表皮細胞的富集應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種表皮細胞的富集應用，屬于生物細胞【技術領域】。包括預處理、消化和噴涂，取表皮，制成若干塊表皮片，將表皮片置于消化容器中，加入消化酶，進行動態消化，得細胞懸液；將消化所得細胞懸液與蛋白凝膠混合，混合均勻后噴涂在創面上。將本發明應用于創面修復，具有培養效率高、操作便捷、皮源利用率高等優點。
【專利說明】表皮細胞的富集應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種表皮細胞的富集及應用，屬于生物細胞【技術領域】。
【背景技術】
[0002]我國燒傷的發病率為總人口的2~10%。，每年發生燒傷者近千萬人，需住院治療的達數十萬之多，而且，嚴重燒傷者死亡率很高。燒傷治愈后常遺留大量疤痕，對患者的外貌、體形以及功能、心理方面都會造成負面影響。其中，大面積燒傷造成嚴重的皮膚缺失，是導致患者死亡的一個重要因素，皮源的解決問題的關鍵。
[0003]為了克服皮源的問題，通常是采用盡早關閉燒傷創面的方法，燒傷創面的早期關閉不僅可以挽救患者生命，也是減輕疤痕的重要手段，現有的技術中主要是通過微粒皮技術、培養表皮細胞以及Recell技術來實現的。
[0004](I)微粒皮技術需先從患者身下未燒傷部位取下健康的皮源，再將這有限的自體皮源使用物理方法進行分散成盡量小的微粒，然后回植到病人的創面上，這種技術可將皮片擴大10~20倍，但該方法采用物理方法將皮片粉碎，然后回植到創面上，移植的皮粒貼附率不高，因此，效果難以保證；
[0005](2)培養表皮細胞的方法需等待的時間較長，且遠期療效不佳；
[0006](3) Recell 技術是在靜態下通過胰酶將基底層表皮細胞進行消化，然后利用噴霧法將混懸在林格氏液中的液態表皮細胞噴灑在創面，使用該技術可將皮片擴大40~60倍，但缺陷在于，該方法需要消耗大量的高濃度消化酶，處理過程中會采用刮擦等物理方式取樣，而刮擦等物理方法會因操作者的技術熟練程度有所不同，細胞會有一定的損害，通過Recell獲取的細胞活力僅在70%左右，因此，表皮干細胞的實際獲取量難以確認，同時，由于細胞是呈液態噴霧在受損皮膚表面，細胞發生流動，很難保證細胞在創傷面的均勻分布，由此燒傷創面的愈合也無法保證，需要多次噴霧才能最終實現燒傷創面的恢復，延長了治療流程，且所用的整個噴霧套件目前仍以進口設備為主，單臺的價格在1-2萬之間，治療成本相應的也大大提聞。
[0007]有鑒于此，本發明人對怎么樣充分利用有限皮源的問題進行深入研究，開發出一種表皮細胞的富集及應用，本案由此產生。
【發明內容】
[0008]為了克服現有技術中存在的上述問題，本發明提供一種培養效率高、操作便捷、皮源利用率高的表皮細胞的富集及應用。
[0009]為實現上述目的，本發明采取的技術方案如下:
[0010]表皮細胞的富集及應用，包括預處理、消化和噴涂，具體步驟為，
[0011](I)預處理:取表皮，制成若干塊表皮片；
[0012](2)消化:取步驟(1)所得表皮片置于消化容器中，加入消化酶，進行動態消化，得細胞懸液；[0013](3)噴涂:將消化所得細胞懸液與蛋白凝膠混合，混合均勻后，噴涂在創面上。
[0014]為實現更好的使用效果，上述技術方案的進一步設置如下:
[0015]步驟(1)中，所取的表皮為斷層皮片，每塊樣表皮的粒徑在l_5mm。
[0016]步驟(2)中，每l-2cm2斷層皮片添加4_6ml的消化酶，所述的消化酶中主要作用成分為胰酶和EDTA，其中，胰酶在消化酶中的質量濃度為0.25-0.5%，EDTA在消化酶中的質量濃度為0.01-0.05% ;動態消化是在恒溫條件下進行的，由交替進行的靜置和動態兩種狀態組成，即先靜置5-7分鐘(也可稱為靜態消化)，然后進入動態，動態保持3-7分鐘后，再靜置5-7分鐘后，進入動態，溫度控制在35-380C，優選為36.8-37.5°C，靜置-動態-靜置-動態構成一個循環，每個動態消化過程包含2-5次該循環，動態消化完成后進行細胞沖刷。較優的，斷層皮片的厚度為0.3-0.6mm的中厚皮片；動態時確保消化容器內物質的轉速為60-300rpm，優選轉速為180-300rpm，細胞沖刷采用的試劑為PBS、標準生理鹽水或格林氏液中的任一種，以細胞完全沖出消化容器為止。
[0017]在步驟(3)之前，采用目數為20-60條件下進行過濾，去除表皮殘渣，而下層的細胞液用于配液。較優的，下層細胞液中添加抑制劑形成細胞懸液，抑制劑優選為自體血清或大豆胰蛋白酶，每5-15ml下層細胞液中自體血清的添加1-3滴(每15滴為1ml)，大豆胰蛋白酶添加量為下層細胞液量的0.8-3倍。
[0018]步驟(3)中，蛋白凝膠優選為纖維蛋白膠，混合過程為:蛋白凝膠優選為纖維蛋白膠，混合過程為:分別將細胞懸液與促凝劑、纖維蛋白膠混合。較優的，促凝劑和纖維蛋白膠先進行預混合，再將細胞懸液和促凝劑/纖維蛋白膠灌入雙筒注射器的不同筒中，在同樣壓力作用下，細胞懸液和促凝劑/纖維蛋白膠同時擠出，均勻混合在燒傷創面上，每5-10ml纖維蛋白膠中加入1-3滴(每15 滴為Iml)促凝劑，纖維蛋白膠與促凝劑的總量和細胞懸液
雄且寺里。
[0019]為使燒傷創面可以更好地愈合，在步驟(3)的噴涂后包扎敷料，敷料選用保濕類敷料中的膠原膜片。
[0020]上述技術方案中，所述的預處理和消化是在表皮動態消化儀或生物培養用搖床上進行的，表皮細胞動態消化儀包括底座，以及設置在底座上的控制面板、消化容器、過濾容器、混合容器、控制單元、加熱器、振動器、傳感器和電源，其中，控制面板包括顯示屏和按鍵，振動器安裝在消化容器的底部，使消化容器產生一定頻率的振動；加熱器安裝在消化容器的外表面上，用于加熱消化容器內的液體，溫度傳感器安裝在消化容器上，用于監測消化容器的加熱溫度，上述加熱器、振動器分別與控制單元的輸出端相連，控制面板和傳感器器分別與控制單元的輸入端相連，電源分別為控制面板、控制單元、加熱器和振動器供電。
[0021]由于表皮細胞中除表皮干細胞外，其他細胞同樣具有增殖的功能，有助于創面愈合，因此，本發明的上述方案中，將全部的斷層皮片作為表皮細胞來源；整個動態消化過程是在35-38°C恒溫條件下，采用生物搖床(實驗過程中可選用常規的生物實驗室培養用搖床，如型號為HS-100C的)、振動器(振動器作用與生物實驗室培養用藥創相同，結構不同，因而轉速也存在差異，通常需要轉換)等方式提供動態條件，一方面可獲得更大、更多的細胞量，同時，消化酶的使用濃度和使用量也可以大大降低，消化過程在十幾分鐘內即可完成，與常規的過夜消化方式相比，縮短了消化時間，更有利于細胞活性的保持，減少細胞損耗，采用本發明中的動態消化技術獲得表皮細胞是一種可靠的方法，配液所得的已經分化的表皮細胞噴涂在創面上，表皮細胞在創面通過逆分化形成表皮干細胞，促進傷口愈合，皮源得到充分合理的利用，擴增倍數達到100-120倍。
[0022]其中，斷層皮片的定義是指皮膚的皮下組織以上的皮膚部分，包括刃厚皮片(厚度在0.3mm左右)和中厚皮片(厚度在0.3-0.6mm左右)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖1為本發明實施例2中所用表皮細胞富集儀的俯視結構示意圖；
[0024]圖2為本發明實施例2中所用表皮細胞富集儀的立體結構示意圖；
[0025]圖3為采用本發明所得細胞應用于裸鼠背部創面后第2周的染色結果對照(100倍顯微鏡下);
[0026]圖4為采用本發明所得細胞應用于裸鼠背部創面后第3周的染色結果對照(100倍顯微鏡下);
[0027]圖5為采用本發明所得細胞應用于裸鼠背部創面后第4周的染色結果對照(100倍顯微鏡下);
[0028]圖6為顯微鏡下靜態消化獲得的活的表皮細胞得到富集(100倍相差顯微鏡下)；
[0029]圖7為顯微鏡下動態消化獲得的成纖維細胞得到富集(100倍相差顯微鏡下)。
[0030]圖中標號:底座I ;底座上表面11 ;底座下表面12 ;操作臺13 ;控制面板2 ;顯不屏21 ;按鍵22 ;消化容器 3 ;過濾容器4 ;導流管41 ;混合容器5 ;控制單元6 ;加熱器7 ;振動器
8;傳感器9 ;電源10。
【具體實施方式】
[0031]實施例1
[0032]本實施例中，表皮細胞的富集應用，包括預處理、消化和配置原液，具體步驟為，
[0033](I)預處理:取2cm2的斷層皮片，其中，斷層皮層為斷層厚度為0.3mm的中厚表皮，將斷層皮片制成直徑為2-3mm大小的表皮片；
[0034](2)消化:預處理斷層皮片的同時，通過控制面板啟動表皮細胞富集儀，將表皮細胞富集儀預熱5-10分鐘，維持溫度在36.8-37.5°C，將步驟(1)所得表皮片置于消化容器中，加入5ml的消化酶，其中，消化酶中起催化作用的主要成分為胰酶和EDTA，消化酶中胰酶的含量為0.25% (質量百分數)，EDTA的含量為0.01% (質量百分數)，靜置7分鐘后，通過控制面板調整消化容器內的表皮片的轉速(其轉速的實現可通過生物實驗室培養用搖床實現，也可米用圖6_),動態開始,動態處理3分鐘后再靜置7分鐘，靜置-動態_靜置_動態形成一個循環，恒溫下循環3次后，采用PBS沖刷細胞，沖刷時長為10-30S，將細胞完全沖刷出消化容器后，終止沖刷，將得到的溶液轉移到目數為40目的過濾容器中(本實施例中過濾容器的過濾部件選用尼龍篩網，也可選擇同等目數的濾網或起到同樣作用的過濾裝置)進行過濾，去除表皮殘渣后，在過濾所得下層細胞液內添加1-2滴自體血清或15ml大豆蛋白酶抑制劑，得細胞懸液；
[0035](3)噴涂:將消化所得細胞懸液與纖維蛋白膠混合，即:先將促凝劑和纖維蛋白膠進行預混合，促凝劑的添加量為3-4滴，再將細胞懸液和促凝劑/纖維蛋白膠灌入雙筒注射器的不同筒中，在同樣壓力作用下，細胞懸液和促凝劑/纖維蛋白膠同時擠出，混合均勻并涂覆在燒傷創面上，并在創面表面形成0.5-lmm厚的膜狀薄層即可；
[0036](4)包覆:在涂有膜狀薄層的創面上包覆一層膠原膜片保濕敷料，可以避免外力對創面恢復造成影響，同時為細胞繁殖創造有利條件，進一步促進創面恢復。
[0037]實施例2 [0038]本實施例與實施例1的設置和工作原理相同，區別在于:本實施例是在專用設備表皮細胞動態消化儀上進行的，結合圖6和圖7，包括底座1，以及設置在底座I上的控制面板2、消化容器3、過濾容器4、混合容器5、控制單元6、加熱器7、振動器8、傳感器9和電源10等，其中，控制面板2包括顯示屏21和按鍵22，在本實施例中，上述顯示屏21采用數碼管顯示，主要用于顯示溫度、振動頻率、循環時間等參數，按鍵22包括電源啟動按鍵和振動開啟按鍵；振動器8安裝在消化容器3的底部，使消化容器3產生一定頻率的振動，在本實施例中，所述振動器8采用振動電機，振動電機的轉速范圍為1100-2500rpm，與實施例1中生物實驗室培養用搖床的功能相同，均為使消化容器3內的溶液產生一定頻率的震動或晃動；加熱器7安裝在消化容器3的外表面上，用于加熱消化容器3，使消化容器3內的溶液保持在36.8-37.5°C之間；傳感器9安裝在消化容器3側壁的通孔上，溫度傳感器的探頭伸入溶液內，實時監測消化容器3的加熱溫度，溫度傳感器9可以采用多種型號的溫度傳感器，目的在于能精確感應到消化容器3內溶液的溫度；加熱器7、振動器8分別與控制單元6的輸出端相連，控制面板2和傳感器器9分別與控制單元6的輸入端相連，電源10分別為控制面板2、控制單元6、加熱器7和振動器8供電，在本實施例中，上述控制單元6采用微處理器，可以選擇多個型號的微處理器，只要能實現上述控制功能就行；過濾容器4的上端設有過濾網；消化容器3、過濾容器5和混合容器6的入口部以及控制面板2分別安裝在底座I的上表面11上，底座I上表面11上進一步設有一操作臺13，用于表皮消化前，剪切等預處理；控制單元6、電源10和振動器8分別安裝在底座I的下表面12上，振動器8的頂部與消化容器3的底部相接觸。
[0039]采用本實施例上述裝置進行表皮細胞的動態富集，操作步驟如下:
[0040](I)預處理:取表皮，在表皮細胞富集儀的操作臺13上制成若干塊粒徑在l_5mm表皮片；
[0041](2)消化:啟動表皮細胞富集儀電源10，取步驟(1)所得表皮片置于消化容器3中，加入消化酶，通過控制單元6控制振動器8和加熱器7，進行動態消化，動態消化結束后，將細胞沖出消化容器，得細胞溶液，將細胞溶液轉入過濾容器4進行過濾，去除表皮殘渣，下層細胞液用于配液；
[0042](3)噴涂:將過濾所得下層細胞液轉入混合容器，與蛋白凝膠混合，混合均勻完成配液，在本實施例中，下層細胞液中添加抑制劑形成細胞懸液，抑制劑為自體血清，蛋白凝膠為纖維蛋白膠，具體的混合過程為:促凝劑和纖維蛋白膠先進行預混合，再將細胞懸液和促凝劑/纖維蛋白膠灌入雙筒注射器的不同筒中，在同樣壓力作用下，細胞懸液和促凝劑/纖維蛋白膠同時擠出，混合均勻并涂覆在燒傷創面上，并在創面表面形成0.5-1_厚的膜狀薄層即可；
[0043](4)包覆:在涂有膜狀薄層的創面上包覆一層膠原膜片保濕敷料，可以避免外力對創面恢復造成影響，同時為細胞繁殖創造有利條件，進一步促進創面恢復。
[0044]其中涉及到的消化酶以及消化酶添加量、促凝劑、抑制劑、蛋白凝膠等參數的設置可參考實施例1中對應的參數，本實施例振動器的作用與實施例1中生物實驗室培養用搖床作用相同，都是使消化容器3內的溶液產生一定頻率的震動或晃動，但裝置結構和原理與實施例1中生物實驗室培養用搖床不同，故本實施例中振動電機的轉速范圍為1100-2500rpm，具體操作中，根據表皮所選種類不同，以及處理量的差別，振動電機的轉速可選擇為1100、1500、1800、2300和2500等不同檔位，過濾容器可選用目數為20、40、50或60，以適應處理效果和處理目的的需求。
[0045]對上述實施例的實施效果進行整體分析。
[0046]其中，表1為實施例1中不同消化方式時的總表皮細胞獲取量，表2為上述實施例所得不同表皮細胞遞呈組間創面愈合時間的比較。
[0047]表1不同消化方式的總表皮細胞獲取量(P〈0.01)
[0048]
【權利要求】
1.表皮細胞的富集應用，其特征在于，包括預處理、消化和噴涂，具體步驟為， (O預處理:取表皮，制成若干塊表皮片； (2)消化:取步驟(1)所得表皮片置于消化容器中，加入消化酶，進行動態消化，得細胞懸液； (3)噴涂:將消化所得細胞懸液、蛋白凝膠混合，混合均勻后，噴涂在創面上； (4)包覆:步驟(3)的噴涂后包扎敷料，敷料選用保濕類敷料中的膠原膜片，使燒傷創面可以更好地愈合。
2.如權利要求1所述的表皮細胞的富集應用，其特征在于:步驟(1)中，所取的表皮為斷層皮片，每塊樣表皮的粒徑在l_5mm。
3.如權利要求2所述的表皮細胞的富集及應用，其特征在于:所述的斷層皮片的厚度為0.3-0.6mm的中厚皮片。
4.如權利要求1所述的表皮細胞的富集應用，其特征在于:步驟(2)中，每1-2cm2斷層皮片添加4-6ml的消化酶，所述的消化酶中包括胰酶和EDTA，其中，胰酶在消化酶中的質量濃度為0.25-0.5%，EDTA在消化酶中的質量濃度為0.01-0.05% ;動態消化在恒溫條件下進行，由交替進行的靜置和動態兩種狀態組成，動態消化完成后進行細胞沖刷，獲得細胞懸液。
5.如權利要求4所述的表皮細胞的富集應用，其特征在于:交替進行的每對靜置、動態構成一個循環，動態消化時，先靜置5-7分鐘，再進入動態，動態保持3-7分鐘后，每個動態消化包括2-5個循環，溫度恒定控制在35-38°C。
6.如權利要求4所述的表皮細胞的富集應用，其特征在于:所述的動態時確保消化容器內物質的轉速為60-300rpm ;細胞沖刷采用的試劑為PBS、標準生理鹽水或格林氏液中的任一種，以細胞完全沖出消化容器為止。
7.如權利要求1所述的表皮細胞的富集應用，其特征在于:步驟(3)與步驟(2)之間，至少還需進行一次過濾，過濾的目數為20-60，去除表皮殘渣，而下層細胞液中添加抑制劑，形成細胞懸液。
8.如權利要求7所述的表皮細胞的富集應用，其特征在于:步驟(3)中，所述的下層細胞液中添加的抑制劑為自體血清或大豆胰蛋白酶，每5-15ml下層細胞液中自體血清的添加1-3滴，大豆胰蛋白酶的添加量為下層細胞液的0.8-3倍。
9.如權利要求1或8所述的表皮細胞的富集應用，其特征在于，步驟(3)中，蛋白凝膠為纖維蛋白膠，細胞懸液與蛋白凝膠的混合過程為:分別將細胞懸液與促凝劑、纖維蛋白膠混合，所述的促凝劑和纖維蛋白膠先進行預混合，每5-10ml纖維蛋白膠中添加促凝劑1-3滴，再將細胞懸液和促凝劑/纖維蛋白膠灌入雙筒注射器的不同筒中，在同樣壓力作用下，細胞懸液和促凝劑/纖維蛋白膠同時擠出，纖維蛋白膠與促凝劑的總量和細胞懸液等量，混合均勻噴涂在創面上。
10.如權利要求1所述的表皮細胞的富集應用，其特征在于:所述的預處理和消化是在表皮動態消化儀或生物培養用搖床上進行的，表皮細胞動態消化儀包括底座，以及設置在底座上的控制面板、消化容器、過濾容器、混合容器、控制單元、加熱器、振動器、傳感器和電源，其中，控制面板包括顯示屏和按鍵，振動器安裝在消化容器的底部，使消化容器產生一定頻率的振動；加熱器安裝在消化容器的外表面上，用于加熱消化容器內的液體，溫度傳感器安裝在消化容器上，用于監測消化容器的加熱溫度，上述加熱器、振動器分別與控制單元的輸出端相連，控制面板和傳感器器分別與控制單元的輸入端相連，電源分別為控制面板、控制單元、加熱器和振動器供電。
【文檔編號】A61K35/36GK103623001SQ201310611230
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月27日 優先權日:2013年11月27日
【發明者】韓春茂, 胡信雷, 魯建國, 韓陽 申請人:紹興振德醫用敷料有限公司