法純化蛋白。經N1-NTA親和色譜柱上樣洗脫，對洗脫液進行SDS-PAGE分析的結果表明獲得了純化的HCV EDA-ANS3-VAL-44融合蛋白(圖4)。圖4為HCV EDA-ANS3-VAL-44蛋白的純化結果圖。其中M是低分子量蛋白marker，f 4均是純化出的蛋白。用BCA法測得蛋白濃度為1.55mg/ml。
[0030]SDS-PAGE分離HCV EDA- A NS3-VAL-44重組蛋白，電轉移至NC膜上。將膜浸在封閉液中(PBST溶解的5%脫脂奶粉)4°C過夜。用PBST洗膜三次，每次15min。1:1000稀釋的抗His標簽兔單克隆抗體作為一抗，共同孵育lh，PBST洗膜三次。將膜與1:10000稀釋的紅外標記的抗兔IgG共孵育lh，PBST洗膜三次，Odyssey紅外激光成像系統掃描，結果在相對分子質量約為55 kD處呈現特異性染色條帶，表明其為HCV EDA- A NS3-VAL-44蛋白(圖5)，其中M是低分子量蛋白marker，I是以BSA作為的對照，2是純化出的蛋白。
[0031] 4、以HHD-2小鼠作為免疫對象，將原核表達的HCV蛋白疫苗進行免疫以觀察其所能引發的免疫效果，具體的免疫方案為:
選用6-8周齡HHD-2小鼠18只，雌雄不拘，分為EDA-ANS3，EDA- ANS3-VAL-44以及PBS皮下給藥組，每組各6只。第一次用弗氏完全佐劑，之后用弗氏不完全佐劑。給藥時，純化的蛋白100 Ug /只，poly(1:C) 50 Ug /只以及PBS與弗氏佐劑1:1等體積充分乳化。融合蛋白或PBS與弗氏佐劑充分混勻后皮下注射小鼠，間隔2周加強免疫一次，共免疫3次。第2周、第4周、第6周通過尾靜脈取血，分離血清檢測抗體產生情況，第6周處死小鼠，檢測細胞免疫應答水平(圖6)。
[0032]5、免疫后的免疫效果的檢測
5.1體液免疫水平檢測通過ELISA法檢測免疫小鼠血清特異性抗體效價。將純化的HCV ￡04-八吧3-￥41-44蛋白稀釋至101^/1111，41:包被過夜；洗滌3次，加入3%BSA 100 U I/孔，37 °C 孵育 I ho PBS 洗滌 3 次后，加 A 1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800稀釋的免疫小鼠血清，37°C孵育I hrs ;洗滌后實驗孔加入1:20000稀釋的HRP-抗鼠二抗，37°C孵育I h ;洗滌后OPD顯色，室溫靜置15 min后加入2M H2SO4終止反應，測定各孔的A492值。以正常小鼠血清為陰性對照，試驗組/對照組≥2.1時判定為陽性。ELISA滴度表示為最后稀釋度的對數。
[0033]各組融合蛋白免疫小鼠的抗體效價均隨著免疫時間及次數的增加而逐漸升高。其中融合蛋白EDA-ANS3-VAL-44免疫組抗體效價在首次免疫后第四周達到最高，為1:12800，并在隨后的二周內持續保持這一水平，與PBS免疫組相比有統計學意義(P〈0.05)。此外，EDA-ANS3蛋白組最高抗體效價達到了 1:6400 (圖7)，與PBS對照組相比具有顯著差異。
[0034]5.2細胞免疫水平檢測
5.2.1 CTL殺傷性
用LDH (乳酸脫氫酶)細胞殺傷檢測試劑盒(具體操作流程按照說明書)檢測CTL活性。最后一次免疫后13天處死小鼠，取脾細胞，用HCV EDA-ANS3-
VAL-44蛋白(10 ii g/ml)刺激5天的T淋巴細胞作為效應細胞，用轉染了 HCVEDA- A NS3-VAL-44重組質粒的ClR.AAD細胞(是將HMYClR細胞轉染了人HLA-A2.1的a I和0 2結構域基因和鼠11-20(1的a 3結構域基因的重組細胞，在CTL殺傷實驗中，適合用作評價HLA-A2分子限制性表位的靶細胞)在CTL殺傷實驗中做靶細胞。設培養液背景孔、體積校正孔、靶細胞自發釋放孔、靶細胞最大釋放孔、效應細胞自然釋放孔、LDH陽性對照孔以及實驗孔(按效靶比分別為50.0:1，25.0:1, 12.5:1以及6.25:1比例將靶細胞、效應細胞加載至96孔細胞培養板中，每孔總體積為100 μl)。
[0035]試驗過程如下:按上述將細胞或培養液加入96孔板中，37V,5% CO2孵箱中培養4h，培養結束后，吹打每孔I min，吸取每孔上清50 yl，轉移到新的96孔板(每孔加入50yl檢測試劑)，室溫反應lh。測定每孔0D490 nm的吸光度(A)值，計算每個效/靶比時殺傷百分比。
【權利要求】
1.一種HCV多表位肽與截短型NS3、DC活化分子EDA重組蛋白疫苗，其特征在于:包括以下纖連蛋白外部結構域A，ANS3以及VAL-44:其核苷酸序列如SEQ.1D.N0.1所示。
2.根據權利要求1所述的一種HCV多表位肽與截短型NS3、DC活化分子EDA重組蛋白疫苗在制備針對丙型肝炎病毒的預防性/治療性疫苗的應用。
3.根據權利要求1所述的一種HCV多表位肽與截短型NS3、DC活化分子EDA重組蛋白疫苗，在制備抗丙型肝炎病毒的藥物中的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于:所述的藥物為誘發針對丙型肝炎病毒的體液免疫應答的藥物。
5.根據權利要求3所述的應用，其特征在于:所述的藥物為誘發針對丙型肝炎病毒的細胞免疫應答的藥物。
6.根據權利要求3所述的應用，其特征在于:所述的藥物為刺激分泌IFN-Y的細胞增殖的藥物 。
【文檔編號】A61P31/14GK103601809SQ201310324897
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年7月30日 優先權日:2013年7月30日
【發明者】黃小軍, 呂欣, 尹文, 雷迎峰, 張瑞國, 楊敬, 姚敏, 賈戰生, 蘭海云, 張建敏, 曲萍 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學