一種ln-1免疫致小鼠生育障礙模型的構建的制作方法
【專利摘要】本發明公開一種生育障礙，即復發性流產及不孕的小鼠模型的建立方法。該小鼠模型的建立方法通過用LN-1主動免疫免疫BALB／c小鼠，產生層粘連蛋白-1自身抗體(LN-1)，該抗體會引起自身免疫反應，誘導小鼠的流產及不孕。抗層粘連蛋白-1自身抗體(抗LN-1抗體)具有引起早孕階段的習慣性流產甚至不孕的特點。該模型穩定，安全可靠，可重復率高，可用于目前發病率越來越高的復發性流產及不孕癥的醫學基礎研究及臨床研究，并且可以用為對藥物療效的觀察，有良好的應用前景。
【專利說明】一種LN-1免疫致小鼠生育障礙模型的構建
【技術領域】 [0001] 生育功能障礙方面
【背景技術】 [0002] 生殖是醫學研究的熱點，復發性流產是生育期婦女常見的妊娠并發 癥，復發性自然流產的病因及病理機制非常復雜，其中有大約50%尚無明確病因，研究發 現，免疫因素在其病理機制中占有重要位置。近代生殖免疫研究表明，復發性流產和不孕 的病因，除染色體、解剖和內分泌異常外，約50%?60%與免疫有關。流產史的猴子血清 中，并且該抗體尤其與子宮內膜異位證的復發性流產及不孕有相關性。從生殖免疫觀點 看來，妊娠是一種成功的半同種移植，妊娠失敗、流產可看為移植失敗。除常見原因（染 色體、解剖、內分泌、感染）之外，許多原因不明的流產可能與免疫排斥，即自身抗體的存 在有關。國外文獻報道：抗層粘連蛋白-1抗體與復發性流產及不孕相關。層粘連蛋白-1 是由α?，β?， Y1鏈組成的異三聚體，最初是由Ruper Timp等于20世紀70年代從小鼠 EHS(engel-breth-holm-swarm)肉瘤中分離出來的。層粘連蛋白-1屬于黏附分子整合素 蛋白家族，為細胞外基質的主要成分，是細胞黏附于基質的重要介質，與其受體結合后直接 或間接控制細胞活動，如粘附或轉移、極化和分化、增殖或凋亡、基因表達及刺激癌細胞產 生膠原酶等，并在滋養細胞的黏附、侵入過程中有重要作用。抗LN-1的自身抗體在生殖中 有重要作用。動物實驗表明，習慣性流產或不孕與自身抗體有關，抗層粘連蛋白-1自身抗 體首先發現于有習慣性流產史的猴子血清中，用鼠層粘連蛋白-1或其層粘連蛋白-1殘基 免疫猴，猴血清會引起胚胎毒性，不孕或習慣性流產。定位該抗體，發現其位于來自胚胎的 Reicher' s膜和卵黃囊內胚層細胞。臨床研究顯示，習慣性流產患者血清中的IgG層粘連 蛋白-1自身抗體明顯升高。而且，其增高與其它IgG自身抗體如β 2糖蛋白-1依賴的抗 心磷脂抗體，狼瘡抗體，抗DNA抗體，抗核抗體等無關。推測血清中的層粘連蛋白-1自身抗 體可能引起人類早孕階段的習慣性流產。構建動物模型可以更好的進行醫學基礎及臨床研 究，但鑒于國情及各醫學院校的條件，構建猴子、狗等動物模型不切實際，故我們構建小鼠 的模型更加具有普遍性。建立可行的LN-1免疫流產小鼠模型，為研究相關流產及不孕的病 因的基礎研究提供研究對象，為探討復發性流產及不孕藥物治療的新途徑提供研究平臺。
【發明內容】
[0003] 層粘連蛋白-1自身抗體可能引起早孕階段的習慣性流產。
[0004] 選取雌性BALB / C小鼠，8-10周。在模型組的雌性小鼠后腳真皮內注射15ugLN-l 蛋白免疫小鼠；空白組僅注射完全弗氏佐劑。3周后加強免疫一次，第8周小鼠合籠，觀察 妊娠結局及進行相關指標的檢測。
[0005] 本發明采用的小鼠為BALB / c清潔級近交系小鼠。
[0006] 該抗體可用于建立習慣性流產及不孕的小鼠模型，可用于復發性流產及不孕癥的 基礎及臨床研究。
【專利附圖】
【附圖說明】 [0007] 圖1.本發明的技術路線。
【具體實施方式】 [0008] ：1. 1實驗動物雌性BALB / C小鼠，8-10周，45只，體重20-22克， 由北京維通利華實驗動物有限公司提供。
[0009] 1. 2藥物抗層粘連蛋白-1 (LN-1) sigma產
[0010] 1. 3試劑：聚丙乙烯板上包被，胎牛血清，辣根過氧化物酶，含雙氧水的鄰苯二胺， 硫fe。
[0011] 1.4實驗方法
[0012] 1. 4. 1.實驗分組：對照組（30只）、模型組（45只）
[0013] 1. 4. 2將免疫用的LN-1與完全弗氏佐劑乳化；
[0014] 1. 4. 3在模型組的雌性小鼠后腳真皮內注射15ugLN_l蛋白免疫小鼠；空白組僅注 射完全弗氏佐劑。
[0015] 1. 4. 43周后模型組的雌性小鼠同一部位再次注射含15ugLN-l的PBS，對照組注射 PBS。
[0016] 1. 4. 58周后對2組小鼠采血測定抗LN-1抗體，與雄性1 :1交配一周，等到生產后 3天再次采血，測定抗LN-1抗體，計算各組妊娠率，流產率，產子率。
[0017] 1. 4. 5.應用ELASE方法，取各組血清進行層粘連蛋白-1抗體測定。
[0018] 1. 4. 6在490nm處測定光密度（0D值）。分別計算出的平均0D值，得出抗體滴度。
[0019] 2·結果：
[0020] 2. 1小鼠的妊娠率及流產率：對照組30只中27只生產，其中2只共有4只死胎； 模型組45只中4只生產，其中1只有流產現象，生產數量不明，另一只難產，輔助取胎，6只 小鼠均為死胎。結果：對照組妊娠率90%，模型組組妊娠率8. 89%，對照組流產率為0,模 型組組流產率25%。故生育障礙的模型小鼠建立成功。
[0021]
【權利要求】
1. 選取8-10周雌性BALB / C小鼠。
2. 雌性小鼠后腳真皮內注射15ugLN-l蛋白免疫小鼠，3周后加強免疫一次，第8周小 鼠合籠。
3. 本發明采用的小鼠為BALB / c清潔級近交系小鼠。
【文檔編號】A61K39/395GK104147600SQ201310547210
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2013年11月8日 優先權日:2013年11月8日
【發明者】楊樺, 藺莉 申請人:首都醫科大學附屬北京友誼醫院