一種糞腸球菌噬菌體裂解酶及其編碼基因與應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種糞腸球菌噬菌體裂解酶及其編碼基因與應用。本發明所提供的糞腸球菌噬菌體裂解酶是如下a）或b）的蛋白質：a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；b）將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有具有裂解糞腸球菌功能的由序列1衍生的蛋白質。實驗證明，該裂解酶蛋白能夠裂解多種糞腸球菌，可與敏感菌特異性緊密結合。另外，動物實驗表明該裂解酶對于糞腸球菌所導致的感染具有較好的治療效果，在感染后及時有效的給藥對于降低小鼠死亡率有一定意義。本發明為耐藥糞腸球菌的抗生素替代療法打下了基礎。
【專利說明】—種糞腸球菌噬菌體裂解酶及其編碼基因與應用【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，涉及一種糞腸球菌噬菌體裂解酶及其編碼基因與應用。
【背景技術】
[0002]糞腸球菌又叫糞鏈球菌，為革蘭氏陽性菌。根據蘭氏(Lancefield)血清學分類，可將鏈球菌分成許多個群，而糞腸球菌屬于其中的D群。D群鏈球菌又分為腸球菌和非腸球菌，其中腸球菌包括糞腸球菌(S.faecalis)、屎腸球菌(S.faecium)和堅忍腸球菌(S.durans)。近年來,通過DNA-DNA雜交分析發現腸球菌與鏈球菌屬間的同源性較低,故將腸球菌分出，另立為腸球菌屬。與人類感染疾病有關的腸球菌為糞腸球菌(E.faecalis)和屎腸球菌(E.faecium),其中糞腸球菌占90_95%。糞腸球菌形態呈圓形或橢圓形,可順鏈的方向延長，直徑為0.5-1.0um,大多數呈雙或呈短鏈狀排列,一般不運動。在營養豐富的培養基上，其菌落大而光滑，直徑其營養要求低,在普通營養瓊脂培養基上也可生長。糞腸球菌對環境有極強的抵抗能力，能在10°C或45°C的PH值為9.6或NaCl濃度達6.5%的肉湯培養基中生長，可在65°C環境下存活30min。
[0003]糞腸球菌是人或動物腸道、口腔和生殖道的正常菌群，正常情況下，共生的糞腸球菌對宿主沒有致病性。當其異位寄生時可引起敗血癥、尿路感染、化膿性腹部感染和心內膜炎等疾病，尤其在獲得了毒力因子或較高水平的抗生素抗性之后，可導致嚴重的細菌感染性疾病，是僅次于葡萄球菌的院內感染革蘭氏陽性球菌。
[0004]20世紀70年代，腸球菌主要表現為氨基糖苷類抗生素耐藥，隨著抗生素的不斷更新換代，首例耐萬古霉素腸球菌(VRE)在1986年被發現，90年代以來，抗菌藥物應用的普遍化、頭孢菌素類和氟喹諾酮類藥物的過度使用以及介入性治療等因素，導致耐藥腸球菌所致感染病例不斷增加。近年來，伴隨著院內感染率的上升，糞腸球菌的耐藥范圍愈加擴大。萬古霉素曾被認為是對付耐藥菌的最后一道防線，但隨著耐萬古霉素糞腸球菌的頻繁出現及該種抗性在菌株間的迅速傳播，對人類的健康已經造成嚴重威脅，也向臨床治療耐藥糞腸球菌提出了極大的挑戰。
[0005]隨著抗生素的濫用現象日益嚴重，細菌的耐藥性問題日益加劇，新抗生素的研發速度遠遠趕不上耐藥菌的產生速度，尋找新的抗菌制劑刻不容緩。而噬菌體及其裂解酶因其高效的殺菌能力及高度的宿主專一性而成為新一代抗菌制劑的候選之一，對于噬菌體及其裂解酶的研究在近些年被許多研究者提上日程。
[0006]噬菌體是一類以微生物(包括細菌、真菌、放線菌或螺旋體等)為宿主的病毒，沒有細胞結構，僅由衣殼蛋白和其內部的遺傳物質組成，必須依賴宿主進行復制和增殖。噬菌體是細菌的天然殺手，廣泛存在于自然界中，是自然界中數量最大的生物類群，有人估計自然界中存在IO3tl-1O32株、上億種不同型別的噬菌體。
[0007]相對于傳統的抗·生素治療細菌感染，噬菌體治療具有其獨特的優勢:能自我擴增，消滅病原菌之后自我死亡；特異性強，只針對特定的病原菌，對人體、動植物和環境沒有任何毒副作用等。
[0008]除了活噬菌體制劑，來源于噬菌體的裂解酶也是防治細菌性疾病的另一種手段。噬菌體裂解酶在噬菌體裂解細菌的過程中水解細菌細胞壁肽聚糖，從而破壞細胞壁釋放子代噬菌體，作為潛在的新型殺菌劑，它具有抗生素所無法比擬的優勢。噬菌體裂解酶的殺菌機制與抗生素完全不同，細菌的細胞壁肽聚糖結構在細菌的進化過程中十分保守，因此裂解酶導致細菌耐藥性的可能性遠小于抗生素。
【發明內容】
[0009]本發明的目的是提供一種糞腸球菌噬菌體裂解酶及其編碼基因與應用。
[0010]本發明所提供的糞腸球菌噬菌體裂解酶，名稱為Lysin-EFl，來源于糞腸球菌噬菌體(Enterococcus faecalis bacteriophage) IME-EF1,具體可為如下(a)或(b):
[0011](a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0012](b)將序列I的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有具有裂解糞腸球菌功能的由序列I衍生的蛋白質。
[0013]上述(b)中的蛋白質可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述(b)中的蛋白質的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變。
[0014]其中，序列表中序列I由237個氨基酸殘基組成。
[0015]編碼所述Lysin-EFl蛋白的核酸分子也屬于本發明的保護范圍。
[0016]所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA ;所述核酸分子也可以是 RNA，如 mRNA、hnRNA 或 tRNA 等。
[0017]在本發明的一個實施例中，所述核酸分子是編碼所述Lysin-EFl蛋白的基因(命名為Lysin-EFl基因)；所述Lysin-EFl基因具體可為如下I)至4)中任一所述的DNA分子:
[0018]I)編碼序列為序列表中序列2所示的DNA分子；
[0019]2)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0020]3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA分子雜交且編碼所述Lysin-EFl蛋白的DNA分子；
[0021]4)與I)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼所述Lysin-EFl蛋白的DNA分子。
[0022]上述嚴格條件可為用6XSSC，0.5%SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2XSSC，
0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。
[0023]其中，序列2由714個核苷酸組成，整個序列2為編碼序列(⑶S)，編碼序列表中序列I所示的Lysin-EFl蛋白。`
[0024]含有所述核酸分子的重組載體、表達盒或重組菌也屬于本發明的保護范圍。
[0025]所述重組載體可為重組表達載體，也可為重組克隆載體。
[0026]在本發明的實施例中，所述重組表達載體中啟動所述Lysin-EFl基因轉錄的啟動子具體為cspA啟動子。
[0027]更為具體的，所述重組表達載體為在pCold I載體的多克隆位點(如Xba I和BamHI)之間插入所述Lysin-EFl基因后得到的重組質粒(命名為pCold 1-Lysin-EFl)。
[0028]所述表達盒由能夠啟動所述Lysin-EFl基因表達的啟動子，所述Lysin-EFl基因，以及轉錄終止序列組成。
[0029]所述Lysin-EFl蛋白，或所述核酸分子，或所述重組表達載體、表達盒或重組菌，在如下al)_a4)任一中的應用也屬于本發明的保護范圍:
[0030]al)制備裂解糞腸球菌的產品；
[0031]a2)制備裂解屎腸球菌的產品；
[0032]a3)制備用于治療由糞腸球菌感染引起的疾病的產品；
[0033]a4)制備用于治療由尿腸球囷感染引起的疾病的廣品。
[0034]本發明的另一個目的是提供一種活性成分為所述Lysin-EFl蛋白的如下任一產品:
[0035]bl)裂解糞腸球 菌的產品；
[0036]b2)裂解屎腸球菌的產品；
[0037]b3)用于治療由糞腸球菌感染引起的疾病的產品；
[0038]b4)用于治療由屎腸球菌感染引起的疾病的產品。
[0039]在所述應用，或所述產品中，所有的所述糞腸球菌均可為如下4種中的至少一種:幾腸球菌(Enterococcus faecalis) 002、幾腸球菌(Enterococcus faecalis) 255、幾腸球菌(Enterococcus faecalis) 281 和幾腸球菌(Enterococcus faecalis) 284。
[0040]在所述應用，或所述產品中，所有的所述屎腸球菌均可為屎腸球菌(Enterococcusfaecium) 010。
[0041]以上所有的所述產品均可為藥物。
[0042]在本發明的一個實施例中，所述Lysin-EFl蛋白具體是按照如下方法制備得到的:將所述Lysin-EFl蛋白編碼基因(序列2)插入到pCold I載體的多克隆位點Xba I和BamHI之間后表達得到所述Lysin-EFl蛋白。
[0043]本發明分離出一株糞腸球菌噬菌體ME-EF1，并從中克隆得到了裂解酶蛋白Lysin-EFl的編碼基因。實驗證明，該裂解酶蛋白Lysin-EFl能夠裂解多種糞腸球菌，可與敏感菌特異性緊密結合。另外，動物實驗表明該裂解酶蛋白Lysin-EFl對于糞腸球菌所導致的感染具有較好的治療效果，在感染后及時有效的給藥對于降低小鼠死亡率有一定意義。本發明為耐藥糞腸球菌的抗生素替代療法打下了基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0044]圖1為以幾腸球菌(Enterococcus faecalis)002為指不菌分離幾腸球菌卩遼菌體。其中，A為以糞腸球菌002從醫院污水中分離出的噬菌體，1:噬菌體原液(箭頭所示處為噬菌斑)，2:PBS緩沖液；B為糞腸球菌噬菌體原液IO7倍稀釋后噬菌斑實驗結果(圖中黑色點狀區域為噬菌斑)。
[0045]圖2為限制性內切酶Nhe I消化糞腸球菌噬菌體ME-EFl基因組結果。其中，M:BMDlKb Marker ；1:酶切后基因組；2:未處理基因組。
[0046]圖3為糞腸球菌噬菌體ME-EFl的一步生長曲線。
[0047]圖4為電子顯微鏡觀察糞腸球菌噬菌體ME-EFl形態。其中，A放大倍數:X 30.0k ；B 放大倍數:X 100k。
[0048]圖5為連接產物轉化后的單克隆菌落PCR產物鑒定結果。其中，M、M’:BMD2000bpMarker ;1_8:連接產物轉化后的單克隆菌落PCR產物(擴增出目的條帶的1、3、4、5、8為陽性克隆)。
[0049]圖6為Lysin-EFl蛋白的SDS-PAGE鑒定結果。其中，A為全菌液，1:陰性對照(空表達載體);2:未加 IPTG誘導；3:1PTG誘導后全菌液；M:Takara Blue plus protein Marker。B為超聲后沉淀或上清，1: 超聲后上清；2:超聲后沉淀；3:超聲前上清；4:未加IPTG誘導菌液超聲后上清；5:未加IPTG誘導菌液超聲后沉淀；6:未加IPTG誘導菌液超聲后上清；M和 Μ’:Takara Blue plus protein Marker。圖中，箭頭所不處為 Lysin-EFl 蛋白。
[0050]圖7為點滴法測定Lysin-EFl蛋白的裂解酶活性，供試菌為糞腸球菌002。圖中箭頭所不似直為嗤囷斑。
[0051]圖8為濁度法測定Lysin-EFl蛋白的裂解酶活性及裂解譜。
[0052]圖9為各供試菌與Lysin-EFl蛋白混合并離心，ELISA檢測上清中未與細菌結合的Lysin-EFl蛋白。其中，I為糞腸球菌002 ；2為屎腸球菌064 ；3為屎腸球菌065 ；4為屎腸球菌081 ；5為純化后的Lysin-EFl蛋白溶液(內參)。
[0053]圖10為各供試菌離心后上清的Western blot檢測結果。其中，1:純化后的Lysin-EFl蛋白溶液(內參)；2:糞腸球菌002離心后上清；3:糞腸球菌281離心后上清；4:金黃色葡萄球001菌離心后上清；5:金黃色葡萄球037離心后上清。圖中，箭頭所示位置為Lysin-EFl 蛋白。
[0054]圖11為糞腸球菌噬菌體ME-EFl及Lysin-EFl蛋白治療效果對比及時間依賴性分析結果，具體為小鼠尾靜脈血液細菌平板計數結果(n = 6 ；p ^ 0.05)。
【具體實施方式】
[0055]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0056]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0057]1、菌株及質粒
[0058]幾腸球菌(Enterococcusfaecalis) 002、幾腸球菌(Enterococcus faecalis)255、幾腸球菌(Enterococcus faecalis) 281 和幾腸球菌(Enterococcus faecalis) 284:見文獻“張文慧，安小平，范航等.一株糞腸球菌噬菌體的分離及其生物學特性研究.生物技術通訊，24(4): 484-487”。
[0059]屎腸球菌(Enterococcusfaecium) 010、屎腸球菌(Enterococcus faecium) 064、屎腸球菌(Enterococcus faecium) 065、屎腸球菌(Enterococcus faecium) 081 和屎腸球菌(Enterococcus faecium)106:見文獻“張文慧，安小平，范航等.一株糞腸球菌曬菌體的分離及其生物學特性研究.生物技術通訊，24(4): 484-487”。
[0060]金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus) 001、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus) 037、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus) 069 和金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus) 091:見文獻“張文慧，安小平，范航等.一株糞腸球菌噬菌體的分離及其生物學特性研究.生物技術通訊，24(4): 484-487”。
[0061]大腸桿菌感受態細胞DH5 α和Μ15:均購自北京博邁德生物技術有限公司。[0062]表達載體pCold 1:購自Takara公司，產品目錄號:#3360_3364。
[0063]pEASY-Blunt simple載體:購自全式金公司，產品目錄號:CB111。
[0064]2、培養基和試劑
[0065]BHI培養基:BHI (Brain Heart Infusion，購自美國BD醫療器械有限公司)37g，加水800ml，定容至1L。制作半固體培養基時加入0.75% (0.75g/100mL)瓊脂粉；制作固體平板時加入1.5% (1.5g/100mL)瓊脂粉。121 °C高壓滅菌20min。
[0066]SM 緩沖液:氯化鈉 5.8g，硫酸鎂 2.0g, lmol/L Tris_HC150ml，2% (2g/100ml)明膠5ml，ρΗ7.5，加水定容至IL0
[0067]酚:氯仿:異戊醇液(體積比25:24:1):購自北京索萊寶科技有限公司。
[0068]PEG6000 (聚乙二醇 6000):購自美國 AMRESC0 公司。蛋白酶 K、RNase, Dnase:購自Fermentas公司。所用限制性內切酶均購自NEB公司。DNA Marker和Protein Marker均購自北京博邁德生物技術有限公司。PCR產物純化回收試劑盒購自QIAGEN公司。質粒小提試劑盒購自北京博邁德生物技術有限公司。生理鹽水(氯化鈉注射液)購自石家莊四藥有限公司。
[0069]實施例1、糞腸球菌噬菌體ME-EFl的分離和鑒定
[0070]一、糞腸球菌曬菌體的分離
[0071]利用糞腸球菌(En terococcus faecalis)002作為指示菌,從醫院污水中分離卩遼菌體，具體步驟如下:
[0072](I)污水預處理:從中國人民解放軍307醫院污水處理站取來未經任何消毒處理的污水，1000Orpm離心IOmin,收集上清,用0.45um微孔濾膜過濾處理后，收集濾液；
[0073](2)將幾腸球菌(Enterococcus faecalis) 002甘油菌于固體BHI培養基上劃線，37 °C過夜培養；
[0074](3)挑取單克隆接種于BHI培養基，于搖床內220rpm，37°C培養至對數生長期，加Λ 100 μ I污水濾液后于37°C震蕩過夜培養，而后于1000Orpm離心lOmin，收集上清，并用
0.45 μ m濾器過濾處理，所得濾液即為噬菌體原液。
[0075](4)點滴法驗證:將500 μ I對數生長期的糞腸球菌(Enterococcus faecalis)002菌液加入55°C的5ml BHI半固體培養基中，適當吹吸混勻后倒入下層BHI培養基平板上，靜置于水平臺面lOmin，待上層半固體培養基完全凝固后分別在平板的兩個區域內點滴
1.5 μ I的噬菌體原液和1.5 μ I的PBS緩沖液，倒置于37°C培養，IOh后觀察結果。
[0076]結果如圖1中A所示,將鋪有糞腸球菌(Enterococcus faecalis)002指示菌的雙層平板劃分為兩個區域，其中區域I中點滴1.5 μ I噬菌體原液，區域2點滴1.5 μ I PBS緩沖液，可見滴有噬菌體原液的區域I出現透亮的圓形噬菌斑，即所分離出的噬菌體原液對指示菌有裂解能力。
[0077]二、噬菌體效價的測定
[0078]噬菌體效價，又稱噬菌體的滴度，為每毫升樣品中所含有的噬菌體個數，可通過雙層平板法測定。具體測定方法如下:
[0079](I)將噬菌體原液用BHI培養基倍比稀釋IO2-1O7倍，分別取100 μ I與500 μ I對數生長期的糞腸球菌(Enterococcus faecalis) 002指示菌混合,室溫靜置15min ；
[0080](2)分別將上述混合懸液加入5ml55°C BHI半固體培養基中，適當吹吸混勻后倒入下層BHI培養基平板上，靜置于水平臺面lOmin，待上層半固體凝固后倒置放入37°C溫箱培養 IOh ；
[0081](3)觀察噬菌斑并按照不同稀釋倍數平板上的噬菌斑個數來計算噬菌體的滴度。
[0082]結果顯不，雙層瓊脂平板培養3h開始出現嗤囷斑，5h后得到如圖1中A所不結果，噬菌斑透亮且邊緣清晰，直徑1.5mm左右，IO7倍稀釋的平板上長出85個噬菌斑，可計算得到噬菌體效價約為5X 109pfu/ml。
[0083]三、噬菌體的純化與濃縮
[0084]1、噬菌體的純化
[0085](I)用高壓滅菌后的移液器吸頭挑取單個噬菌斑，接種到對數生長期的糞腸球菌(Enterococcus faecalis) 002菌液中，37°C震蕩培養至菌液被裂解至澄清，1000Orpm離心IOmin后收集上清，并用0.45 μ m濾器過濾收集濾液；
[0086](2)將濾液梯度稀釋,與對數生長期的糞腸球菌(Enterococcus faecalis) 002混合，鋪雙層平板，在適當的梯度獲得噬菌斑；
[0087](3)重復上面兩個步驟3次，將最后一次獲得的單個噬菌斑與對數生長期的糞腸球菌(Enterococcus faecalis) 002混合震蕩培養至菌液澄清，1000Orpm離心IOmin后過濾，將濾液儲存于4°C。
[0088]將步驟(3)最終得到的其中一種純化后噬菌體命名為糞腸球菌噬菌體ME-EF1。
[0089]2、卩遼菌體的大量培養
[0090](I)將幾腸球菌(Enterococcus faecalis)002 接種于 BHI 培養基，于 37°C 200rpm培養過夜；`
[0091](2)分別取50 μ I過夜培養的幾腸球菌(Enterococcus faecalis) 002加入3管5ml新鮮的BHI培養基中，分別標示1、2、3，于37°C震蕩培養至0D600達到0.4 ；
[0092](3)向管I中加入100 μ I步驟I得到的糞腸球菌噬菌體ME-EFl濾液，繼續于37°C培養至菌液完全裂解；將管2中的菌液加入500ml新鮮的BHI培養基中，37°C培養至對數期；管3為管I的對照組，加入100 μ I BHI培養基，并于37°C震蕩培養，用于判斷管I內菌液被裂解的程度；
[0093](4)將管I內懸液于1000Orpm離心lOmin，收集上清，加入已培養至對數期的500ml糞腸球菌(Enterococcus faecalis) 002菌液中，37°C震蕩培養過夜，使細菌完全裂解。
[0094]3、噬菌體的濃縮
[0095]采用PEG沉淀的方法進行噬菌體的濃縮，具體步驟如下:
[0096](I)向步驟2得到的500ml糞腸球菌噬菌體ME-EFl裂解培養物中加入29.2g固體NaCl至終濃度lmol/L，于室溫用磁力攪拌器攪拌至其完全溶解后，靜置于冰水浴Ih ；
[0097](2)于4°C, 1000Orpm離心IOmin,收集上清,并測定上清體積；
[0098](3)根據上清體積加入適量固體PEG8000至終濃度為10% (m/v,如500ml上清加入50g PEG8000)，室溫下攪拌器攪拌至其完全溶解；
[0099](4)將上述溶液分裝于離心管中，并配平，靜置于冰水浴中至少lh，以使噬菌體顆粒充分沉淀；
[0100](5)于4°C，1000Orpm離心lOmin，去上清，將離心管傾斜倒置5min，以使管內剩余的液體充分流干，也可用移液器吸去殘余液體；
[0101](6)用移液器吸取適量SM緩沖液重懸噬菌體沉淀；
[0102](7)向懸液中加入等體積的氯仿，并溫和震蕩30s以充分混勻，3000rpm離心15min，分離有機相與親水相，從而去除含有PEG和細胞碎片的有機相，回收含糞腸球菌噬菌體ME-EFl顆粒的親水相。
[0103]四、糞腸球菌噬菌體ME-EFl的基因組的提取及鑒定
[0104]1、提取嗤囷體基因組
[0105]采用蛋白酶K/SDS的方法提取噬菌體的基因組，具體方法如下:
[0106](I)向200 μ I已純化的糞腸球菌噬菌體ME-EFl懸液中分別加入蛋白酶K至終濃度為 50 μ g/ml、SDS 至終濃度 0.5% (w/v)、EDTA 至終濃度 20mM，56°C溫育 Ih ；
[0107](2)向上述混合液中加入等體積的飽和酹,溫和顛倒混勻后1000Orpm離心5min,吸取上層水相至一新離心管；
[0108](3)加入等體積的酚:氯仿:異戊醇液(體積比25:24:1)，輕柔混勻后1000Orpm離心5min，將上層水相移至新離心管中；
[0109](4)加入等體積氯仿，充分混勻后1000Orpm離心5min，移上層水相至新離心管中；
[0110](5)重復上一步驟至上層水相無苯酚氣味；
[0111](6)加入等體積異丙醇，于_20°C靜置至少30min ；
[0112](7) 12000rpm 離心 20min,棄上清；
[0113](8)加lml75%的乙醇洗滌沉淀，12000rpm離心5min后棄上清，將離心管開口置于干凈環境下至無乙醇氣味；
[0114](9)用 20 μ I ddH20 溶解沉淀，儲存于 _20°C。
[0115]2、噬菌體基因組的鑒定
[0116]取I μ I步驟I獲得的糞腸球菌噬菌體ME-EFl基因組溶液，加入限制性內切酶NheI配制20 μ I酶切體系，于37°C溫育2h，0.8%瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶。
[0117]酶切處理結果如圖2所示，從圖中可以看出，糞腸球菌噬菌體ME-EFl基因組經限制性內切酶NheI消化后電泳條帶呈抹帶，說明糞腸球菌噬菌體ME-EFl的遺傳物質可被限制性內切酶片段化，得出其遺傳物質是雙鏈DNA (dsDNA)。
[0118]五、糞腸球菌噬菌體頂E-EFl的生物學特性鑒定
[0119]1、噬菌體的最佳感染復數
[0120]感染復數(MOI, multiplicity of infection),其含義是感染時卩遼菌體與細菌的數量比值，也就是平均每個細菌感染噬菌體的數量。而最佳感染復數，即是可使噬菌體獲得最佳生長狀態時的感染復數。具體測定方法為:
[0121](I)按MOI分別為0.01、0.1、1、10、100混合糞腸球菌噬菌體ME-EF1懸液和糞腸球菌(Enterococcus faecalis) 002宿主菌懸液,加入新鮮的BHI培養基補足體積至5ml,于37°C震蕩培養6h ；
[0122](2) 1000Orpm 離心 Imin,分別用 0.45 μ m 濾器過濾；
[0123](3)梯度稀釋后，雙層平板法測定噬菌體滴度，其中噬菌體滴度最高的MOI即為最佳感染復數。
·[0124]按表1所不加入幾腸球菌卩遼菌體IME-EF1和幾腸球菌(Enterococcus faecalis)002宿主菌培養6h后，分別測定各管中噬菌體滴度。可見當MOI=I時噬菌體滴度最高，可以得出噬菌體ME-EFl的最佳感染復數為I。
[0125]表1噬菌體ME-EFl最佳感染復數的測定
[0126]
【權利要求】
1.蛋白質，是如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (b)將序列I的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有具有裂解糞腸球菌功能的由序列I衍生的蛋白質。
2.編碼權利要求1所述蛋白質的核酸分子。
3.根據權利要求2所述的核酸分子，其特征在于:所述核酸分子是編碼權利要求1所述蛋白質的基因；所述基因是如下I)至4)中任一所述的DNA分子: 1)編碼序列為序列表中序列2所示的DNA分子； 2)序列表中序列2所示的DNA分子； 3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA分子雜交且編碼權利要求1所述蛋白質的DNA分子; 4)與I)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼權利要求1所述蛋白質的DNA分子。
4.含有權利要求2或3所述核酸分子的重組載體、表達盒或重組菌。
5.根據權利要求4所述的重組載體，其特征在于:所述重組載體為重組表達載體或重組克隆載體。
6.根據權利要求5所述的重組載體，其特征在于:所述重組表達載體中啟動所述基因轉錄的啟動子為cspA啟動子。
7.權利要求1所述的蛋白質，或權利要求2或3所述的核酸分子，或權利要求4或5所述的重組表達載體、表達盒或重組菌在如下al) _a4)任一中的應用: al)制備裂解糞腸球菌的產品； a2)制備裂解屎腸球菌的產品； a3)制備用于治療由糞腸球菌感染引起的疾病的產品； a4)制備用于治療由屎腸球菌感染引起的疾病的產品。
8.活性成分為權利要求1所述的蛋白質的如下任一產品: bl)裂解糞腸球菌的產品； b2)裂解屎腸球菌的產品； b3)用于治療由糞腸球菌感染引起的疾病的產品； b4)用于治療由屎腸球菌感染引起的疾病的產品。
9.根據權利要求7所述的應用，或權利要求8所述的產品，其特征在于:所述糞腸球菌為如下中的至少一種:幾腸球菌(Enterococcus faecalis) 002、幾腸球菌(Enterococcusfaecalis) 255、幾腸球菌(Enterococcus faecalis) 281 和幾腸球菌(Enterococcusfaecalis) 284。
10.根據權利要求7所述的應用，或權利要求8所述的產品，其特征在于:所述屎腸球菌為屎腸球菌(Enterococcus faecium) 010。
【文檔編號】A61P31/04GK103667230SQ201310628789
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月28日 優先權日:2013年11月28日
【發明者】童貽剛, 米志強, 張文惠, 安小平, 張志毅, 黃勇, 李玉元, 范航, 范華昊 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所