一種降糖肽及其藥物用途
【專利摘要】本發明提供了一種降糖肽，具有如SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列。本發明還提供了所述降糖肽的修飾肽，在降糖肽的N端、C端或中間殘基上連接化學基團、氨基酸、多肽、蛋白質或PEG。本發明所述降糖肽能改善KK-Ay小鼠的糖耐量并且增強KK-Ay小鼠的血糖利用能力，顯著地改善KK-Ay小鼠的空腹血糖和糖耐量，顯著地降低血清總膽固醇和血清總甘油三酯，顯著地改善SOD水平并降低MDA水平，保護機體細胞對抗氧自由基的氧化，具有降糖和降脂功能，可以抗代謝綜合癥。可用于制備治療和/或預防糖尿病或高血脂癥的藥物或保健品。
【專利說明】一種降糖肽及其藥物用途
【技術領域】
[0001]本發明屬于醫藥領域，具體涉及一種降糖肽及其藥物用途。
【背景技術】
[0002]糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是以胰島素相對或絕對不足為特征、高糖血癥的主要癥狀的代謝性疾病，胰島素相對或絕對不足引發高血糖，進而導致三大營養物質代謝紊亂，最終影響患者正常生理功能并且引起并發癥。糖尿病有多種分型，以I型糖尿病和II型糖尿病最常見。傳統抗糖尿病藥物各有缺點。胰島素給藥不便，而且容易引發低血糖；磺酰脲類、瑞格列奈和納格列奈等胰島素促分泌劑可以口服，但是依賴殘余胰島3細胞的存在，而且容易引發低血糖，此外還常會出現繼發性失效；二甲雙胍類不良反應嚴重；a-葡萄糖苷酶抑制劑和噻唑烷二酮類藥物不能從根本上降低血糖。而最新上市的胰高血糖素樣肽-1 (glucose-like peptide-1,GLP-1)類似物對傳統降糖藥療效不佳的II型糖尿病效果優異，但是性質不穩定、保存要求高、作用時間短、需要注射給藥。肽類是生物藥物中的一大類別，藥用肽類具有明顯優點。首先，肽類均直接或間接來自自然界，符合從天然產物篩選新藥的潮流。其次，肽類的特異性遠強于小分子，抗原性遠低于蛋白質，摒棄了小分子和蛋白質藥物的缺點。第三，肽分子，尤其是寡肽分子，往往能規避胃腸道消化，克服蛋白質分子被消化酶破壞從而不能口服的弊端。最后，肽分子可能既不在肝臟代謝又不在脂肪組織累積，避免了肝臟毒性和累積毒性。因此開發具有降糖作用的肽類藥物成為各國醫藥研發人員的研究熱點。
【發明內容】
[0003]本發明針對現有降糖藥物的不足，采用人工合成的方法篩選得到一種全新降糖肽。
[0004]本發明具體技術方案如下:
一種降糖妝，具有如SEQ ID NO:1所不的氣基酸序列。
[0005]SEQ ID NO:IPro Pro Pro Gly Pro。
[0006]可采用現有【技術領域】常規方法對降糖肽進行修飾。
[0007]對于蛋白質和肽類藥物，在多數情況下，機體內的氨肽酶及羧肽酶很容易從常見的直鏈肽的兩端進行逐步的切割分解，使直鏈肽被降解。多肽修飾是改變肽鏈主鏈結構和側鏈基團的重要手段，已有大量文獻表明經過修飾后的多肽藥物可以顯著降低免疫原性、減少毒副作用、增加水溶性、延長體內作用時間、改變其生物分布狀況等等，明顯改善藥物的療效。
[0008] 多肽類藥物常用修飾方法包括主鏈末端的修飾、中間殘基的修飾、環化、氨基酸替換、糖基化修飾及PEG修飾等。
[0009]多肽類藥物常用的主鏈末端修飾方法是N端的乙酰化作用和C端的酰胺化作用，分別對肽鏈兩端氨基和羧基進行保護，使多肽不會很快地被相應的多肽蛋白酶降解。目前這一技術已經廣泛應用于多肽的化學合成中。N端乙酰化通常是在固相合成多肽反應的整個肽鏈組合完畢后，加入乙酸酐使其乙酰化。C端的酰胺化則是通過選擇裂解產物為酰胺的樹脂或者選擇不同裂解方式來完成。主鏈末端連接不同長度的脂肪酸、主鏈C端或N端的PEG修飾及糖基化修飾，其基本原理都是增加多肽分子的相對分子量和空間位阻，提高其對多肽水解酶的穩定性，減少腎小球的濾過作用。替換肽鏈中的某幾個氨基酸是另一種推遲酶降解使多肽藥物的半衰期延長的方式，替換對象通常為肽鏈中的易酶解的氨基酸。此外，將L型氨基酸替換為D型非天然氨基酸也是氨基酸替換的一種常規方法。
[0010]本發明提供了一種降糖肽的修飾肽，其特征在于對降糖肽進行修飾，在降糖肽的N端、C端或中間殘基上連接化學基團、氨基酸、多肽、蛋白質或PEG。
[0011]本發明所述降糖肽的修飾肽具體優選為:
對降糖肽的N端進行甲酰化或乙酰化，或者在N端連接脂肪酸、肼基煙酰胺、二乙烯三胺五乙酸、肉豆蘧酸、十六酸或琥珀酰胺或PEG ；
或者對降糖肽C端進行酰胺化、或在C端連有P-硝基苯胺、7-氨基-4-甲基香豆素；或者對降糖肽中間殘基進行糖基化、磷酸化、甲基化、乙酰化、硝基化、磺酸化或者連接PEG修飾或者降糖肽中間殘基偶聯蛋白質，其中:糖基化修飾最常用的為N-糖基化和0-糖基化。
[0012]甲基化修飾肽包括側鏈甲基化修飾肽和N端甲基化修飾肽。
[0013]N端甲基化優選在降糖肽氨基酸序列中的一個或多個氨基酸的N端甲基化。
[0014]PEG修飾優選PEG分子量為2000-10000。
[0015]本發明還提供了一種降糖肽的修飾肽，通過降糖肽的N端和C端首尾連接成環。
[0016]本發明還提供了一種降糖肽的修飾肽，降糖肽或上述修飾肽氨基酸序列中的一種或多種氨基酸替換成相應的氨基酸衍生物或特殊氨基酸。
[0017]本發明還提供了一種降糖肽的修飾肽，降糖肽或上述修飾肽氨基酸序列中的一種或多種氨基酸替換成相應的D型氨基酸。
[0018]本發明所述的降糖肽，國內外尚無相關報道。作為一種寡肽，完全不同于已經上市的三大抗糖尿病肽類藥物——普蘭林肽、艾塞那肽和利拉魯肽。降糖肽分子短小，可口服給藥，規避消化。本發明選用自發型II型糖尿病及代謝紊亂小鼠模型KK-Ay小鼠研究降糖肽連續給藥對KK-Ay小鼠的影響，觀察降糖肽對KK-Ay小鼠的體重、空腹血糖、血脂、葡萄糖耐量、肝超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, S0D)和肝丙二醒(malonaldehyde,MDA)的影響。
[0019]KK-Ay小鼠是在一種糖尿病模型小鼠——KK小鼠的基礎上轉入突變毛色基因(ay)而成，呈黃色。該基因不僅影響小鼠的毛色而且可引起代謝紊亂，出現肥胖、高血糖、月旨質代謝紊亂和高胰島素血癥等代謝異常綜合征，其發病是在遺傳易感的基礎上加環境因素而誘發。與人類II型糖尿病表現極為相似，該動物對胰島素不敏感，對葡萄糖耐量小，糖尿病發病率高，并會出現肥胖、高血糖、脂質代謝紊亂和高胰島素血癥等代謝異常綜合征，其發病是在遺傳易感的基礎上加環境因素而誘發。與人類T2DM表現極為相似。
[0020]口服葡萄糖耐量試驗(Oral glucose tolerance test, 0GTT)是糖尿病實驗室檢查和糖尿病診斷的重要標準，可以根據OGTT的結果計算相應的血糖曲線下面積(AUC)值。血糖AUC值越低，說明實驗動物對血糖的利用程度越高。本發明對KK-Ay小鼠進行了 0GTT，結果提示本發明所述降糖肽能部分地改善KK-Ay小鼠的糖耐量并且部分地增強KK-Ay小鼠的血糖利用能力。降糖肽能顯著地改善KK-Ay小鼠的空腹血糖和糖耐量，顯著地降低血清總膽固醇和血清總甘油三酯,顯著地改善SOD水平并降低MDA水平，保護機體細胞對抗氧自由基的氧化，說明降糖肽具有降糖和降脂功能，可以抗代謝綜合癥。
[0021]本發明所述的降糖肽作為一種結構清楚的寡肽藥物，其氨基酸序列決定了它不僅可以規避胃腸道消化，而且易于穿過生物膜，從而有助于胃腸道吸收，有助于開展較為充分的藥效學研究，有利于開發成口服藥物。
[0022]本發明提供了上述降糖肽在制備治療和/或預防糖尿病或高血脂癥藥物或保健品中的應用。特別是在在制備治療和/或預防II型糖尿病或高血脂癥藥物或保健品中的應用。
[0023]本發明提供了上述降糖肽的修飾肽在制備治療和/或預防糖尿病或高血脂癥藥物或保健品中的應用。特別是在在制備治療和/或預防II型糖尿病或高血脂癥藥物或保健品中的應用。
[0024]本發明所述的藥物，可以包含降糖肽或降糖肽的修飾肽以及一種或多種可藥用的稀釋劑或載體。
[0025]本發明所述式降糖肽或降糖肽的修飾肽可以以單一藥物的形式被給藥或可以與其它藥物聯合給藥。
[0026]本發明的降糖肽或降糖肽的修飾肽可以成鹽，包括與各種無機或有機酸鹽如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、馬來酸鹽、延胡索酸鹽、扁桃酸鹽和草酸鹽；各種無機或有機堿鹽如氫氧化鈉、三羥甲基氨基甲烷和N-甲基-葡萄糖胺成鹽。
[0027]本發明的降糖肽或降糖肽的修飾肽可以單獨使用或以藥物組合物的形式使用。藥物組合物包括作為活性成分的本發明的降糖肽或降糖肽的修飾肽或其可藥用鹽及可藥用載體。較佳的，本發明的藥物組合物有0.1-99.9%重量百分比的作為活性成分的降糖肽或降糖肽的修飾肽或其可藥用鹽。“可藥用載體”不會破壞本發明的化合物或其可藥用鹽的藥學活性，同時其有效用量，即能夠其藥物載體作用是的用量對人體無毒。
[0028]“可藥用載體”包括但不限于:離子交換材料、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、自乳化藥物傳遞系統(SEDDS^n d-維生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯、吐溫或其他類似聚合介質等藥物制劑用的表面活性劑、血清蛋白如人血清白蛋白、緩沖物質如磷酸鹽、氨基乙酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸部分甘油酯混合、水、鹽、電解質如硫酸鹽精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、硅膠、硅酸鎂等。聚乙烯吡咯酮、纖維素物質、聚乙烯醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、乙烯-聚氧乙烯-嵌段聚合物和羊毛脂、環糊精如a-、0_、Y-環糊精或其經化學修飾的衍生物如2-和3-羥丙基-3 -環糊精等羥烷基環糊精或其他可溶性衍生物等均可用于促進本發明的化合物、其藥用鹽或前藥的藥物傳遞。
[0029]其他可藥用輔料如填充劑(如無水乳糖、淀粉、乳糖珠粒和葡萄糖)、粘合劑(如微晶纖維素)、崩解劑(如交聯羧甲基淀粉鈉、交聯羧甲基纖維素鈉、低取代羥丙基纖維素和交聯PVP)、潤滑劑(如硬脂酸鎂)、吸收促進劑、香味劑、甜味劑、稀釋劑、賦形劑、潤濕劑、溶劑、增溶劑和著色劑等也可加入本發明的藥物組合物中。
[0030]上述本發明的降糖肽或降糖肽的修飾肽或其可藥用鹽以及藥物組合物可通過腸道或者非腸道途徑給藥。非腸道給藥制劑包括注射劑、霜劑、軟膏劑、貼劑、噴霧劑等。給藥途徑包括皮下、皮內、動脈內、靜脈內、肌內、關節內、滑液內、胸骨內、鞘內、病灶內、顱內注射或輸注，或者，口服、局部、直腸、經鼻、經頰、陰道、舌下、皮內、粘膜、氣管、尿道給藥，或者通過吸入氣霧或植入蓄積或者針刺方式給藥。
[0031]上述本發明的降糖肽或降糖肽的修飾肽或其可藥用鹽以及藥物組合物的治療有效量為0.001-100mg/kg/d之間,可用于相關疾病的單一用藥或聯合用藥治療,為本領域技術人員能夠理解的范圍。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0032]圖1為降糖肽HPLC色譜圖。
[0033]圖2為降糖肽HPLC色譜圖。
[0034]圖3為降糖肽對KK-Ay小鼠體重的影響。
[0035]圖4為降糖肽對KK-Ay小鼠空腹血糖的影響。
[0036]圖5為降糖肽對KK-Ay小鼠口服葡萄糖耐量試驗。
[0037]圖6為降糖肽對KK-Ay小鼠血脂的影響。
[0038]圖7為降糖肽對KK-Ay小鼠肝SOD的影響。
[0039]圖8為降糖肽對KK-Ay鼠肝MDA含量的影響。
【具體實施方式】
[0040]以下通過實施例說明本發明的具體步驟，但不受實施例限制。
[0041]在本發明中所使用的術語，除非另有說明，一般具有本領域普通技術人員通常理解的含義。
[0042]下面結合具體實施例并參照數據進一步詳細描述本發明。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的范圍。
[0043]實驗動物
KK-Ay II型糖尿病模型小鼠(以下簡稱KK-Ay小鼠)，清潔級，雌雄各半，體重為40~45g，購于北京市華阜康公司，合格證號SCXK (京)2009— 0004。
[0044]ICR小鼠，清潔級，雌雄各半，體重為20~24g，購于南京市江寧區青龍山實驗動物中心,合格證號SCXK (蘇)2007— 0001。
[0045]飼養條件為空調房間，溫度18~24°C，相對溫度70%。
[0046]實驗材料
羅格列酮片，成都恒瑞制藥有限公司，批號111001，臨用前用生理鹽水稀釋至所需濃度。
[0047]試劑 氯化鈉:南京化學試劑有限公司，AR。生理鹽水:用以上氯化鈉自行配制。游離脂肪酸測定試劑盒:南京建成生物工程研究所。甘油三酯測定試劑盒:南京建成生物工程研究所。總膽固醇測定試劑盒:南京建成生物工程研究所。總超氧化物歧化酶測定試劑盒:南京建成生物工程研究所。丙二醛測定試劑盒:南京建成生物工程研究所。碳酸鈉:南京化學試劑有限公司，AR。氫氧化鈉:南京化學試劑有限公司，AR。五水硫酸銅:南京化學試劑有限公司，AR。酒石酸鉀:南京化學試劑有限公司，AR。Lowry試劑甲:用以上碳酸鈉、氫氧化鈉、五水硫酸銅、酒石酸鉀自行配制。Lowry試劑乙:美國Sigma公司，批號063K3618。牛血清白蛋白V:瑞士 Roche公司。冰醋酸:南京化學試劑有限公司，AR。其他試劑均為分析純。
[0048]儀器與設備
Costar359996孔板:美國Corning公司。1500型酶標儀，美國Thermo Electron公司。OT-1型血糖儀及試條:北京怡成生物電子技術有限公司。KflOOOl型電子天平:浙江凱豐集團有限公司。硬膜外麻醉針及其針套:南京建成生物工程研究所。722光柵分光光度計:上海精密科學儀器有限公司。752紫外光柵分光光度計:上海第三分析儀器廠。TGL-16G臺式高速離心機:上海醫用分析儀器廠。JA12002型上皿電子天平:上海天平儀器廠。WH-1微型旋渦混合器:上海滬西分析儀器廠。W-201B數顯恒溫水浴鍋:上海申騰生物技術有限公司。
[0049]實施例1降糖肽的合成
由吉爾生化(上海)有限公司多肽固相合成法用多肽合成儀合成本發明所述降糖肽。多妝合成起始于H-Pro-2-Chlorotrityl chloride Resin,利用HOBt/DCC作為活化劑,依次接上 Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH.每個氨基酸反應上去后，經DMF充分清洗,piperidine脫Fmnoc保護,DMF再次充分清洗后再接下一個氨基酸。全部合成結束后，利用TFA:H20:EDT=95:2.5:2.5 (v/v)把降糖肽從樹脂上切割下來，冰乙醚沉淀后清洗干凈，利用C18柱進行RP-HPLC純化。色譜條件:Xbrige BEH130C18 (4.6 X 250mm,5iim)，試劑A:0.1%三氟乙酸的乙腈溶液；試劑B:0.1%三氟乙酸的水溶液。流速1.0ml/min,檢測波長220nm。洗脫梯度:
【權利要求】
1.一種降糖妝，具有如SEQ ID NO:1所不的氣基酸序列。
2.一種如權利要求1所述的降糖肽的修飾肽，其特征在于對降糖肽進行修飾，在降糖肽的N端、C端或中間殘基上連接化學基團、氨基酸、多肽、蛋白質或PEG。
3.如權利要求2所述的修飾肽，其特征在于對降糖肽的修飾包括: 對降糖肽的N端進行甲酰化或乙酰化，或者在N端連接脂肪酸、肼基煙酰胺、二乙烯三胺五乙酸、肉豆蘧酸、十六酸或琥珀酰胺或PEG ； 或者對降糖肽C端進行酰胺化、或在C端連有P-硝基苯胺或7-氨基-4-甲基香豆素； 或者對降糖肽中間殘基進行糖基化、磷酸化、甲基化、乙酰化、硝基化、磺酸化或者連接PEG修飾或者降糖肽中間殘基偶聯蛋白質。
4.一種如權利要求1所述的降糖肽的修飾肽，其特征在于所述降糖肽的N端和C端首尾連接成環。
5.一種如權利要求1所述的降糖肽的修飾肽，其特征在于將所述降糖肽序列中的一種或多種氨基酸替換成相應的氨基酸衍生物或特殊氨基酸。
6.如權利要求1所述的降糖肽的修飾肽，其特征在于所述構成多肽序列中的一種或多種氨基酸為D型氨基酸。
7.如權利要求1所述降糖肽在制備治療和/或預防糖尿病或高血脂癥藥物或保健品中的應用。
8.如權利要求7所述的應用，其特征在于所述的藥物中含如權利要求1所述的降糖肽以及藥學上可以接受的載體。
9.如權利要求2-6所述降糖肽的修飾肽在制備治療和/或預防糖尿病或高血脂癥藥物或保健品中的應用。
10.如權利要求9所述的應用，其特征在于所述的藥物中含如權利要求2-6之一項所述的降糖肽的修飾肽以及藥學上可以接受的載體。
【文檔編號】A61P3/06GK103641889SQ201310683266
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月12日 優先權日:2013年12月12日
【發明者】李謙, 吳梧桐, 嚴國文, 周文喆 申請人:中國藥科大學