多糖-蛋白軛合物疫苗的制作方法
【專利摘要】本發明公開了以高產率合成和制備多糖-蛋白軛合物疫苗的方法。該方法涉及一種反應物上的酰肼基團與其他反應物上的醛基或氰酸鹽酯基的反應。所述反應以較高的軛合效率快速進行，因此可以采用簡化的純化方法從未軛合的蛋白和多糖以及其他小分子副產物中分離出所述軛合物。
【專利說明】多糖-蛋白軛合物疫苗
發明領域
[0001]本發明提供了以較高產量合成與制備多糖-蛋白軛合物疫苗的方法。該方法涉及在一種反應物上的酰肼基與另一種反應物上的醛基或氰酸鹽酯基反應。所述反應以較高的軛合效率快速進行。可使用簡化的純化方法從未軛合的蛋白和多糖以及其他小分子副產物中分離所述軛合產物。
[0002]發明背景
[0003]細菌多糖(PSs)是在大齡兒童和成人中誘導短期免疫的非T細胞依賴性抗原，但幼小嬰兒卻常常缺乏。PSs并不能與主要組織相容性復合物結合，所述主要組織相容性復合物是抗原提呈以及刺激T-輔助淋巴細胞所必需的。PSs可以在無需T-輔助細胞淋巴細胞的幫助下刺激B淋巴細胞產生抗體。作為所述B淋巴細胞非T細胞依賴性刺激的結果，在這些抗原的免疫之后依然缺少記憶誘導。
[0004]通過多糖與蛋白分子的共價結合，非T細胞依賴性多糖抗原可轉變為T細胞依賴性抗原。結合于所述軛合物疫苗多糖部分的B細胞可由輔助性T細胞來活化，該輔助性T細胞對該軛合載體蛋白部分的多肽具有特異性。對該載體蛋白產生應答的T輔助細胞能增強針對該多糖的抗體產生。多糖軛合疫苗是由蛋白與多糖的共價連接形成的多糖-蛋白雜合體。因為大多數天然細菌多糖在先經受某些化學修飾(“活化”)之前不能與蛋白化學相連，所以通常需要在結合前對所述多糖進行化學修飾。
[0005]對所述蛋白的結合產生了多種T細胞抗原決定簇。這些T細胞抗原決定簇會與CD4輔助性T細胞相互作用，極大地促進對所述結合多糖的抗體應答。甚至在嬰兒體內，對軛合物的所述T輔助細胞依賴性應答可產生血清IgG抗體和免疫記憶。而且，與天然多糖相比，所述多糖軛合物的免疫原性對所述軛合多糖的大小的依賴程度有所降低。因此，采用多糖或寡糖制備的軛合物具有類似的免疫原性。
[0006]可采用多種軛合反應將多糖與蛋白共價連接。三種較為常用的方法有:1)還原性氨基化，其中一種反應成分的醛基或酮基與另一種反應成分的氨基或酰肼基反應，所形成的C=N雙鍵隨后被還原劑還原成C-N單鍵；2)氰基化軛合，其中可通過溴化氰(CNBr)或1-氰-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸(CDAP)向該羥基引入一個氰基，在加入蛋白成分后，其與氨基或酰肼基形成共價鍵；3)碳二亞胺反應，其中碳二亞胺能活化所述軛合反應中一種成份的羧基，所活化的羧基再與另一成分的氨基或酰肼基反應。這些反應經常被用來在所述軛合反應之前對所述軛合物的 成份進行活化。
[0007]b型嗜血流感桿菌(Hib)軛合物疫苗是用于臨床的第一種多糖-蛋白軛合物疫苗。Robbins及其同事在1980年運用生物工程技術將糖化學地連接到蛋白載體上，這是50年前就發展出來的概念。參見Avery等人，J.Exp.Med.1929; 50:533-550; Schneerson等人，J.Exp.Medl980; 152:361-376。在美國目前有四種不同的Hib軛合物疫苗獲得了許可，每種各不相同，且各自具有其物理，化學和免疫學特征，如表1所總結。在這些疫苗所使用的軛合化學和質量控制的詳細論述已經出版。參見Ellis等人在《b型等嗜血桿菌軛合物疫苗的發展與臨床應用》(Development and clinical uses of Haemophilus b conjugatevaccines) 一書中由Kniskern等人所著的《軛合物:設計，化學與分析》"Conjugation:design, chemistry, and analysis"章節，紐約，Marcel Dekker 出版社，1994 年，37-69 頁。
[0008]表1
[0009]
【權利要求】
1.制備軛合物疫苗的方法，該方法包括: 在pH約為6至約7，存在1-[3-( 二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的條件下，將蛋白與1-氨基_2，3-丙二醇(APDO)反應，由此得到APDO修飾的蛋白溶液； 通過緩沖液更換將所述APDO修飾的蛋白溶液的pH調至約10.0到約11.0; 將所述APDO修飾的蛋白與氧化劑反應，由此得到醛活化的蛋白溶液； 通過緩沖液更換將所述醛活化的蛋白溶液的PH調至約10.0至約11.0 ； 在pH約6至約8的條件下，將酰肼活化的多糖與醛活化的蛋白反應，由此得到含有一或多個C=N雙鍵的軛合物；及 將所述軛合物的基本全部C=N雙鍵還原成C-N單鍵，由此得到能刺激免疫反應的軛合物疫苗。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述多糖選自腦膜炎球菌多糖，肺炎球菌多糖，b型嗜血流感桿菌多糖，傷寒桿菌Vi多糖，以及B型鏈球菌多糖。
3.如權利要求1所述的方法，其中所述蛋白選自破傷風類毒素，白喉類毒素，CRM197以及腦膜炎球菌蛋白。
4.如權利要求1所述的方法，其中通過以下步驟來制備酰肼活化的多糖: 在溶液中將多糖與氧化劑反應，由此得到醛活化的多糖； 將所述醛活化的多糖與己二酸二酰肼反應，得到含有一或多個C=N雙鍵的中間體；以及 將所述中間體的基本全部C=N雙鍵還原成C-N單鍵，由此得到酰肼活化的多糖。
5.如權利要求1所述的方法，其中通過以下步驟來制備酰肼活化的多糖: 將多糖與1-氰-4- 二甲基銨吡啶四氟硼酸反應，由此得到氰酸鹽活化的多糖； 將所述氰酸鹽活化的多糖與己二酸二酰肼反應，由此得到酰肼活化的多糖。
6.如權利要求1所述的方法，其中通過以下步驟來制備酰肼活化的多糖: 在1-[3_( 二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽存在的條件下，將多糖與己二酸二酰肼反應，由此得到酰肼活化的多糖。
7.軛合物疫苗，所述軛合物疫苗包括至少一種多糖部分和至少一種蛋白部分，其中所述多糖部分與所述蛋白部分通過至少一種式-C(=0)-NH-CH2-CH2-NH-NH-的連接基團相連接。
8.如權利要求7所述的軛合物疫苗，其中所述軛合物疫苗含有通過多個連接基團將多個多糖部分與多個蛋白部分交聯形成的晶格結構。
9.如權利要求7所述的軛合物疫苗，其中所述多糖選自腦膜炎球菌多糖，肺炎球菌多糖，b型嗜血流感桿菌多糖，傷寒桿菌Vi多糖，以及B型鏈球菌多糖。
10.如權利要求7所述的軛合物疫苗，其中所述蛋白選自破傷風類毒素，白喉類毒素，CRM197以及腦膜炎球菌蛋白。
【文檔編號】A61K39/095GK103623405SQ201310439763
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2004年8月6日 優先權日:2003年8月6日
【發明者】車恒·羅伯特·李, 卡爾·E·弗拉施 申請人:美國政府健康及人類服務部