斑馬魚造血干細胞缺陷模型的建立及應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及斑馬魚造血干細胞缺陷模型的建立及應用。首次分別通過化學誘導和morpholino敲除兩種途徑獲得了斑馬魚造血干細胞缺陷模型，其可作為篩藥模型，應用于篩選可改善造血干細胞缺陷的藥物。本發明的方法操作方便，成本低，實驗結果可靠準確。
【專利說明】斑馬魚造血干細胞缺陷模型的建立及應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于醫藥【技術領域】，更具體地，本發明涉及一種CCCTC結合因子基因功能 缺失斑馬魚在造血缺陷方面的研究模型建立及應用。
【背景技術】
[0002] 斑馬魚作為一個脊椎動物造血模型，既優于其它的動物模型，又與哺乳類造血具 有高度保守性。斑馬魚造血系統的發生分為兩波，原始造血和定向造血。原始造血產生一 過性細胞群，主要是紅細胞和一些髓系細胞，而定向造血產生能自我更新的造血干細胞，這 些細胞生成所有造血系，包括淋巴細胞。在斑馬魚中，原始造血起源于兩個胚外造血位點， 前部側板中胚層和尾部側板中胚層，繼而形成中間細胞團。前部側板中胚層是原始巨噬細 胞的初始位點，中間細胞團是多潛力血液祖細胞產生位點，主要產生紅細胞和一些粒細胞。 24hpf (受精后時間（小時））循環開始后，一過性的紅髓祖細胞在后部血島形成。定向造血 出現于30hpf，這時造血干細胞在背部動脈內壁形成，這是一個類似于哺乳動物大血管-性 腺-中腎的區域。隨后干細胞遷移至尾部造血組織，從那里移于腎臟和胸腺。造血干細胞 是唯一能產生髓紅血小板和淋系的細胞，被認為維持成體造血，在成魚的腎髓中。
[0003] CTCF(CCCTC-binding factor，CCCTC結合因子）是廣泛存在于真核生物的多功能 轉錄因子。其N端11個鋅指結構可以形成不同的組合，使CTCF調控多種靶基因的表達。基 于它的能力是結合大范圍的不同序列，與特異的共調節蛋白通過不同鋅指組合，ctcf起初 被描述為多價因子。這一特異的結構提供了第一個線索，暗示其區別于大部分鋅指在基因 組調節中的功能。一系列的證據表明了 ctcf在不同細胞過程的關鍵作用。Ctcf純合敲除 小鼠展現了早期胚胎著床前致死表型。母源性敲除卵母細胞中ctcf明顯破壞了正常的進 行囊胚階段。目前的研究譜系繪制了基因組范圍的占據，分布譜式在多細胞類型，進一步強 化了概念，即細胞下游的影響是ctcf在基因組調控的結果。使用chip-seq，在人⑶4+T細 胞中發現了 20, 262個ctcf潛在的基因結合位點。然而，其對造血的影響還需要較好的模 型研究予以闡明并應用于醫藥研究。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供斑馬魚造血干細胞缺陷模型的建立及應用。
[0005] 在本發明的第一方面，提供CCCTC結合因子下調劑的用途，用于制備構建斑馬魚 造血干細胞缺陷模型的試劑。
[0006] 在一個優選例中，所述的CCCTC結合因子下調劑是核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所 示的寡核苷酸。
[0007] 在本發明的另一方面，提供一種CCCTC結合因子下調劑，其是核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示的寡核苷酸。
[0008] 在本發明的另一方面，提供一種制備斑馬魚造血干細胞缺陷模型的方法，所述方 法包括：在斑馬魚中下調CCCTC結合因子的表達（包括使之不表達），從而獲得斑馬魚造血 干細胞缺陷模型；較佳地，通過化學誘變、基因定點突變及morpholine敲除下調CCCTC結合 因子的表達。
[0009] 在一個優選例中，所述的制備斑馬魚造血干細胞缺陷模型的方法中，應用所述的 CCCTC結合因子下調劑來制備斑馬魚造血干細胞缺陷模型。
[0010] 在本發明的另一方面，提供一種斑馬魚模型，其中CCCTC結合因子不表達或低表 達；如表達量僅為野生型正常斑馬魚的20%或更低。
[0011] 在本發明的另一方面，提供一種篩選治療造血干細胞缺陷疾病的潛在藥物的方 法，所述方法包括：
[0012] (1)提供斑馬魚CCCTC結合因子突變型（純合體）胚胎；
[0013] ⑵按照受精后時間計算，從受精后5±0. 5小時起，用候選藥物處理⑴的胚胎；
[0014] (3)藥物處理后（較佳地為處理24-48小時后），檢測斑馬魚胚胎中runxl和/或 cmyb的表達和定位；
[0015] 其中，若runxl和/或cmyb表達顯著提高（如提高20% ;更佳地提高40% ;更佳地 提高60%)，則所述的候選藥物是治療造血干細胞缺陷疾病的潛在藥物。
[0016] 在一個優選例中，應用原位雜交技術檢測runxl和/或cmyb的表達和定位。
[0017] 在另一優選兩種，所述的篩選方法中，步驟（2)包括：在測試組中，從受精后 5±0. 5小時起，用候選藥物處理（1)的胚胎；和/或
[0018] 步驟⑶包括：檢測斑馬魚胚胎中runxl和/或cmyb的表達和定位，并與對照組 比較，其中所述的對照組是不用所述候選藥物處理的、同步發育的斑馬魚CCCTC結合因子 突變型（純合體）胚胎；
[0019] 若與對照組相比，測試組runxl和/或cmyb表達顯著提高（如提高20% ;更佳地 提高40% ;更佳地提高60%或更高），則所述的候選藥物是治療造血干細胞缺陷疾病的潛在 藥物。
[0020] 在另一優選例中，所述對照組僅包括候選藥物的溶劑；較佳地，所述的溶劑是 DMSO。
[0021] 在另一優選例中，所述的篩選方法還包括：對獲得的潛在藥物進行進一步的細胞 實驗和/或動物試驗，以從候選藥物中進一步選擇和確定對于治療造血干細胞缺陷疾病有 用的物質。
[0022] 在另一優選例中，所述的篩選方法中，所述的候選藥物包括（但不限于）：小分子 化合物、肽。
[0023] 在本發明的另一方面，提供化合物或其藥學上可接受的鹽在制備治療造血干細胞 缺陷疾病的藥物組合物中的用途，所述化合物選自：
[0024]
【權利要求】
1. CCCTC結合因子下調劑的用途，用于制備構建斑馬魚造血干細胞缺陷模型的試劑。
2. 如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的CCCTC結合因子下調劑是核苷酸序列 如SEQ ID NO: 1所示的寡核苷酸。
3. -種CCCTC結合因子下調劑，其特征在于，其是核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示的寡 核苷酸。
4. 一種制備斑馬魚造血干細胞缺陷模型的方法，其特征在于，所述方法包括：在斑馬 魚中下調CCCTC結合因子的表達，從而獲得斑馬魚造血干細胞缺陷模型；較佳地，通過化學 誘變、基因定點突變及morpholine敲除下調CCCTC結合因子的表達。
5. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，應用權利要求3所述的CCCTC結合因子下調 劑來制備斑馬魚造血干細胞缺陷模型。
6. -種篩選治療造血干細胞缺陷疾病的潛在藥物的方法，其特征在于，所述方法包 括： (1) 提供斑馬魚CCCTC結合因子突變型胚胎； (2) 按照受精后時間計算，從受精后5±0. 5小時起，用候選藥物處理（1)的胚胎； (3) 藥物處理后，檢測斑馬魚胚胎中runxl和/或cmyb的表達和定位； 其中，若runxl和/或cmyb表達顯著提高,則所述的候選藥物是治療造血干細胞缺陷 疾病的潛在藥物。
7. 如權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟（2)包括：在測試組中，從受精后 5±0. 5小時起，用候選藥物處理（1)的胚胎；和/或 步驟（3)包括：檢測斑馬魚胚胎中runxl和/或cmyb的表達和定位，并與對照組比較， 其中所述的對照組是不用所述候選藥物處理的、同步發育的斑馬魚CCCTC結合因子突變型 胚胎； 若與對照組相比，測試組runxl和/或cmyb表達顯著提高，則所述的候選藥物是治療 造血干細胞缺陷疾病的潛在藥物。
8. 如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的方法還包括：對獲得的潛在藥物進行 進一步的細胞實驗和/或動物試驗，以從候選藥物中進一步選擇和確定對于治療造血干細 胞缺陷疾病有用的物質。
9. 如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的候選藥物包括：小分子化合物、肽。
10. 化合物或其藥學上可接受的鹽在制備治療造血干細胞缺陷疾病的藥物組合物中的 用途，所述化合物選自：
【文檔編號】A61P7/06GK104278026SQ201310293787
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年7月12日 優先權日:2013年7月12日
【發明者】周勇, 井長斌, 鄧敏, 陳漪 申請人:中國科學院上海生命科學研究院