奧沙利鉑藥物組合物及應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及奧沙利鉑類結腸癌治療藥物和應用，由TOP2B抑制劑和奧沙利鉑組成。實驗證明抑制CCDC88A能夠提高結直腸癌細胞對奧沙利鉑的敏感性。同時，這種敏感性的增加與TOP2B的表達降低也有關，用TOP2B的抑制劑也能提高對奧沙利鉑結直腸癌細胞的敏感性，本發明的CCDC88A和TOP2B可以作為奧沙利鉑的增敏劑，以這兩個基因作為靶點設計藥物，聯合奧沙利鉑，可以提高奧沙利鉑的療效。
【專利說明】奧沙利鉑藥物組合物及應用
[【技術領域】]
[0001]本發明涉及奧沙利鉬類結腸癌治療藥物和應用，特別涉及CCDC88A和T0P2B抑制劑和奧沙利鉬的藥物組合物及應用。
[【背景技術】]
[0002]奧沙利鉬作為第三代鉬類藥物，廣泛用于結直腸癌輔助治療的一線方案。奧沙利鉬發揮細胞毒性作用的機制是在細胞內通過代謝產物與DNA交聯形成DNA復合物，從而終止腫瘤細胞的復制、導致細胞凋亡。研究表明只有40%患者從中獲益，但是仍然有一部分患者治療失敗。其主要的原因是對于奧沙利鉬化療藥物原始或獲得性的耐藥性。這種耐藥性的產生包含化療藥物的運輸、DNA修復、DNA損傷耐受和凋亡等多個因素的參與。如何提高奧沙利鉬為主的結直腸癌化療敏感性成為當前臨床研究和基礎研究的熱點問題。
[0003]CCDC88A (Gene ID: 55704)，屬激酶調節蛋白，它的 C 端含有 GEF (Guaninenucleotide Exchange Factor)結構域，能夠與G蛋白I型α亞基(Gia )結合,釋放G3 Y亞基，從而活化細胞內激酶，進而調控細胞內信號通路，在腫瘤細胞生長和轉移過程中起重要作用。有研究表明CCDC88A在進展期結直腸癌中的表達有明顯升高并且影響結直腸癌患者預后。目前發現(XDC88A主要通過調控EGFR和ΡΙ3Κ信號通路調控腫瘤細胞生長和轉移。CCDC88A在細胞內通過GEF結構域結合Gi a，同時其C端與EGFR結合，形成Gi a -GIV-EGFR復合物，EGFR發生磷酸化，進而導致下游PI3K，AKT和PLC Y磷酸化，促進細胞遷移；當(XDC88A的1685位氨基酸發生突變(F1685A)后，不能和G蛋白結合，EGFR磷酸化水平下降，但是SRC和ERK磷酸化水平升高，也可以促進細胞分裂和增殖。EGFR、PI3K和AKT的磷酸化水平除了與腫瘤細胞的轉移有關之外，還與腫瘤細胞對藥物的抗性有關，在鉬類耐藥的腫瘤細胞中均發現EGFR和PI3K磷酸化水平比非耐藥細胞要高。既然CCDC88A可以激活與化療耐藥相關的EGFR和PI3K通路，因此，有理由認為(XDC88A可以促進腫瘤細胞的耐藥，從而影響腫瘤的預后。
[0004]T0P2B (Gene ID: 55704)屬于T0P2家族成員，這個家族還有T0P2A。T0P2是機體內重要的核酶，具有調整DNA拓撲結構的作用，它參與了 DNA的復制、轉錄、翻譯及染色體的分離、損傷修復等過程。T0P2A在增殖細胞和腫瘤細胞等含量較高，其濃度與細胞的增殖狀態緊密相關，快速增殖細胞是靜止細胞表達的數倍，GcZG1其含量較低，在S期開始增加，G2/M期表達達到高峰。T0P2B的表達無細胞周期性差異，其濃度在細胞周期中保持相對恒定。因此推測T0P2A和T0P2B的功能，T0P2A可能負責在DNA復制后期解開兩個相互交聯的染色質單體以及重組細胞分裂后期DNA ;而T0P2B負責DNA復制、轉錄等過程。由于T0P2在細胞代謝中的重要作用，因此其成為腫瘤靶點被應用到惡性腫瘤的治療中。這些抗T0P2的靶向藥物按照其作用方式可以分為兩種:T0P2毒劑和Τ0Ρ2催化抑制劑。Τ0Ρ2毒劑的代表藥物有依托泊苷(Etoposide, VP16)和阿霉素(Adriamycin, ADM),其作用方式是通過提高可切割復合物的穩態濃度使T0P2從酶變成生理毒劑，形成T0P2-藥物-DNA復合物，使細胞基因組DNA斷裂，從而導致細胞變異或啟動一系列事件導致細胞死亡。這些藥物是目前臨床上常用抗癌藥物，是淋巴瘤、肺癌等惡性腫瘤的首選藥物。T0P2催化抑制劑的代表藥物有新生霉素、阿柔比星等，其作用方式通過抑制催化反應中的某一步驟或阻滯T0P2的某一特定功能，進而抑制T0P2的總體催化活性。
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【發明內容】
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[0005]為了增加奧沙利鉬對于結腸癌細胞的敏感性，提供一種以(XDC88A和T0P2B作為新的靶點的奧沙利鉬藥物組合物。
[0006]用MTT法檢測17種結直腸癌細胞系對奧沙利鉬敏感性，確定了奧沙利鉬對17株細胞的半致死濃度(IC50)和奧沙利鉬不敏感細胞株。通過篩選針對(XDC88A mRNA的4個靶點的siRNA，選擇干擾效率最高的序列設計shRNA，其堿基正向序列如SEQ ID NO:1所示，其堿基反向序列如SEQ ID:2所示。
[0007]然后構建慢病毒，感染DLDl細胞，RT-PCR和wetern blotting檢測干擾效率，選取干擾效率最高的shRNA慢病毒感染DLDl細胞，聯合奧沙利鉬，用MTT法檢測兩者聯用對DLDl細胞的生長抑制效果發現:(XDC88A表達降低后，導致T0P2B基因表達下調，使用T0P2B的抑制劑阿霉素可以增加結直腸癌細胞對奧沙利鉬的敏感性。
[0008]抑制CCDC88A的能夠提高結直腸癌細胞對奧沙利鉬的敏感性。同時，這種敏感性的增加與T0P2B的表達降低也有關，抑制T0P2B也能提高對奧沙利鉬結直腸癌細胞的敏感性。
[0009]為實現上述目的，發明一種奧沙利鉬藥物組合物，由(XDC88A和/或T0P2B的抑制劑聯用奧沙利鉬組成。通過Real-time PCR及Western blotting檢測腫瘤耐藥相關基因T0P2B mRNA和蛋白表達，發現其表達量在(XDC88A被干擾之后，明顯降低。用T0P2B抑制劑和奧沙利鉬處理結直腸癌細胞，兩者聯用時抑制率顯著提高。
[0010]進一步的，所述的T0P2B抑制劑優選為阿霉素或依托泊苷。
[0011]上述的藥物組合物中奧沙利鉬的濃度為3μΜ~10μΜ ；Τ0Ρ2Β抑制劑的濃度為3μΜ~24μΜ。優選為下述3種方案:
[0012]a.濃度為3μΜ的奧沙利鉬和濃度為6μΜ的Τ0Ρ2Β抑制劑。
[0013]b.濃度為3μΜ的奧沙利鉬和9μΜ的Τ0Ρ2Β抑制劑。
[0014]c.濃度為3μΜ的奧沙利鉬和濃度為24μΜ的Τ0Ρ2Β抑制劑。
[0015]所述奧沙利鉬藥物組合物能夠用于D2、HCT116、HUTU80、SW48、SW480、SW620、SW837、CAC0-2、C0115、CX-1、C0L0205、DLD1、GP2D、GP?、或 HCT15 等結直腸癌抑制藥物中，尤其能夠提高DLDl對于奧沙利鉬的敏感性。
[0016]本發明相對于現有技術而言，具有如下優點:
[0017]確定了抑制CCDC88A能夠提高結直腸癌細胞對奧沙利鉬的敏感性，這種敏感性的增加與Τ0Ρ2Β的表達降低有關，用Τ0Ρ2Β的抑制劑阿霉素聯合奧沙利鉬處理結直腸癌細胞，也能提高對結直腸癌細胞的增殖。
[0018]本發明的(XDC88A和Τ0Ρ2Β可以作為奧沙利鉬的增敏劑，以這兩個基因作為靶點設計藥物，聯合奧沙利鉬，可以提高奧沙利鉬的療效。[【專利附圖】
【附圖說明】][0019] 圖1顯示了 CCDC88A對4個siRNA干擾效率；
[0020]圖2顯示了(XDC88A對shRNA慢病毒干擾效果；
[0021]圖3顯示了(XDC88A干擾之后提高了 DLDl細胞對奧沙利鉬的敏感性；
[0022]圖4顯示了(XDC88A干擾導致T0P2B蛋白表達下降；
[0023]圖5顯示了 (XDC88A干擾導致T0P2B mRNA表達下降；
[0024]圖6顯示了 T0P2B抑制劑阿霉素提高DLDl細胞對奧沙利鉬敏感性。
圖中I表不:未作任何處理2表不:3 μ m奧沙利鉬3表不:6 μ m阿霉素4表不:3 μ m奧沙利鉬+6 μ m阿霉素5表不:9 μ m阿霉素6表不:3 μ m奧沙利鉬+9 μ m阿霉素7表不:24 μ m阿霉素8表示:3 μ m奧沙利鉬+24 μ m阿霉素。
[【具體實施方式】]
[0025]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0026]實施例1:結直腸癌細胞株培養
[0027]將CAC0-2、COl 15、CX-1、C0L0205、D2、DLD1、GP2D、GP5D、HCT15、HCTl 16、HUTU80、LS174T、LS180、SW48、SW480、SW620、SW837 等 17 株結直腸癌細胞株置于 37°C、5%C02 培養箱中，含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素和鏈霉素的高糖DMEM培養基中常規培養。
[0028]實施例2 =MTT法檢測17種結直腸癌細胞系對奧沙利鉬的敏感性
[0029]取對數生長期結直腸癌細胞系，分別接種于96孔板中，1000-5000個/孔，100微升培養基/孔。
[0030]第二天棄培養液，每組細胞加入用培養基稀釋的不同濃度(0、3、10、30μπι)的奧沙利鉬，每個濃度設3個復孔，并設單獨培養基對照孔。將96孔板置于37°C、5%C02培養箱再培養24小時-72小時。
[0031]每孔加入4 mg/ml的MTT試劑10 μ 1，繼續在培養箱中孵育4h。
[0032]小心吸取去上清液，每孔加入100 μ I DMSO,放于振蕩器上震蕩15min。
[0033]酶標儀在490nm波長下測吸光值(A值)。
[0034]根據OD值算出腫瘤細胞抑制率，計算公式為抑制率(IR)= (1-實驗組A值/對照組A值)X 100%。SPSS統計軟件計算各組結直腸癌細胞系奧沙利鉬IC5tl值。
[0035]實施例3: siRNA轉染
[0036]DLDl細胞鋪于24孔板，當細胞密度達到30%_50%時，將150-100pmolsiRNA與250ul無血清培養基混勻，5ul Lipofectamine 2000和另外250ul無血清培養基混勻，室溫放置5分鐘后，兩者混勻，靜置20分鐘，然后加入細胞培養板。
[0037]CCDC88A siRNA 序列
[0038]
【權利要求】
1.一種T0P2B和(XDC88A在奧沙利鉬敏感性制劑中的應用。
2.如權利要求1所述的T0P2B和CCDC88A在奧沙利鉬敏感性制劑中的應用，其特征在于(XDC88A表達降低后，導致T0P2B基因表達下調，使用T0P2B的抑制劑阿霉素可以增加結直腸癌細胞對奧沙利鉬的敏感性。
3.如權利要求1所述的T0P2B和CCDC88A在奧沙利鉬敏感性制劑中的應用，其特征在于抑制CCDC88A能夠提高結直腸癌細胞對奧沙利鉬的敏感性，同時，這種敏感性的增加與T0P2B的表達降低有關，用T0P2B也能提高直腸癌細胞對奧沙利鉬的敏感性。
4.如權利要求2所述的T0P2B和CCDC88A在奧沙利鉬敏感性制劑中的應用，其特征在于(XDC88A表達降低是通過(XDC88A的干擾序列來實現的，(XDC88A的干擾序列為一 shRNA分子，其堿基正向序列如SEQ ID NO:1所示，其堿基反向序列如SEQ ID: 2所示。
5.一種奧沙利鉬藥物組合物，其特征在于由CCDC88A和/或T0P2B的抑制劑聯用奧沙利鉬組成。
6.如權利要求5所述的奧沙利鉬藥物組合物，其特征在于所述的T0P2B抑制劑為阿霉素或依托泊苷。
7.如權利要求5所述的奧沙利鉬藥物組合物，其特征在于所述的藥物組合物中奧沙利鉬的濃度為3μΜ~10 μ Μ, Τ0Ρ2Β抑制劑的濃度為3μΜ~24μΜ。
8.權利要求5~7中任一所述奧沙利鉬藥物組合物在結直腸癌抑制藥物中的應用。
9.如權利要求8所述的奧沙利鉬藥物組合物在結直腸癌細胞抑制藥物中的應用，其特征在于所述的結直腸癌細胞為 D2、HCTl 16、HUTU80、SW48、SW480、SW620、SW837、CAC0-2、COl 15、CX-1、C0L0`205、DLD1、GP2D、GPOT、或 HCT15 中的一種或多種。
10.如權利要求9所述的奧沙利鉬藥物組合物在結直腸癌細胞抑制藥物中的應用，其特征在于所述的結直腸癌細胞為DLDl。
【文檔編號】A61K31/282GK103520723SQ201310332311
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年8月1日 優先權日:2013年8月1日
【發明者】李華光, 張亞杰 申請人:上海銳賽生物技術有限公司