一種板藍根植物蛋白或多肽及其提取方法和其在抗病毒藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了板藍根植物蛋白或多肽及其提取方法和其在抗病毒藥物中的應用，通過粉碎板藍根藥材，將粉碎后的板藍根藥材用去離子水浸漬數小時并離心，將清液過超濾膜超濾，再冷凍干燥，可得分子量為15-50kDa的板藍根粗蛋白或多肽，并檢測得出粗蛋白或多肽為板藍根質量百分數的50～90%。上述板藍根植物蛋白或多肽，用于制備預防和治療病毒性疾病、炎癥、提高免疫的抗病毒藥物。
【專利說明】一種板藍根植物蛋白或多肽及其提取方法和其在抗病毒藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種從中藥板藍根中提取的一類植物蛋白及其提取方法和其在抗病毒藥物中的應用，屬于醫藥【技術領域】。
【背景技術】
[0002]近年來，SARS、禽流感、以及甲型HlNl流感病毒在我國乃至世界范圍頻繁爆發，對人的生命安全和社會經濟造成極大損害。
[0003]長期以來，人們通過疫苗來預防病毒，且取得了良好效果，但疫苗只有與病毒亞型相配時才會有效。病毒變異快且爆發具有不可預測性，而疫苗研究和生產相對滯后。
[0004]針對疫苗的這種弊端，人們開始廣泛研究抗病毒藥物，以此來對抗病毒。西藥抗病毒藥物具有見效快、療效高、作用準確等特點，但每類藥物均具有針對性，只針對某種特定的病毒起作用，因病毒抗原易變異性因素，導致一些制作抗病毒藥物的化學藥物的應用也有一定局限性。許多中藥具有抑制病毒復制、阻止病毒致細胞病變等功效，中藥通過調節免疫功能、改善肺循環、鎮痛抗炎等綜合作用，進而抑制或者殺滅病毒，具有良好的防治病毒的作用。
[0005]從傳統中藥中充分挖掘和尋找抗病毒活性物質也是近年研究的熱點之一。板藍根具有可靠的抗病毒作用，為家庭常備藥物。板藍根為十字花科植物菘藍(Isatisindigotica)的干燥根，具有清熱解毒、涼血利咽之功效，常用于治療流感、腮腺炎、溫病發熱、流行性乙型腦炎、肝炎等病毒感染性疾病。板藍根成分復雜，其物質基礎和作用機制的不明確，生產工藝仍然比較落后，生產處于一種粗放型狀態，產品科技含量低，附加值不高，限制了產品的推廣和應用，難以進入國際市場。企業迫切需要對板藍根產品進行“二次開發”，增加產品科技含量和提高競爭力，為此，研究板藍根抗病毒效應成為關鍵。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于提供一種板藍根植物蛋白或多肽，可以用于制備抗病毒、抗炎、促進免疫的藥物。
[0007]本發明的另一目的在于提供一種板藍根植物蛋白或多肽的提取方法，提取方法簡單，各易制備。
[0008]本發明的另一目的在于提供一種板藍根植物蛋白或多肽在抗病毒藥物中的應用，用于制備抗病毒、抗炎、促進免疫的藥物，為SARS、禽流感以及甲型HlNl流感病毒等病毒提供有效的預防藥物。
[0009]本發明板藍根植物蛋白或多肽，所述植物蛋白或多肽的分子量為15_50kDa，是通過對板藍根進行提純而獲得的，其在板藍根提純物中的質量百分數為50~90%。
[0010]本發明對板藍根進行提純的方法，包括以下步驟:
[0011]A、板藍根藥材粉碎過20-40目；[0012]B、加 5-20 倍去離子水在 4-30°C浸潰 2-24 小時，4000_9000rpm 離心 5_15min ；
[0013]C、取上清液，超濾膜超濾，得濾液，再冷凍干燥得板藍根粗蛋白或多肽。
[0014]D、在濾液中加入硫酸銨使其含量達到80%，靜置2-24小時；
[0015]E、過濾，用去離子水透析，至去除可檢測的殘余硫酸根，獲得板藍根的粗蛋白或多肽，冷凍干燥。
[0016]本發明對板藍根進行提純的方法，包括以下步驟:
[0017]A、板藍根藥材粉碎過20-40目；
[0018]B、加5-20倍8-20mM的pH5_9的磷酸緩沖液，在4_30 °C浸潰2_24小時，4000-9000rpm 離心 5_15min ； [0019]C、取上清液，過超濾膜超濾，得濾液，再冷凍干燥得板藍根粗蛋白或多肽。
[0020]D、在濾液中加入硫酸銨使其含量達到80%，靜置2-24小時；
[0021]E、過濾，用去離子水透析，至未見可檢測的殘余硫酸根，獲得板藍根的粗蛋白或多肽，冷凍干燥。
[0022]本發明對板藍根進行提純的方法，包括以下步驟:
[0023]A、板藍根藥材粉碎過20-40目；
[0024]B、加5-20倍8-20mM的pH5_9的磷酸緩沖液，在4_30 °C浸潰2_24小時，4000-9000rpm 離心 5_15min ；
[0025]C、取上清液，過超濾膜超濾，得濾液，再冷凍干燥得板藍根粗蛋白或多肽。
[0026]D、在濾液中加入丙酮使其含量達到40-80%，靜置2_24小時；
[0027]E、過濾取沉淀，得板藍根的粗蛋白或多肽，冷凍干燥。
[0028]本發明對板藍根進行提純的方法，包括以下步驟:
[0029]A、板藍根藥材粉碎過20-40目；
[0030]B、加 5-20 倍去離子水在 4-30°C浸潰 2-24 小時，4000_9000rpm 離心 5_15min ；
[0031]C、取上清液，過超濾膜超濾；
[0032]D、濾液加入丙酮使其含量達到40-80%，靜置2_24小時。
[0033]E過濾取沉淀，得板藍根的粗蛋白或多肽，冷凍干燥。
[0034]進一步地，所述對板藍根進行提純的方法，還包括以下步驟:
[0035]F、將所得粗蛋白或多肽用去離子水溶解，用鹽酸調pH4-6 ；
[0036]G、取陽離子交換介質，用鹽酸調節pH4-6的去離子水懸浮，并裝柱平衡；
[0037]H、粗蛋白或多肽溶液加入到平衡的陽離子交換柱子，用去離子水洗脫至色變淡，再用氨水調節PH8-9的去離子水洗脫，留取洗脫液冷凍干燥，得精制的板藍根植物蛋白或多肽提純物。
[0038]進一步地，所述對板藍根進行提純的方法，還包括以下步驟:
[0039]F、將所得粗蛋白或多肽用8_20mM pH4_6的磷酸緩沖液溶解，取陽離子交換介質；
[0040]G、用8_20mM pH4_6的磷酸緩沖液懸浮，并裝柱，平衡緩沖；
[0041]H、粗蛋白或多肽溶液加入到平衡的陽離子交換柱子，用8_20mM pH4_6的磷酸緩沖液洗脫至色淡，再用含0.2-10M的起始緩沖液洗脫，留取洗脫液冷凍干燥，得精制的板藍根植物蛋白或多肽提純物。
[0042]本發明板藍根植植物蛋白或多肽的制備方法，包括上述對板藍根進行提純的方法。
[0043]本發明植物蛋白或多肽作為抗病毒藥物的應用。
[0044]本發明板藍根植物蛋白或多肽，分子量為15_50kDa，是通過對板藍根進行提純而獲得的，其在板藍根提純物中的質量百分數為50~90%。板藍根植物蛋白或多肽從板藍根中提取，為板藍根的二次開發，其提取方法簡單，容易制備，同時從板藍根中提取的植物蛋白或多肽可以用于制備抗病毒、抗炎、促進免疫的藥物，為SARS、禽流感以及甲型HlNl流感病毒等病毒提供有效的預防藥物。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0045]圖1為本發明板藍根植物蛋白或多肽的電泳譜圖。
【具體實施方式】
[0046]以下通過實施例的形式對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明，但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實施例，凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。
[0047]請參閱圖1，本發明實施例板藍根植物蛋白或多肽，其分子量為15_50kDa (千道爾頓)，純度達50~90% (質量百分數)，是由板藍根中提純而獲得的。其中，15、24、26、34KDa四個條帶，24KDa為胰蛋白酶的條帶，其他幾個為板藍根蛋白或多肽。
[0048]以下通過BCA法(bicinchoninic acid)來測定板藍根中植物蛋白或多肽的含量(質量百分數)。
`[0049]標準曲線制作:分別精密吸取1、2、4、8、12、20μ L的lmg/mL BSA (牛血清白蛋白)標液，加于96孔板中，加水補足20 μ L，各孔然后加入200 μ L BCA工作液，放入酶標儀中。設定程序如下:搖勻30s (秒),37°C下保溫15min (分),562nm (納米)波長檢測。
[0050]以BSA濃度為橫坐標，測量值為縱坐標，繪制出標準曲線為y=0.01Ox+0.146，R2=0.998。結果顯示BSA在O~90.909 μ g/mL范圍內線性關系良好。
[0051]樣品測定:準備三批板藍根樣品，分別加超純水定容于25mL量瓶中，吸取20μ L加入96孔板中，然后加入200 μ L BCA工作液，按上述程序設定檢測。三批樣品多肽含量(質量百分比)結果如下:
[0052]
i23
含量(％)64.178^589Ζ64
[0053]準備多批次板藍根提純物，通過BCA法測出的實驗結果顯示，上述板藍根中植物蛋白或多肽的純度達50~90% (質量百分數)。
[0054]本發明的板藍根植物蛋白或多肽的分子量為15_50kDa (千道爾頓)，由板藍根中提純而獲得，純度達50~90% (質量百分數)，其提取方法步驟如下:
[0055]A、板藍根藥材粉碎過20-40目。
[0056]B、加 5-20 倍去離子水在 4-30°C浸潰 2-24 小時，4000_9000rpm (rev/min，轉圈 /每分鐘)離心5_15min (分鐘)。
[0057]C、取上清液，過1000Da (道爾頓)的超濾膜超濾，得濾液，再冷凍干燥得板藍根粗蛋白或多肽。
[0058]上述方法中，為使板藍根粗蛋白更純，還可以再加入以下步驟:
[0059]D、在濾液中加入硫酸銨使其含量達到80%，靜置2-24小時。
[0060]E、過濾，用去離子水透析，至去除可檢測的殘余硫酸根，獲得板藍根的粗蛋白或多肽，冷凍干燥。
[0061]本發明提供了第二種板藍根植物蛋白或多肽的提取方法，其步驟如下:
[0062]A、板藍根藥材粉碎過20-40目。
[0063]B、加5-20倍8-20mM (mmol/L，毫摩爾/升)的磷酸緩沖液(pH5_9)在4_30°C浸潰2-24 小時，4000-9000rpm 離心 5_15min。
[0064]C、取上清液，過1000Da的超濾膜超濾，得濾液，再冷凍干燥得板藍根粗蛋白或多肽。
[0065]上述第二種方法中，為使板藍根粗蛋白更純，還包括以下步驟:
[0066]D、在濾液中加入硫酸銨使其含量達到80%，靜置2-24小時。
[0067]E、過濾，用去離子水透析，至未見可檢測的殘余硫酸根，獲得板藍根的粗蛋白或多肽，冷凍干燥。
[0068]上述第二種方法中，為使板藍根粗蛋白更純，也可以還包括以下步驟:
[0069]D、在濾液中加入丙酮使其含量達到40-80%，靜置2_24小時。
[0070]E、過濾取沉淀，得板藍根的粗蛋白或多肽，冷凍干燥。
[0071]本發明提供了第三種板藍根植物蛋白或多肽的提取方法，其步驟如下:
[0072]A、板藍根藥材粉碎過20-40目。
[0073]B、加 5-20 倍去離子水在 4-30°C浸潰 2-24 小時，4000_9000rpm 離心 5_15min。
[0074]C、取上清液，過1000Da的超濾膜超濾。
[0075]D、濾液加入丙酮使其含量達到40-80%，靜置2_24小時。
[0076]E、過濾取沉淀，得板藍根的粗蛋白或多肽，冷凍干燥。
[0077]上述三種方法提取所得的板藍根粗蛋白或多肽可以用以下方法精制:
[0078]F、將所得粗蛋白或多肽用去離子水溶解，用HCl溶液(鹽酸)調pH4_6。
[0079]G、取陽離子交換介質，用HCl調節pH4_6的去離子水懸浮，并裝柱平衡。
[0080]H、粗蛋白或多肽溶液加入到平衡的陽離子交換柱子，用去離子水洗脫至色變淡，再用氨水調節PH8-9的去離子水洗脫，留取洗脫液冷凍干燥，得精制的板藍根植物蛋白或多肽。
[0081]上述三種方法提取所得的板藍根粗蛋白或多肽也可以用以下方法精制:
[0082]F、將所得粗蛋白或多肽用8_20mM pH4_6磷酸緩沖液溶解，取陽離子交換介質。
[0083]G、用8_20mM pH4_6磷酸緩沖液懸浮，并裝柱，平衡緩沖。
[0084]H、粗蛋白或多肽溶液加入到平衡的陽離子交換柱子，用8_20mM pH4_6的磷酸緩沖液洗脫至色淡，再用含0.2-10M (mol/L，摩爾/升)的起始緩沖液洗脫，留取洗脫液冷凍干燥，得精制的板藍根植物蛋白或多肽。
[0085]在具體實例中，按以上方法制備的板藍根植物蛋白或多肽用BCA法測定，可測得其含量為50-90%，取適量樣本在聚丙烯酰胺電泳，通過考馬斯亮藍染色顯示可測得蛋白帶主要集中于分子量15-50kDa (如圖1)。
[0086] 針對板藍根化學成份的抗病毒作用，深入研究發現板藍根中分子量為15_50kDa(千道爾頓)，純度達50~90%的植物蛋白或多肽，進行分離純化后，藥理研究顯示具有強烈的抗病毒活性。因此，板藍根蛋白或多肽極大可能是板藍根抗病毒的主要活性成分。
[0087]上述板藍根植物蛋白或多肽可以應用在抗病毒藥物中，用于制備抗病毒、抗炎、促進免疫的藥物。
[0088]上述板藍根植物蛋白或多肽作為抗病毒藥物的主要成份，可以單獨制成成藥，也可與板藍根其它有效成分合用制成成藥，以用于制備治療或預防病毒性疾病、炎癥、提高免疫的藥物。例如添加稀釋劑、崩解劑、矯味劑、著色劑、防腐劑，也可以制備成片劑、顆粒劑、膠囊劑、溶液劑、口服液等口服用制劑及溶液劑、氣霧劑、滴鼻劑、注射劑、粉針。
[0089]上述板藍根植物蛋白或多肽用于制備預防和治療病毒性疾病、炎癥、提高免疫的藥物。
[0090]上述板藍根植物蛋白或多肽作為板藍根主要的抗病毒活性成分，可用于控制板藍根藥材及其相關制劑的指標成分。
[0091 ] 上述板藍根植物蛋白或多肽在抗病毒藥物中的應用，其在胃腸道中降解成小肽被吸收發揮作用，可用于控制板藍根藥材及其相關制劑的質量。
[0092]上述板藍根植物蛋白或多肽作為板藍根主要的抗病毒活性成分，可以通過如下實驗來證明:
[0093]實驗I板藍根植物蛋白或多肽對流感病毒感染小鼠死亡的保護實驗
[0094]1.實驗材料
[0095]甲型流感病毒鼠肺適應株HlNl(A/PR8/34)(中科院武漢病毒研究所提供)，在9-10日齡的SPF (specific pathogen free,無特定病原體)雞胚中傳代增殖后,分裝保存于_80°C備用；SPF級雌性昆明小鼠，14-16g (青島市實驗動物和動物實驗中心提供);利巴韋林注射液(50mg/ml)(山東魯抗辰欣藥業有限公司提供),板藍根(甘肅產)。
[0096]2.實驗方法
[0097]將小鼠隨機分為6組，每組10只，分別為正常組、模型組、利巴韋林組、多肽大、中、小劑量組，除空白對照組外，各實驗組動用乙醚輕度麻醉，以4LD50 (半數致死量，即LethalDose, 50’)的流感病毒液滴鼻感染小鼠造模，0.05ml/只，正常組生理鹽水滴鼻對照。造模后當日灌胃給藥，其中利巴韋林為腹腔注射，連續7天，正常組和模型組給予生理鹽水對照。自造模當日起連續觀察14天，計算各組死亡率及平均生時間。
[0098]3.結果見表1
[0099]表1板藍根多肽對流感病毒感染小鼠死亡保護率的影響(I ±s η=?ο)
[0100]
【權利要求】
1.一種板藍根植物蛋白或多肽，所述植物蛋白或多肽的分子量為15-50kDa，是通過對板藍根進行提純而獲得的，其在板藍根提純物中的質量百分數為50~90%。
2.如權利要求1所述的植物蛋白或多肽，所述對板藍根進行提純的方法包括以下步驟: A、板藍根藥材粉碎過20-40目； B、加5-20倍去離子水在4-30°C浸潰2-24小時，4000_9000rpm離心5_15min； C、取上清液，超濾膜超濾，得濾液，再冷凍干燥得板藍根粗蛋白或多肽。 D、在濾液中加入硫酸銨使其含量達到80%，靜置2-24小時； E、過濾，用去離子水透析，至去除可檢測的殘余硫酸根，獲得板藍根的粗蛋白或多肽，冷凍干燥。
3.如權利要求1所述的植物蛋白或多肽，所述對板藍根進行提純的方法包括以下步驟: A、板藍根藥材粉碎過20-40目； B、加5-20倍8-20mM的pH 5_9的磷酸緩沖液，在4_30°C浸潰2_24小時，4000_9000rpm離心 5_15min ； C、取上清液，過超濾膜超濾，得濾液，再冷凍干燥得板藍根粗蛋白或多肽。 D、在濾液中加入硫酸銨使其含量達到80%，靜置2-24小時； E、過濾，用去離子水透析，至未見可檢測的殘余硫酸根，獲得板藍根的粗蛋白或多肽，冷凍干燥。
4.如權利要求1所述的植物蛋白或多肽，所述對板藍根進行提純的方法包括以下步驟: A、板藍根藥材粉碎過20-40目； B、加5-20倍8-20mM的pH5_9的磷酸緩沖液，在4_30°C浸潰2_24小時，4000_9000rpm離心 5_15min ； C、取上清液，過超濾膜超濾，得濾液，再冷凍干燥得板藍根粗蛋白或多肽。 D、在濾液中加入丙酮使其含量達到40-80%，靜置2-24小時； E、過濾取沉淀，得板藍根的粗蛋白或多肽，冷凍干燥。
5.如權利要求1所述的植物蛋白或多肽，所述對板藍根進行提純的方法包括以下步驟: A、板藍根藥材粉碎過20-40目； B、加5-20倍去離子水在4-30°C浸潰2-24小時，4000_9000rpm離心5_15min； C、取上清液，過超濾膜超濾； D、濾液加入丙酮使其含量達到40-80%，靜置2-24小時。 E過濾取沉淀，得板藍根的粗蛋白或多肽，冷凍干燥。
6.如權利要求2至5中任意一項所述的植物蛋白或多肽，所述對板藍根進行提純的方法，還包括以下步驟: F、將所得粗蛋白或多肽用去離子水溶解，用鹽酸調PH4-6； G、取陽離子交換介質，用鹽酸調節PH4-6的去離子水懸浮，并裝柱平衡； H、粗蛋白或多肽溶液加入到平衡的陽離子交換柱子，用去離子水洗脫至色變淡，再用氨水調節PH8-9的去離子水洗脫，留取洗脫液冷凍干燥，得精制的板藍根植物蛋白或多肽提純物。
7.如權利要求2至5中任意一項所述的植物蛋白或多肽，所述對板藍根進行提純的方法，還包括以下步驟: F、將所得粗蛋白或多肽用8-20mMpH4_6的磷酸緩沖液溶解，取陽離子交換介質； G、用8-20mMpH4_6的磷酸緩沖液懸浮，并裝柱，平衡緩沖； H、粗蛋白或多肽溶液加入到平衡的陽離子交換柱子，用8-20mMpH4_6的磷酸緩沖液洗脫至色淡，再用含0.2-10M的起始緩沖液洗脫，留取洗脫液冷凍干燥，得精制的板藍根植物蛋白或多肽提純物。
8.—種板藍根植植物蛋白或多肽的制備方法，包括如權利要求2至5中任意一項所述的對板藍根進行提純的方法。
9.如權利要求1所述的植物蛋白或多肽作為抗病毒藥物的應用。
【文檔編號】A61P31/16GK103641899SQ201310535592
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年11月1日 優先權日:2013年11月1日
【發明者】劉西京 申請人:深圳職業技術學院