突變的噬菌體裂解基因e、含有該裂解基因的裂解質粒載體和在制備菌影疫苗中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了突變的噬菌體裂解基因E、含有該裂解基因的裂解質粒載體和在制備菌影疫苗中的應用。本發明的一種突變噬菌體裂解基因E（Eprom）是通過將噬菌體phiX174的裂解基因E的啟動子區進行突變后獲得的，突變后的E基因使得培養菌的溫度從現有的28℃變成37℃，而且具有更高的裂解效率、更高的起始誘導濃度和規模化生產能力，發酵罐培養裂解效率高達99.99997%。將Eprom與pBV220連接后即得高效裂解質粒載體pBV-Eprom。將pBV-Eprom轉化到胸膜肺炎放線桿菌中，誘導Eprom基因表達，得到胸膜肺炎放線桿菌菌影。本發明的豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗具有良好的安全性和免疫保護效力，可以刺激機體產生高滴度的抗體，且能夠對不同血清型的胸膜肺炎放線桿菌強毒株的攻擊提供良好的交叉免疫保護。
【專利說明】突變的噬菌體裂解基因E、含有該裂解基因的裂解質粒載體和在制備菌影疫苗中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及噬菌體裂解基因E在制備疫苗中的應用，尤其涉及一種突變的噬菌體裂解基因E，本發明還涉及含有該基因的裂解載體以及該裂解載體在制備菌影疫苗，特別是豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗中的用途，屬于基因工程疫苗領域。
【背景技術】
[0002]細菌菌影(Bacterial ghost)是一種沒有細胞漿和核酸的空細菌體。將PhiX174噬菌體E裂解基因在細菌中表達，該基因編碼蛋白在細菌細胞膜和胞壁上可形成穿膜隧道，在滲透壓的作用下使菌體破裂，細菌胞內細胞漿和核酸成分通過此隧道被排出，形成一種空的細菌外殼，即為“細菌菌影”。細菌菌影是由內膜(cytoplasmic membrane),胞衆間隙(periplasmic space)和外膜(outer membrane)組成，因此細胞壁在很大程度上被完整保存下來。在有些菌株的外膜上還有一層S-layer，也成為細菌菌影的成分之一。細菌菌影本身可作為一種很好的疫苗，因為這種形式保留了和活菌一樣的細菌胞膜結構和相關抗原蛋白，而外膜含有天然的免疫細胞通過模式識別受體識別的高度保守結構PAMP (pathogen-associated molecular patterns),例如脂多糖,妝聚糖，CPG, OmpA,菌毛等，能有效地被DC和巨噬細胞所吞噬。目前，菌影通過靜脈、皮下、氣體等途徑免疫已經在小鼠、兔子、豬等動物模型中取得了良好的免疫保護效果。霍亂菌菌影(VCG)經皮下注射小鼠誘導血清產生高水平的抗霍亂特異性IgG抗體。同時顯示，針對VCG的抗體足以保護新生小鼠免遭霍亂弧菌的感染。另外，細菌菌影還可以用作一種極好的遞送系統，通過在細菌裂解之前對細菌進行外膜的人工改造，將外來抗原，核酸或藥物等其它成分錨定于胞膜的內、外側，或充于胞漿周質。這樣制備的重組菌影擁有完好的，天然的細菌外膜結構，能同時激發體液和細胞免疫應答。其菌毛等表面黏附結構，又使之能靶向黏附在特異性的組織，如胃腸道和呼吸道的黏膜表面，進而較易被機體吞噬細胞，如PP結(Peyer’ s Patches)的M細胞所識別捕獲，故而可有效遞送疫苗抗原至黏膜表面和誘發相關黏膜免疫應答。Eko等人將沙眼衣原體(C.trachomatis)抗原在霍亂菌的內膜表達,然后裂解制備的重組菌影(VCG)有效地激發了生殖道黏膜的Thl型免疫應答，現在正在著手進入臨床實驗。與傳統的原核系統表達蛋白相比，重組細菌菌影有幾大優勢:(I)重組蛋白被整合在一個具有高度免疫原性的環境中；(2)對蛋白的大小要求范圍寬泛，但蛋白的分子量最好在2000到200，OOODa之間；(3)重組蛋白被直接表達后整合到細菌的膜上，裂解后就能直接用于免疫動物，而不必要象以前制備免疫原時要先分離純化重組蛋白；(4)整合在細胞壁的重組蛋白是以天然的構象，所以保持了它原有的活性形式。而一般基因重組的蛋白通過原核系統大都以包涵體的形式表達，只能通過變性、復性的方法在一定程度上恢復蛋白活性。(5)菌影的制備相對簡單，可用發酵技術獲得，而不需進行復雜的純化工作；可以凍干的形式貯存于室溫。[0003]裂解基因E的表達可在λ pL/pR-cI857或在IacPO-1acIq啟動阻遏系統的轉錄控制下完成。一些含有不同抗性標記、復制起始區和基因E表達控制的特異性裂解質粒已經被構建出來。λ PR啟動子和溫敏阻遏物cI857在30°C以下能抑制基因E的表達，高于30°C會導致阻遏物CI857熱滅活而誘導E基因表達。為了制備菌影，細菌須在28°C條件下生長到對數生長期，然后升溫到42°C誘導其裂解。
[0004]E蛋白介導的裂解已經成功地應用于各種大腸桿菌菌株、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、肺炎克雷伯氏桿菌、支氣管敗血博德特氏桿菌、幽門螺旋桿菌、霍亂弧菌、流感嗜血桿菌、溶血巴氏桿菌、多殺巴氏桿菌、綠膿桿菌、惡臭假單胞菌等。范圍如此之大說明了只要E基因裂解盒被引入到適當的載體中，E蛋白介導的裂解可能會在每個革蘭氏陰性菌中發生。[0005]目前，國內外現有的制備細菌菌影的裂解質粒載體系統都是在上述28°C條件下培養增殖細菌，然后再升溫到42°C誘導E基因的表達制備細菌的菌影。但是，大多數細菌的最佳生長溫度都是37°C，28°C條件下培養使得很多細菌的生長速度大大下降，而且不利于天然表面抗原的形成，影響疫苗的免疫原性和保護效果。本發明將E基因的啟動區突變后不但使得初始培養溫度從28°C提高到37°C，克服了菌影制備速度慢和免疫原性差的缺陷，而且裂解效率也提高了 I-2個數量級。更為關鍵的是，基于突變后的E基因Eprom構建的裂解載體PBV-Eprom能夠利用發酵罐大量地制備胸膜肺炎放線桿菌的菌影，使規模化生產成為可能，而該方面并未見相關的研究報道。
【發明內容】
[0006]本發明首先所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種新的經過突變的噬菌體裂解基因E。
[0007]本發明的目的之二是提供一種含有上述突變噬菌體裂解基因的裂解載體。
[0008]本發明的目的之三是將上述裂解載體應用于制備菌影疫苗。
[0009]本發明的目的之四是提供一種制備豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗的方法以及由該方法獲得的豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗。
[0010]本發明上述目的是通過以下技術方案來實現的:
[0011]本發明利用基因突變技術，對PhiX174噬菌體裂解基因E以及上游的調控基因進行隨機突變，使啟動子區發生基因突變，突變后的Eprom基因能使E基因的CI857抑制子在更高的溫度抑制E基因的轉錄，從而使得培養溫度從現有的裂解質粒載體的28°C變成突變后的37°C，而且具有更高的裂解效率和規模化生產能力。
[0012]本發明的一種突變的噬菌體裂解基因E，命名為Ερι.οπι，其核苷酸序列為SEQ IDNO:1所示。
[0013]將本發明突變噬菌體裂解基因與原核表達載體相連接后，即得到裂解載體；作為一種優選的實施方案，例如，可以將序列SEQ ID Ν0:1所示的核苷酸序列與pBV220載體相連接，可得到一種高效裂解載體pBV-Eprom ;經檢測，pBV-Eprom的裂解效率可高達99.99997%。
[0014]因此，本發明提出了所述的突變的噬菌體裂解基因E在制備菌影疫苗中的應用。
[0015]進一步的，本發明還提出了一種制備豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗的方法，包括:
[0016](I)構建含有本發明所述的突變的噬菌體裂解基因E的裂解載體；
[0017](2)將該裂解載體轉化到胸膜肺炎放線桿菌中，得到含有裂解載體的胸膜肺炎放線桿菌轉化子；
[0018](3)將該胸膜肺炎放線桿菌轉化子進行增殖培養；
[0019](4)誘導突變噬菌體裂解基因E的表達，收集形成的菌影，得到豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗。
[0020]在本發明中，優選的，所述的裂解載體是通過將SEQ ID NO:1所示的序列克隆入PBV220載體中得到的。
[0021]在本發明中，優選的，步驟(3)中該胸膜肺炎放線桿菌轉化子在37°C進行增殖培養。
[0022]在本發明中，優選的，步驟(4)中在42°C溫度條件下誘導突變噬菌體裂解基因E的表達。
[0023]在本發明中，優選的，步驟(4)中當胸膜肺炎放線桿菌轉化子濃度為0D_等于0.8時開始升溫誘導突變噬菌體裂解基因E的表達。
[0024]再進一步的，本發明還提出了由以上所述的方法制備得到的豬傳染性胸膜肺炎菌
影疫苗。及
[0025]所述的豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗在制備防治豬傳染性胸膜肺炎藥物中的應用。
[0026]相較于現有技術，本發明的有益效果在于:
[0027]1、本發明通過試驗發現，突變后的Eprom基因可以使E基因的CI857抑制子在更高的溫度抑制E基因的轉錄，從而使得培養溫度從現有的裂解質粒載體的28°C變成突變后的37°C，而且具有更高的裂解效率(高達99.99997%，比突變前高I-2個數量級)、更高的起始誘導濃度(從突變前的OD6tltl0.4變為突變后的OD6tltl0.8)和規模化生產能力(可以利用發酵罐批量制備胸膜肺炎放線桿菌菌影)。
[0028]2、安全性試驗結果表明，本發明所制備的豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗具有良好的安全性，接種后的豬只無任何不良反應。
[0029]3、免疫保護試驗結果表明，接種本發明豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗后，可顯著刺激免疫豬產生高滴度的抗體，并能有效保護各免疫豬抵抗不同血清型胸膜肺炎放線桿菌強毒株的攻擊，說明本發明豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗具有良好的交叉免疫保護效果。而且相較于常規滅活苗和經28°C誘導表達的菌影疫苗，本發明的豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗具有更高的免疫原性和免疫保護效果。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0030]圖1為突變的噬菌體裂解基因E (Eprom)的構建示意圖；
[0031]圖2為發酵罐規模化制備胸膜肺炎放線桿菌CVCC265株菌影的裂解曲線；
[0032]圖3為胸膜肺炎放線桿菌菌影(ghost)的透射電鏡觀察結果。
【具體實施方式】
[0033]下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。[0034]試驗材料
[0035]菌株及質粒
[0036]大腸桿菌TGl感受態細胞購于弘博生物技術有限公司，噬菌體PhiX174購于Promega (北京)生物技術有限公司。質粒pBV220的構建過程可按照以下文獻構建:張智清，姚立紅，侯云德，含PrPl啟動子的原核高效表達載體的組建及其應用，病毒學報，1990，6（2），111-116。
[0037]胸膜肺炎放線桿菌血清7型CVCC265株購買自中國獸藥監察所。
[0038]實施例1突變的噬菌體裂解基因的克隆
[0039]根據GenBank中噬菌體PhiX174裂解基因E的編碼序列設計引物:
[0040]Lysis E-U:5/ -AGGGAATTCATGGTACGCTGGACTTTGTGG-3' (SEQ ID N0.2)
[0041]Lysis E-L:5/ -AGGGGATCCGAGCTCTCACTCCTTCCG-3' (SEQ ID N0.3)
[0042]上、下游引物5'端分別引入了限制性酶切位點EcoR I和BamH I，由哈爾濱博仕合成。以噬菌體PhiX174雙鏈DNA為模板擴增裂解基因E =PCR擴增反應體系為50 μ L，其中 MgSO4 2mM，上、下游引物各 ΙμΜ，dNTP 200 μ M, IOx Taq buffer, Taq?DNA 聚合酶 2U(TaKaRa)，模板 DNA 10ng。PCR 反應程序為:95°C預變性 5min，94°C 30s, 59°C 30s, 72°C308，30個循環，721: 5min。PCR擴增后的E基因經凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收，然后用DNA酶對E基因進行酶切，回收10-50bp的DNA片段。取I μ I回收后的DNA進行PCR擴增，PCR 擴增反應體系為 50 μ L:10x Taq buffer，Taq?DNA 聚合酶 2U (TaKaRa)，模板 DNA10ng。PCR 反應程序為:95°C預變性 5min，94°C 30s, 42。。30s, 72。。30s, 30 個循環，72°C5min。電泳結果為小于276bp的smear。
[0043]以特異性的引物Lysis E_U和Lysis E_L對上述PCR產物進行特異性擴增。PCR擴增反應體系為50 μ L，其中MgSO4 2mM，上、下游引物各I μ M，dNTP 200 μ M, IOx Taq buffer,Taq?DNA 聚合酶 2U( TaKaRa)，模板 I μ L。PCR 反應程序為:95°C 預變性 5min，94°C 30s, 59°C30s, 72°C 308，30個循環，721: 5min。獲得含有突變的噬菌體裂解基因E的擴增產物，用膠回收試劑盒回收。突變的噬菌體裂解基因E的擴增過程見附圖1。
[0044]實施例2裂解質粒載體pBV-Eprom的構建及培養條件的篩選
[0045]將實施例1所克隆的裂解基因E純化后用EcoR I/BamH I雙酶切，用T4 DNA連接酶(TaKaRa)與經EcoR I和BamH I雙酶切消化的pBV220載體相連接，16°C過夜連接并熱激轉化入大腸桿菌TGl感受態細胞，經菌落PCR鑒定為陽性的克隆進行增菌并利用堿裂解法小量提取質粒，得到裂解載體。
[0046]選取20個含裂解載體的大腸桿菌TGl的菌落，分別接種在5mL含50 μ g/mL氨芐青霉素的LB中，37°C過夜震蕩培養(220r/min)，然后轉接l_2mL于50mL含50 μ g/mL氨芐青霉素的LB中，37°C震蕩培養至0D_達0.4左右。此時將溫度迅速升高到42°C培養以誘導E基因表達，繼續培養4-5小時，肉眼觀察裂解效率。可以觀察到不同的試驗結果，有的試管在37°C過夜培養時即呈現裂解現象，菌液較稀薄，并可見少量細菌碎片，轉接后37°C培養也呈現裂解現象，0D_值無法達到0.4 ;有的試管37°C過夜培養裂解效果不明顯，但轉接后繼續37°C培養卻呈現明顯的裂解現象，也無法使0D_值達到0.4 ;只有I個試管得到了想要的結果，即37°C過夜培養和轉接后繼續37°C培養均未呈現出裂解現象，OD600達0.4時溫度升高到42°C并誘導4-5小時后卻呈現出明顯的裂解現象，菌液澄清透明并可見大量的菌體碎片。將37°C培養裂解的菌液和不裂解的菌液分別進行質粒提取和突變E基因的序列測定，分析比較不同培養條件下裂解質粒中突變E基因的變異情況，并獲得了在37°C條件下培養不裂解的質粒載體。對該質粒載體進行測序發現，裂解基因E的啟動子區發生了突變，突變后的E基因命名為Ερι.οπι，其核苷酸序列為SEQ ID NO:1所示，含有EpiOm的裂解載體命名為pBV-Eprom。
[0047]實施例3含裂解載體pBV-Eprom的重組胸膜肺炎放線桿菌的構建
[0048]1、構建含有SEQ ID NO:1所示的突變的噬菌體裂解基因E的裂解載體；
[0049](I)合成SEQ ID NO:1所示的突變的噬菌體裂解基因E的序列；
[0050](2)設計引物:
[0051]Lysis E-U:5/ -AGGGAATTCATGGTACGCTGGACTTTGTGG-3' (SEQ ID N0.2)
[0052]Lysis E-L:5/ -AGGGGATCCGAGCTCTCACTCCTTCCG-3' (SEQ ID N0.3)
[0053]以特異性的引物Lysis E-U和Lysis E-L對上述合成的突變的噬菌體裂解基因E的序列進行特異性擴增。PCR擴增反應體系為50 μ L，其中MgSO4 2mM,上、下游引物各I μ Μ，dNTP 200 μ M, IOx Taq buffer, Taq?DNA 聚合酶 2U (TaKaRa)，模板 I μ L。PCR 反應程序為:95°C預變性 5min，94°C 30s, 59°C 30s, 72°C 30s，30 個循環，72°C 5min。獲得突變的噬菌體裂解基因E的擴增產物，用膠回收試劑盒回收。
[0054](3)將純化后的突變的噬菌體裂解基因E的擴增產物用EcoR I/BamH I雙酶切，用T4DNA連接酶(TaKaRa)與經EcoR I和BamH I雙酶切消化的pBV220載體相連接，16°C過夜連接并熱激轉化入大腸桿菌TGl感受態細胞，經菌落PCR鑒定為陽性的克隆進行增菌并利用堿裂解法小量提取質粒，經測序鑒定無誤后，得到裂解載體pBV-Eprom。
[0055]對于pBV-Eprom的構建屬于本領域的常規操作，以上方法只是其中一種可以實現本發明的方法，本領域技術人員還可有多種選擇。例如，本領域的技術人員完全可以按照實施例I和實施例2的方法構建得到裂解載體pBV-Eprom。即使得到的載體序列與本發明的不同，也可以通過定點突變的方法得到與本案記載的Eprom序列完全相同的載體，而在此過程中不需要付出任何的創造性勞動。
[0056]2、將裂解質粒載體pBV-Eprom及突變前的pBV_E (裂解基因選擇未突變的E基因，其余構建過程與pBV-Eprom相同)分別電擊轉化到胸膜肺炎放線桿菌血清7型CVCC265株(氨節青霉素敏感株)中，電穿孔儀(Micro-pulser, Bio-Rad, USA)的電擊參數為:12.5kV/cm、200 Ω、25 μ f、5.2ms。
[0057]3、陽性轉化子通過菌落PCR進行鑒定。
[0058]4、選取含裂解質粒載體pBV-Eprom以及pBV_E的胸膜肺炎放線桿菌陽性轉化子菌落，分別接種在5mL含50 μ g/mL氨芐青霉素的TSB(含10 μ g/mL NAD)中，均放置于28°C和37°C過夜震蕩培養(220r/min)，然后轉接l_2mL于50mL含50 μ g/mL氨芐青霉素的TSB(含10 μ g/mL NAD)中，繼續在28°C或37°C下震蕩培養至OD6tltl值達到0.4左右。將培養物迅速調高到42°C培養以誘導Eprom和E基因的表達，繼續培養4-5小時，肉眼觀察裂解效果。試驗結果與大腸桿菌裂解結果類似，轉化pBV-E的胸膜肺炎放線桿菌CVCC265株可以在28°C培養和42°C誘導條件下裂解獲得胸膜肺炎放線桿菌CVCC265株的菌影；但在37°C培養時即出現裂解現象，無法使0D_值達到0.4，而轉化pBV-Eprom的胸膜肺炎放線桿菌CVCC265株在28°C和37°C培養時都不出現裂解現象，只有升溫到42°C才出現裂解現象。[0059]實施例4裂解質粒載體pBV-Eprom裂解效果與胸膜肺炎放線桿菌OD值的關系
[0060]選取實施例3中構建的含裂解質粒載體pBV-Eprom的胸膜肺炎放線桿菌CVCC265株陽性轉化子菌落，接種在5mL含50 μ g/mL氨芐青霉素的TSB(含10 μ g/mL NAD)中，37°C過夜震蕩培養(220r/min)，然后轉接l_2mL于50mL含50 μ g/mL氨芐青霉素的TSB(含10 μ g/mL NAD)中，37°C震蕩培養至0D6(I(I值達到0.4、0.6、0.8和1.0左右。取出100 μ L培養物備用，將剩余培養物迅速調高到42 °C培養以誘導Eprom的表達，繼續培養4_5小時。取誘導前后的培養物各100 μ I適當稀釋后涂TSA瓊脂平板(含10 μ g/mL NAD)進行活菌CFU檢測。觀察發現，在不同OD6tltl值的情況下，Eprom基因具有很高的裂解效果，即使在0D_值為0.8的情況下開始誘導，也表現出很高的裂解效果(99.99997%，比突變前高I-2個數量級)，菌液清澈透明并可見明顯的細胞碎片。結果表明，突變后的裂解質粒載體PBV-Eprom的裂解效率并不受細菌OD值的影響，即使在OD值高達0.8時開始誘導也仍然能夠進行有效的裂解，遠遠高于國外報道的細菌OD值須維持在0.4的水平，為大規模制備細菌菌影和工業化生產奠定了現實的基礎。
[0061]實施例5發酵罐大量制備胸膜肺炎放線桿菌菌影
[0062]將含有裂解質粒載體pBV-Eprom的胸膜肺炎放線桿菌CVCC265株接種到5mL含50 μ g/mL氨芐青霉素的TSB (含10 μ g/mL NAD)中，37 °C震蕩培養12小時左右(220r/min)，然后轉接l-2mL于IOOmL含50 μ g/mL氨芐青霉素的TSB (含10 μ g/mL NAD)中，37°C過夜震蕩培養。次日，將所有IOOmL培養物轉接到含IOOOOmLTSB培養基(含50 μ g/mL氨芐青霉素和10yg/mL NAD)的發酵罐中，37°C震蕩培養(220r/min)。發酵罐設置參數為ρΗ7.14-7.18 ；ρ02 40%, Airflow 1.35L/min。當 OD600 達 0.8 時迅速升溫到 42°C條件下繼續震蕩培養4-5小時。從開始誘導時每隔30分鐘取ImL樣品測0D_值，用于繪制裂解曲線。結果表明，升溫誘導后0D_值有短暫的升高，至I小時時達到頂峰1.015，之后迅速下降，并在誘導3小時時達到最低值0.315，之后一直維持這一水平。發酵罐規模化制備胸膜肺炎放線桿菌CVCC265株菌影的裂解曲線見附圖2。收獲的胸膜肺炎放線桿菌菌影。另外，取誘導前后的培養物各100 μ I適當稀釋后涂TSA瓊脂平板(含10 μ g/mL NAD)進行活菌CFU檢測。裂解效率檢測結果顯示，培養物從誘導前的5xl08CFU/ml下降到誘導后的2.6xl03CFU/ml，裂解效率高達99.99997%。結果表明，突變后的裂解質粒載體pBV-Eprom可以利用發酵罐大規模的制備胸膜肺炎放線桿菌的菌影，完全滿足實現工業化生產的要求。
[0063]實施例6豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗的制備
[0064]將實施例5中收獲的胸膜肺炎放線桿菌CVCC265株菌影用PBS洗滌3次，凍干保存，并對凍干后的菌影進行活菌CFU檢測。沒有活菌殘留的胸膜肺炎放線桿菌菌影可以直接用作豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗。
[0065]將本實施例中制備的胸膜肺炎放線桿菌CVCC265株菌影用PBS適量稀釋后，以
2.5%的戊二醛固定菌影，置4°C條件下固定2小時，PBS洗滌3次，離心后經四氧化鋨再固定、乙醇逐級脫水、包埋劑包埋等步驟處理后進行透射電鏡觀察。電鏡觀察結果見附圖3。
[0066]試驗例I豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗的安全性試驗
[0067]1.豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗對仔豬的安全性試驗
[0068]選取15頭4-6周齡的胸膜肺炎放線桿菌血清陰性的健康仔豬，隨即分為3組，每組5頭。3個實驗組分別肌肉注射ImL不同濃度的實施例6制備的胸膜肺炎放線桿菌CVCC265株菌影疫苗，分別為5xl0lclCFU/mL、5xl09CFU/mL和5xl08CFU/mL。接種后每天觀察試驗豬的食欲、精神狀態、體溫等；接種后14天剖殺所有試驗豬，取心、肝、脾、肺、腎等各臟器進行病理組織學觀察。試驗結果見表I。
[0069]表I豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗對仔豬的安全性試驗
[0070]
【權利要求】
1.一種突變的噬菌體裂解基因E，命名為EpiOm,其特征在于:所述的突變的噬菌體裂解基因E的核苷酸序列為SEQ ID NO:1所示。
2.一種裂解載體，其特征在于:含有權利要求1所述的突變的噬菌體裂解基因Ε，優選的，所述的裂解載體是通過將SEQ ID Ν0:1所示的核苷酸序列與pBV220載體相連接得到的。
3.權利要求1所述的突變的噬菌體裂解基因E在制備菌影疫苗中的應用。
4.一種制備豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗的方法，包括: (1)構建含有權利要求1所述的突變的噬菌體裂解基因E的裂解載體； (2)將該裂解載體轉化到胸膜肺炎放線桿菌中，得到含有裂解載體的胸膜肺炎放線桿菌轉化子； (3)將該胸膜肺炎放線桿菌轉化子進行增殖培養； (4)誘導突變噬菌體裂解基因E的表達，收集形成的菌影，得到豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗。
5.按照權利要求4所述的方法，其特征在于:所述的裂解載體是通過將SEQID Ν0:1所示的序列克隆入PBV220載體中得到的。
6.按照權利要求4所述的方法，其特征在于:步驟(3)中該胸膜肺炎放線桿菌轉化子在37 °C進行增殖培養。
7.按照權利要求4所述的方法，其特征在于:步驟(4)中在42°C溫度條件下誘導突變噬菌體裂解基因E的表達。
8.按照權利要求4所述的方法，其特征在于:步驟(4)中當胸膜肺炎放線桿菌轉化子濃度為OD6tltl等于0.8時開始升溫誘導突變噬菌體裂解基因E的表達。
9.由權利要求4-8任何一項所述的方法制備得到的豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗。
10.權利要求9所述的豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗在制備防治豬傳染性胸膜肺炎藥物中的應用。
【文檔編號】A61P31/04GK103451195SQ201310409238
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月10日 優先權日:2013年9月10日
【發明者】王春來, 李剛, 謝芳, 張艷禾 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所