專利名稱：p53蛋白的表位(SQAMDDLMLS)與絲狀噬菌體基因8蛋白的雜合蛋白及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程中的DNA重組技術領域。
背景技術：
腫瘤是僅次于心血管疾病的世界第二號”殺手”疾病。截至到1999年底，全球腫瘤病人總數已逾4000萬人。我國每年有130萬人死于腫瘤。目前，還缺少無法對腫瘤的發生進行有效地診斷、預防和治療的藥品。
p53是一種抑癌基因，其蛋白對維持正常的細胞分裂與生長起重要的調節作用，但是一旦發生突變，突變蛋白半衰期延長，失去抑癌作用，積累于細胞內則刺激免疫系統產生相應抗體。N端20-25肽段、37-46肽段構成的B細胞表位的基因片段插入到整合有絲狀噬菌體主要外殼蛋白基因的載體中，構建成新的重組載體。這種重組載體被轉入宿主菌，大腸桿菌中，在輔助噬菌體存在的條件下，腫瘤表位基因產物被分泌到細胞外，并組裝于噬菌體外殼蛋白中，形成具有具有對應表位的雜合蛋白。
利用噬菌體展示外源多肽技術的優點是有效地實現了基因型和表型的體外轉換，使研究者完全可以在基因分子克隆的基礎上有效地實現蛋白質構象的體外控制，在體外獲得具有良好生物學活性的表達產物。這種新型的基因工程技術在制備生物制品方面具有簡便、快速、靈敏、成本低等優點。
發明內容
本發明的目的是確立一種能夠用于制備腫瘤臨床檢測的生物制品。
本發明的雜合蛋白是含有人類p53N端37-46肽段構成的表位的絲狀噬菌體基因8雜合外殼蛋白。
P53-37-46雜合蛋白基因的核苷酸序列atg aaa aag tct tta gtc ctc aaa gcc tcc gta gcc gtt gct acc ctc 48
gtt ccg atg ctg tct ttc gcc gcg gag ggt tct caa gct atg gat gat96tta atg tta tct cca tcg aac gat cct gca aaa gcg gcc ttt gac tcc 144ctg caa gcc tca gcg acc gaa tat atc ggt tat gcg tgg gcg atg gtt 192gtt gtc att gtc ggc gca act atc ggt atc aag ctg ttt aag aaa ttc 240acc tcg aaa gca agc 255P53-37-46雜合蛋白的氨基酸序列為Met Lys Lys Ser Leu Val Leu Lys Ala Ser Val Ala Val Ala Thr15 10 15Leu Val Pro Met Leu Ser Phe Ala Ala Glu Gly Ser Gln Ala Met20 25 30Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Ser Asn Asp Pro Ala Lys Ala Ala3540 45Phe Asp Ser Leu Gln Ala Ser Ala Thr Glu Tyr Ile Gly Tyr Ala50 55 60Trp Ala Met Val Val Val Ile Val Gly Ala Thr Ile Gly Ile Lys65 70 75Leu Phe Lys Lys Phe Thr Ser Lys Ala Ser80 85雜合蛋白的制備包括以下步驟第一步，構建表達載體和重組載體。
用SacII和BstB I兩種限制性內切酶處理pfd88質粒，然后將人工合成的寡核苷酸片段插入到經酶處理的質粒載體，獲得重組載體pfd8p53-37。
第二步，合成p53蛋白N端37-46肽段表位的基因序列，并在序列兩端加上酶切位點。用商業公司的DNA合成儀進行人工合成。表位基因的序列為(均為5’-3‘方向)正義鏈GGAGGGTTCTCAAGCTATGGATGATTTAATGTTATCTCCAT反義鏈CGATGGAGATAACATTAAATCATCCATAGCTTGAGAACCCTCCGC。
第三步，將重組載體轉入宿主細胞。宿主細胞為帶有F因子的大腸菌株TG1菌株。獲得的轉化體為新的工程菌株pfd8p53-37。
第四步，制備雜合蛋白。培養工程菌株，經過離心、沉淀等步驟可獲得該發明的雜合蛋白。
免疫檢測雜合蛋白可以作為一種抗原與多種腫瘤患者血清中的抗體產生免疫應答用本發明制備的雜合蛋白為抗原，采用免疫檢測方法(如ELISA)，可以檢測到臨床腫瘤(比如，胃癌、結腸瘤、肝癌、乳腺癌和肺癌等)病人血清中的相關抗體。說明該雜合蛋白可以用來制備腫瘤臨床的檢測藥物。
具體實施例方式
1.表位基因的合成利用商業生物公司的DNA合成儀進行表位基因片段GGAGGGTTCTCAAGCTATGGATGATTTAATGTTATCTCCATCGATGGAGATAACATTAAATCATCCATAGCTTGAGAACCCTCCGC)的合成。
2.重組載體的構建1)取pfd88質粒5μg，加入1-2μL的SacII酶，然后加入緩沖液和無菌水至總體積200μl。37℃保溫24小時。酶切后，用常規方法抽提質粒DNA。抽提后，用乙酸胺和二倍體積的乙醇沉淀DNA，并溶于50μL TE液中。
2)用第二種限制性內切酶BstBI處理已經第一種酶切的質粒DNA，方法同上。
3)雙酶切后，進行瓊脂糖凝膠電泳，測定載體濃度。
4)載體與人工合成的外源DNA片段按摩爾濃度1∶3混合。10μL混合液加入0.5μLT4DNA連接酶和1μL緩沖液。在15-20℃條件下，培養過夜，獲得重組載體(pfd8p53-37)。
3.制備感受態細胞將TG1細胞培養于LB培養基上，37℃培養16-20小時。挑選單菌落接種于2ml LB液培養基中，37℃培養過夜。培養液轉入100ml新鮮LB培養液中，37℃培養5小時。5000rpm離心15分鐘。用8ml預冷的0.1mol/L CaCl2懸浮沉淀，獲感受態細胞。
4.重組載體轉化宿主細胞取濃度約為150μg/mL的重組載體DNA溶液1.25μL；加入100μl的感受態細胞，置于碎冰中15分鐘；加入600μl LB培養液，置于37℃恒溫條件培養1小時；10000rpm離心5分鐘；棄上清，將剩余部分涂于含氨芐青霉素的LB培養基表面，37℃恒溫箱中培養過夜。選在培養平面生長的單菌落，進行擴大培養和低溫保存(-70℃)。
5.雜合蛋白的制備取凍存的轉化細胞在LB平板上劃線培養，過夜；選單菌落接種于含氨芐青霉素的3mlLB培養液中，37℃培養過夜；將培養液轉入80-100ml LB培養液中繼續培養，并加入IPTG(終濃度為0.5-1mM/mL)，37℃培養30分鐘；離心(10 000rpm)10分鐘；沉淀用培養液重新懸浮，37℃培養2-4小時；離心(8000rmp)20分鐘，棄上清，用TE液懸浮沉淀；離心(5000rmp)20分鐘，取上清，并加入20％聚乙二醇和2.5mol/L氯化鈉。冷環境中放置4-5小時，離心(8000rmp)10分鐘；棄上清，用TE液懸浮沉淀，獲得有外源多肽展示的絲狀噬菌體雜合外殼蛋白。
6.制備的雜合蛋白的檢測1)采用SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳法進行蛋白的純度檢測將待測蛋白樣品在沸水中處理3-5分鐘。按常規方法進行電泳。電泳后，用硝酸銀染色法對膠板進行染色。如果雜合蛋白表達成功，膠板上出現兩條帶。上方帶為雜合蛋白帶，下方為野生型絲狀噬菌體外殼蛋白帶。由于硝酸銀染色法比較靈敏，如膠板上無其它雜帶出現，說明制備的蛋白已達到純凈標準。
2)采用紫外分光光度法進行制備蛋白的濃度檢測取5-10μL的樣品，稀釋100倍后，測定在270納米處的吸光值。用吸光值除以3.84便得到蛋白溶液的濃度(μg/μL)。
7.免疫檢測實驗采取ELISA方法，用雜合噬菌體作為包被抗原，對待檢者的血清進行檢測。抗原的包被濃度為60μg/mL，一抗為稀釋200倍的患者血清，二抗為羊抗人IgG。染色方法采用TMB法。檢測波長為450/620。對367名腫瘤患者血清進行檢測的結果表明結腸癌28.6％(8/28)、食管癌27.3％(6/22)、胃癌26.9％(7/26)、肺癌23.5％(23/98)、鼻咽癌23.1％(3/13)、乳腺癌18.8％(27/144)、卵巢癌18.2％(2/11)、腦瘤16.7％(2/12)、肝癌15.4％(2/13)。檢測的特異度94.2％，靈敏度為21.8％。
SEQUENCE LISTING<110>東北師范大學<120>p53蛋白的表位(SQAMDDLMLS)與絲狀噬菌體基因8蛋白的雜合蛋白及其應用<130>none<140>---------<141>2005-10-23<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>255<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
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1.p53蛋白的表位(SQAMDDLMLS)與絲狀噬菌體基因8蛋白的雜合蛋白，其特征在于將p53蛋白表位(SQAMDDLMLS)展示于絲狀噬菌體主要外殼蛋白表面，形成的雜合蛋白，蛋白的氨基酸結構序列為Met Lys Lys Ser Leu Val Leu Lys Ala Ser Val Ala Val Ala Thr15 10 15Leu Val Pro Met Leu Ser Phe Ala Ala Glu Gly Ser Gln Ala Met20 25 30Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Ser Asn Asp Pro Ala Lys Ala Ala3540 45Phe Asp Ser Leu Gln Ala Ser Ala Thr Glu Tyr Ile Gly Tyr Ala50 55 60Trp Ala Met Val Val Val Ile Val Gly Ala Thr Ile Gly Ile Lys65 70 75Leu Phe Lys Lys Phe Thr Ser Lys Ala Ser80 85
2.p53蛋白的表位(SQAMDDLMLS)與絲狀噬菌體基因8蛋白的雜合蛋白，其特征是這種雜合蛋白的核苷酸序列為atg aaa aag tct tta gtc ctc aaa gcc tcc gta gcc gtt gct acc ctc 48gtt ccg atg ctg tct ttc gcc gcg gag ggt tct caa gct atg gat gat 96tta atg tta tct cca tcg aac gat cct gca aaa gcg gcc ttt gac tcc144ctg caa gcc tca gcg acc gaa tat atc ggt tat gcg tgg gcg atg gtt192gtt gtc att gtc ggc gca act atc ggt atc aag ctg ttt aag aaa ttc240acc tcg aaa gca agc 255
3.如權利要求1所述的p53蛋白的表位(SQAMDDLMLS)與絲狀噬菌體基因8蛋白的雜合蛋白作為制備檢測腫瘤的臨床檢測藥品的用途。
4.如權利要求2所述的p53蛋白的表位(SQAMDDLMLS)與絲狀噬菌體基因8蛋白的雜合蛋白作為制備檢測腫瘤的臨床檢測藥品的用途。
全文摘要
本發明屬于生物工程中的DNA重組技術領域。利用DNA重組技術，將P53蛋白N端37－46肽段構成的B細胞表位的基因片段插入到整合有絲狀噬菌體主要外殼蛋白基因的載體中，構建成新的重組質粒。在宿主菌中，表位基因產物被分泌到細胞外，并組裝于噬菌體外殼蛋白中，形成雜合蛋白。雜合蛋白可以作為一種抗原可以檢測到臨床腫瘤(比如，胃癌、肝癌、乳腺癌和肺癌等)病人血清中的相關抗體患者血清中的抗體。所以，這種雜合蛋白在制備腫瘤臨床診斷試劑方面具有良好的應用前景。
文檔編號C12N15/62GK1803846SQ20051011914
公開日2006年7月19日 申請日期2005年12月27日 優先權日2005年12月27日
發明者王麗, 華攀玉, 高瑞娟 申請人:東北師范大學