專利名稱：O－連接的糖型多肽和制備它們的方法
技術領域：
本發明涉及包含具有改變的O-連接的糖基化模式的糖蛋白，特別是因子VII、因子IX和其它凝血因子的組合物。
背景技術：
許多糖蛋白的生物活性高度依賴于與該糖蛋白相連的特定寡糖結構的存在或缺失。治療性糖蛋白的糖基化模式可影響治療功效的許多方面，如溶解性、抗蛋白分解的攻擊、熱滅活、免疫原性、半衰期、生物活性、生物利用度和穩定性。
糖基化是一種復雜的翻譯后修飾，它是細胞依賴性的。翻譯后，蛋白被轉運到內質網(ER)、被糖基化并送到高爾基體(Golgi)進一步加工，隨后靶向和/或分泌。在糖基化過程中，形成N-連接或O-連接的糖蛋白。
參與凝固或纖維蛋白溶解的血清蛋白質(包括，例如，因子VII和因子IX)證實是治療多種病理狀況的有效治療劑。因此，對于包含這些蛋白的制劑存在日益增加的需求，這些蛋白是藥學上可接受的并且顯示出均勻和預定的臨床功效。
由于使用人血漿作為藥物產品的來源有許多缺點，優選在重組系統中生產這些蛋白。然而，凝固蛋白經歷多種共-修飾和翻譯后-修飾，包括，例如，天冬酰胺-連接的(N-連接的)糖基化；絲氨酸-或蘇氨酸-連接的(O-連接的)糖基化；以及glu殘基的γ-羧化。當將異源細胞用作大規模生產蛋白的宿主時，這些修飾在定性或定量上可能不同。具體而言，異源細胞中的生產常常導致不同的糖型排列，相同的多肽具有不同的共價連接的寡糖結構。
在不同的系統中，治療性蛋白的寡糖結構中的變化與，尤其與，免疫原性和體內清除率的改變相關。因此，在本領域中對于下列組合物和方法仍然存在需求，所述組合物和方法可提供糖蛋白制劑，特別是含有重組因子IX或重組人因子VII或經修飾的因子VII或因子VII-相關多肽的制劑，它們含有預定的糖型模式。
發明概述本發明涉及包含顯示出預定絲氨酸或蘇氨酸-連接的糖型模式的多肽的制劑。就相連的聚糖或寡糖鏈而言，該制劑為至少約80％均一的，優選至少約90％，至少約95％，或至少約98％均一的此處所用糖型模式是指具有不同結構的寡糖鏈制劑內的分布，所述結構與位于多肽氨基酸主鏈中的EGF-樣結構域中的絲氨酸或蘇氨酸殘基共價連接。
一方面，本發明提供一種含Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys基序并且其中所述絲氨酸/蘇氨酸形成Glc-O-Ser/Thr共價鍵的一部分的糖蛋白的制劑，所述制劑含有實質上均勻的絲氨酸/蘇氨酸-連接的糖基化模式。
在本發明的一個實施方案中，糖基化模式為至少80％均勻，優選至少85％，至少90％，至少95％或至少98％均勻。
在一個實施方案中，絲氨酸/蘇氨酸-連接的聚糖是Xyl-Xyl-Glc-；在另一個實施方案中，該聚糖是Xyl-Glc-；在又一個實施方案中，該聚糖是Glc-。
在不同實施方案中，糖蛋白選自因子VII多肽、因子VII-相關多肽、因子IX多肽、因子X多肽、因子XII多肽和蛋白質Z多肽。在優選實施方案中，糖蛋白選自人因子VII、因子VII序列變體、人因子IX和因子IX序列變體。在一個實施方案中，糖蛋白是因子VII變體，其中當按照在本發明說明書中描述的“體外水解測定法”中測試時，因子VII-變體的活性與天然人因子VIIa(野生型FVIIa)的活性之間的比為至少約1.25，優選至少約2.0，或至少約4.0。
另一方面，本發明提供用于制備含Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys基序并且其中所述絲氨酸/蘇氨酸形成Glc-O-Ser/Thr共價鍵一部分的糖蛋白的制劑的方法，所述制劑含有實質上均勻的絲氨酸/蘇氨酸-連接的糖基化模式。該方法適用于重建或改變在其最初表達之后，糖蛋白上呈現的糖基化模式。
更具體而言，本發明提供一種用于修飾糖蛋白的聚糖(具體而言，O-連接的聚糖)，以便改進或提高它們的藥學性質的一般酶方法。一種方法包括使用木糖苷酶處理糖蛋白，以便除去任意的末端木糖殘基；其它方法包括通過用木糖基轉移酶處理而使木糖殘基與糖蛋白上暴露的葡萄糖或木糖殘基相連；第三種方法包括使葡萄糖殘基與多肽主鏈中的絲氨酸和/或蘇氨酸氨基酸殘基相連，由此產生糖基化多肽。
附圖簡要說明
圖1顯示wt-因子VII的絲氨酸52糖基化。
圖2顯示因子VII的O-糖基化作圖。
圖3顯示制備顯示預定絲氨酸/蘇氨酸-連接的糖基化的糖蛋白制劑的反應方案。
圖4顯示表明級分“A”和“B ”的第一次HIC循環的色譜圖。
圖5顯示通過將級分“A”再次裝載到HIC柱上獲得的色譜圖；在峰部分，部分10中鑒定出了Glc-O-Ser52-FVII。
圖6顯示通過將級分“B”再次裝載到HIC柱上獲得的色譜圖；在峰部分，部分15中鑒定出了Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52-FVII。
圖7A顯示峰部分，部分10的胰蛋白酶肽圖；箭頭表示GIc-O-Ser52 O-糖肽。
圖7B顯示峰部分，部分15的胰蛋白酶肽圖；箭頭表示Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52 O-糖肽。
圖8A顯示峰部分，部分10的總質量分析；箭頭表示Glc-O-Ser52-rFVIIa O-糖型。
圖8B顯示峰部分，部分15的總質量分析；箭頭表示Xyl-Xyl-Glc-O-rFVIIa O-糖型。
詳細說明此處使用了下列縮寫詞Glc＝葡萄糖基Xyl＝木糖基Ser＝絲氨酸(一個字母代碼S)Thr＝蘇氨酸(一個字母代碼T)Pro＝脯氨酸(一個字母代碼P)Cys＝半胱氨酸(一個字母代碼C)FVII＝因子VIIFVIIa＝活化的(兩條鏈)因子VIIFIX＝因子IXFIXa＝活化的(兩條鏈)因子IX此處所用“糖型模式”(或“糖基化模式”)是指具有不同結構的寡糖鏈制劑內的分布，所述結構與位于多肽氨基酸主鏈中的絲氨酸或蘇氨酸殘基共價連接。
“同質性”是指在整個一組具有綴合聚糖的多肽中的結構一致性。因此，如果所有包含的糖蛋白分子均含有與相關糖基化位點相連的相同聚糖，則認為該糖蛋白制劑約100％均一。例如，如果至少90％的因子VII多肽分子含有與絲氨酸52相連的目標聚糖(例如，Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52)，則認為因子VII多肽的制劑是至少90％均一的。
“實質上均勻的糖型”或“實質上均勻的糖基化”或“實質上均勻的糖基化模式”，當涉及糖肽種類時，是指接受體部分，即，絲氨酸或蘇氨酸殘基的百分比，它們可被目標聚糖糖基化。例如，就因子VII而言，如果實質上52位的所有(如下面所定義的)絲氨酸殘基均被目標聚糖糖基化，則存在實質上均勻的糖基化模式。本領域技術人員應了解，原料可含有糖基化的絲氨酸和/或蘇氨酸殘基，它們被具有與目標聚糖相同結構的種類糖基化。因此，計算出的百分比糖基化包括被本發明目標聚糖糖基化的絲氨酸/蘇氨酸殘基，以及已被原料中的目標聚糖糖基化的那些絲氨酸/蘇氨酸殘基。
術語“實質上”欲指糖蛋白中至少約80％，如至少約90％，至少約95％，或至少約98％的絲氨酸/蘇氨酸殘基被預定的、特定聚糖或目標聚糖糖基化。糖基化模式通常通過本領域技術人員已知的一種或多種方法來測定，例如，胰蛋白酶消化，接著進行高效液相色譜法(HPLC)，液相色譜法-質譜法(LC-MS)，基質輔助激光解吸質量飛行時間光譜測定法(MALDITOF)，毛細管電泳等。
術語“接受體部分”欲包括向其轉移所需寡糖或單糖基團的基團或部分，例如，但不限于，位于Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys基序內的絲氨酸/蘇氨酸殘基，與這種絲氨酸/蘇氨酸殘基共價連接的Glc-殘基，或分別與Glc-O-Ser/Thr或Xyl-Glc-O-Ser/Thr部分中的Glc-殘基或Xyl-殘基共價連接的Xyl-殘基。
術語“糖供體部分”欲包括具有適于作為相關催化酶(例如，葡萄糖基轉移酶，木糖苷酶，或木糖基轉移酶)底物發揮作用的供體部分的離去基團(例如，木糖-UDP或葡萄糖-UDP)的活化糖供體分子(例如，所需寡糖或單糖結構，例如，木糖基-木糖基-供體，木糖基-供體，或葡萄糖基-供體)。
寡糖被認為具有還原和非-還原末端，不管還原末端的糖事實上是還原糖。按照被接受的命名法，此處將非-還原末端放在左側，還原末端放在右側來描述寡糖(例如，Xyl-Xyl-Glc-O-Ser)。
含EGF結構域的多肽術語“含EGF結構域的多肽”欲包括含一種或多種表皮生長因子(EGF)-樣結構域的肽、寡肽和多肽。EGF結構域或重復單位是具有約40個氨基酸的小的基序，其由形成三個二硫鍵的6個保守半胱氨酸限定。含EGF-結構域的多肽全部含有用于O-葡萄糖修飾的共有序列Cys1-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys2(即，Cys1-X1-Ser-X2-Pro-Cys2或Cys1-X1-Thr-X2-Pro-Cys2共有序列)，其中Cys1和Cys2是EGF重復單位的第一個和第二個保守半胱氨酸，并且X1和X2獨立地是任意氨基酸。
術語“糖蛋白”欲包括含EGF結構域的多肽，它含有與位于該多肽主鏈氨基酸序列中的EGF-結構域的一個或多個絲氨酸/蘇氨酸氨基酸殘基相連的一個或多個聚糖。
此處所用術語“聚糖”或，可互換的，“糖鏈”，“寡糖鏈”或“寡糖部分”是指與單一絲氨酸/蘇氨酸殘基共價連接的整個寡糖結構。該聚糖可含有一個或多個糖單位；聚糖的例子包括，例如，Glc-，Xy1-Glc-，和Xy1-Xy1-Glc-。
術語“O-糖基化位點”欲表示位于基序Cys1-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys2內的絲氨酸/蘇氨酸(即，Ser或Thr)處的糖基化位點，其中Cys1和Cys2是EGF重復單位的第一個和第二個保守半胱氨酸，并且X1和X2獨立地是任意氨基酸。這些包括人wt-FVII的Ser-52(S52)位的糖基化位點和同源多肽中的相應殘基，例如，但不限于，FVII序列變體和FIX多肽。術語“相應的殘基”欲指當進行序列對比時，與野生型因子VII的Ser52殘基相對應的Ser或Thr氨基酸殘基(見圖1)。氨基酸序列的同源性/同一性方便地由對比的序列確定，其中使用用于序列對比的適宜計算機程序，例如，ClustalW程序，1.8版，1999(Thompson等人，1994，Nucleic AcidResearch，224673-4680)。例如，wt-因子VII Ser52-殘基與wt-因子IX的Ser53-殘基相對應。應進一步了解的是，可產生含有非-天然存在的Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys基序且由此含有可按照本發明被糖基化的非-天然存在的O-糖基化位點的多肽變體。在本發明的一個實施方案中，O-糖基化位點是絲氨酸-糖基化位點，并且基序是Cys1-X1-Ser-X2-Pro-Cys2。在另一個實施方案中，O-糖基化位點是蘇氨酸-糖基化位點且基序是Cys1-X1-Thr-X2-Pro-Cys2。
術語“末端葡萄糖”欲包括作為聚糖或寡糖鏈中的末端糖殘基連接的葡萄糖殘基，即各觸角的末端糖是葡萄糖。術語“末端木糖”欲包括作為聚糖或寡糖鏈中的末端糖殘基連接的木糖殘基。
酶蛋白O-葡萄糖基轉移酶可按照，例如，Shao等人所述(Glycobiology 12(11)763-770(2002))進行制備。
α-木糖苷酶可以，例如，按照Monroe等人所述(Plant Physiologyand Biochemistry 41877-885(2003))進行制備。
酶，UDP-D-木糖β-D-葡萄糖苷α-1，3-D-木糖基轉移酶可按照Omichi等人所述(Eur.J.Biochem.245143-146(1997))，從HepG2細胞制備。
酶，UDP-D-木糖α-D-木糖苷α1，3-木糖基轉移酶可按照Minamida等人所述((J.Biochem.(Tokyo)1201002-1006(1996))，從HepG2細胞制備。
UDP-β-D-葡萄糖可從商業得到，例如Sigma(Sigma U4625)。
UDP-D-木糖可從商業得到，例如Sigma(Sigma U5875)。
糖蛋白基序Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys似乎主要在多模塊蛋白，如凝固和纖維蛋白溶解因子的表皮生長因子(EGF)結構域中發現。該基序是進行O-葡萄糖修飾的共有序列，由此形成絲氨酸-葡萄糖(Glc-O-Ser)或蘇氨酸-葡萄糖(Glc-O-Thr)鍵。凝血因子VII、IX、X和XII以及血漿蛋白Z、原纖蛋白和血小板反應蛋白已經全部顯示含有Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys共有序列。這些之中，因子VII和IX及蛋白Z已被描述含有共有序列Cys-X1-Ser-X2-Pro-Cys。
血小板反應蛋白為一族胞外蛋白，其參與細胞-細胞和細胞-基質的通訊。該蛋白自血小板分泌。它們可在組織發生和修復過程中調節細胞表型。
蛋白Z是維生素k-依賴性血漿蛋白，它的結構與因子VII、IX和X的相似。然而，與這些蛋白形成對照的是，蛋白Z不是絲氨酸蛋白酶的酶原，這是因為它缺少催化三聯體的His和Ser殘基。像蛋白C和S一樣，蛋白Z可信地通過輔助抑制活化的因子X(FXa)，參與限制凝固反應。
因子X(Stuart Prower因子)是維生素K-依賴性絲氨酸蛋白酶，其通過參與將凝血酶原活化成凝血酶而參與血液凝固過程。
因子XII(Hageman因子)是通過與受損血管的內皮下表面接觸而活化的凝血因子。連同激肽釋放酶原一起，它起接觸因子的作用，引發血液凝固的內在途徑。激肽釋放酶原可將因子XII活化成XIIa。
因子IX(Christmas因子)是維生素K-依賴性絲氨酸蛋白酶，其通過參與將FX活化成FXa而參與血液凝固過程。
因子VII(前轉變素)是維生素K-依賴性絲氨酸蛋白酶，其通過參與將凝血酶原活化成凝血酶而參與血液凝固過程。通過與血管壁損傷部位暴露的組織因子(TF)接觸，FVII被活化成FVIIa。
因子VII多肽和因子VII-相關多肽此處所用術語“因子VII多肽”或“FVII多肽”是指包含野生型人因子VIIa的氨基酸序列1-406的任意蛋白(即，具有美國專利No.4,784,950中公開的氨基酸序列的多肽)，其變體以及因子VII-相關多肽，因子VII衍生物和因子VII綴合物。這包括FVII變體，因子VII-相關多肽，因子VII衍生物和因子VII綴合物，它們顯示出相對于野生型人因子VIIa實質上相同或提高的生物活性。
術語“因子VII”欲包括它們未裂解(酶原)形式的因子VII多肽，以及已被蛋白酶解加工產生它們各自生物活性形式的那些，其可被命名為因子VIIa。通常，因子VII在殘基152和153之間裂解，產生因子VIIa。因子VII的這類變體可顯示出相對于人因子VII不同的性質，包括穩定性，磷脂結合，改變的比活性等。
此處所用“野生型人FVIIa”是具有美國專利No.4,784,950中公開的氨基酸序列的多肽。
此處所用“因子VII-相關多肽”包括多肽，包括變體，其中因子VIIa的生物活性相對于野生型因子VIIa的活性已被實質改變，如降低。這些多肽包括，但不限于，其中已經引入了特定的氨基酸序列改變的因子VII或VIIa，其改變或破壞了該多肽生物活性。
此處所用術語“因子VII衍生物”欲指顯示出相對于野生型因子VII實質上相同或提高的生物活性的FVII多肽，其中母肽的一個或多個氨基酸已被基因和/或化學和/或酶修飾，例如，通過烷基化，糖基化，PEG化，酰化，酯形成或酰胺形成等。這包括，但不限于PEG化的人因子VIIa，半胱氨酸-PEG化的人因子VIIa及其變體。因子VII衍生物的非限制性例子包括葡萄糖PEG化的FVII衍生物，如WO 03/31464和美國專利申請US 20040043446，US 20040063911，US20040142856，US 20040137557和US 20040132640(NeoseTechnologies，Inc.)中公開的；FVII綴合物，如WO 0I/04287，美國專利申請20030165996，WO 01/58935，WO 03/93465(Maxygen ApS)和WO 02/02764，美國專利申請20030211094(University of Minnesota)中公開的。
術語“提高的生物活性”是指i)FVII多肽的蛋白酶解活性與重組野生型人因子VIIa相比實質上相同或增加，或ii)FVII多肽的TF結合活性與重組野生型人因子VIIa相比實質上相同或增加，或iii)FVII多肽的血漿半衰期與重組野生型人因子VIIa相比實質上相同或增加。術語“PEG化的人因子VIIa”是指人因子VIIa，其具有與人因子VIIa多肽綴合的PEG分子。應了解，PEG分子可與因子VIIa多肽的任意部分，包括任意氨基酸殘基或因子VIIa多肽的碳水化合物部分相連。術語“半胱氨酸-PEG化的人因子VIIa”是指具有與引入到人因子VIIa中的半胱氨酸的巰基綴合的PEG分子的因子VIIa。
與重組野生型人因子VIIa相比，蛋白酶解活性實質上相同或增加的因子VII變體的非限制性例子包括S52A-FVIIa、S60A-FVIIa(Lino等人，Arch.Biochem.Biophys.352182-192，1998)；如在美國專利No.5,580,560中公開的顯示蛋白酶解穩定性增加的FVIIa變體；已在殘基290和291之間或殘基315和316之間被蛋白酶解裂解的因子VIIa(Mollerup等人，Biotechnol.Bioeng.48501-505，1995)；因子VIIa的氧化形式(Kornfelt等人，Arch.Biochem.Biophys.36343-54，1999)；PCT/DK02/00189(與WO 02/077218相對應)中公開的FVII變體；和如WO 02/38162中公開的顯示出蛋白酶解穩定性增加的FVII變體，(Scripps Research Institute)；如在WO 99/20767，美國專利US 6017882和US 6747003，美國專利申請200301 00506(University of Minnesota)和WO 00/66753，美國專利申請US 20010018414，US 2004220106，和US 200131005，美國專利US 6762286和US 6693075(University ofMinnesota)中公開的具有修飾的Gla-結構域且顯示膜結合提高的FVII變體；和如WO 01/58935，美國專利US 6806063，美國專利申請20030096338(Maxygen ApS)，WO 03/93465(Maxygen ApS)，WO04/029091(Maxygen ApS)，WO 04/083361(Maxygen ApS)，和WO04/111242(Maxygen ApS)以及WO 04/108763(Canadian BloodServices)中公開的FVII變體。
與野生型FVIIa相比，生物活性增加的FVII變體的非限制性例子包括如在WO 01/83725，WO 02/22776，WO 02/077218，PCT/DK02/00635(對應于WO 03/027147)，丹麥專利申請PA 200201423(對應于WO 04/029090)，丹麥專利申請PA 2001 01627(對應于WO 03/027147)；WO 02/38162(Scripps Research Institute)中公開的FVII變體；和如在JP 2001061479(Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.)中公開的活性提高的FVIIa變體。
因子VII變體的例子包括，但不限于，L305V-FVII，
L305V/M306D/D309S-FVII，L305I-FVII，L305T-FVII，F374P-FVII，V158T/M298Q-FVII，V158D/E296V/M298Q-FVII，K337A-FVII，M298Q-FVII，V158D/M298Q-FVII，L305V/K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII，V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII，K157A-FVII，F296V-FVII，E296V/M298Q-FVII，V158D/E296V-FVII，V158D/M298K-FVII，and S336G-FVII，L305V/K337A-FVII，L305V/V158D-FVII，L305V/E296V-FVII，L305V/M298Q-FVII，L305V/V158T-FVII，L305V/K337A/V158T-FVII，L305V/K337A/M298Q-FVII，L305V/K337A/E296V-FVII，L305V/K337A/V158D-FVII，L305V/V158D/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V-FVII，L305V/V158T/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V-FVII，L305V/E296V/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，L305V/V158T/F296V/K337A-FVII，L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，S314E/K316H-FVII，S314E/K316Q-FVII，S314E/L305V-FVII，S314E/K337A-FVII，S314E/V158D-FVII，S314E/E296V-FVII，S314E/M298Q-FVII，S314E/V158T-FVII，K316H/L305V-FVII，K316H/K337A-FVII，K316H/V158D-FVII，K316H/E296V-FVII，K316H/M298Q-FVII，K316H/V158T-FVII，K316Q/L305V-FVII，K316Q/K337A-FVII，K316Q/V158D-FVII，K316Q/E296V-FVII，K316Q/M298Q-FVII，K316Q/V158T-FVII，S314E/L305V/K337A-FVII，S314E/L305V/V158D-FVII，S314F/L305V/E296V-FVII，S314F/L305V/M298Q-FVII，S314F/L305V/V158T-FVII，S314E/L305V/K337A/V158T-FVII，S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII，S314E/L305V/K337A/E296V-FVII，S314E/L305V/K337A/V158D-FVII，S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V-FVII，S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V-FVII，S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，
S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316H/L305V/K337A-FVII，K316H/L305V/V158D-FVII，K316H/L305V/E296V-FVII，K316H/L305V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T-FVII，K316H/L305V/K337A/V158T-FVII，K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII，K316H/L305V/K337A/E296V-FVII，K316H/L305V/K337A/V158D-FVII，K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V-FVII，K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V-FVII，K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q- FVII，K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316Q/L305V/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158D-FVII，K316Q/L305V/E296V-FVII，K316Q/L305V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T- FVII，K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII，K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII，K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII，K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII，K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII，K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII，K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/K337A-FVII，F374Y/V158D-FVII，F374Y/E296V-FVII，F374Y/M298Q-FVII，F374Y/V158T-FVII，F374Y/S314E-FVII，F374Y/L305V-FVII，F374Y/L305V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D-FVII，F374Y/L305V/E296V-FVII，F374Y/L305V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158T-FVII，F374Y/L305V/S314E-FVII，F374Y/K337A/S314E-FVII，F374Y/K337A/V158T-FVII，F374Y/K337A/M298Q-FVII，F374Y/K337A/E296V-FVII，F374Y/K337A/V158D-FVII，F374Y/V158D/S314E-FVII，F374Y/V158D/M298Q-FVII，F374Y/V158D/E296V-FVII，F374Y/V158T/S314E-FVII，F374Y/V158T/M298Q-FVII，F374Y/V158T/E296V-FVII，F374Y/E296V/S314E-FVII，F374Y/S314E/M298Q-FVII，F374Y/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII，F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII，F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII，F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII，F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII，
F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII，F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII，F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII，F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII，F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII，F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII，F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII，F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII，F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII，F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII，F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII，F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII，F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII，F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII，F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII，F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII，F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII，F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII，F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII，F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII，F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII，F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314F-FVII，F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII，F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII，F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，S52A-Factor VII，S60A-FactorVII；R152E-Factor VII，S344A-Factor VII，T106N-FVII，K143N/N145T-FVII，V253N-FVII，R290N/A292T-FVII，G291N-FVII，R315N/V317T-FVII，K143N/N145T/R315N/V317T-FVII；和233Thr-240Asn的氨基酸序列中具有置換、加成或缺失的FVII；304Arg-329Cys的氨基酸序列中具有置換、加成或缺失的FVII；和153Ile-223Arg的氨基酸序列中具有置換、加成或缺失的FVII。
相對于野生型因子VIIa，生物活性實質上相同或提高的因子VII變體包括顯示出野生型因子VIIa比活性的至少約25％，如至少約50％，至少約75％，至少約90％，至少約120，至少約130，或至少約150％的那些，其已在相同的細胞類型中生產，在上述凝固測定法，蛋白酶解測定法，或TF結合測定法的一種或多種中測試時。相對于野生型因子VIIa，生物活性實質上降低的因子VII變體是顯示出低于野生型因子VIIa的比活性的約25％，優選低于約10％，更優選低于約5％且最優選低于約1％的那些，其已在相同的細胞類型中生產，在上述凝固測定法，蛋白酶解測定法，或TF結合測定法的一種或多種中測試時。相對于野生型因子VII，生物活性被實質上改變的因子VII變體包括，但不限于，顯示TF-非依賴性因子X蛋白酶解活性的因子VII變體和結合TF但不裂解因子X的那些。
因子VIIa在血液凝固中的生物活性來源于其下列能力(i)結合組織因子(TF)和(ii)催化因子IX或因子X的蛋白酶解裂解，以產生活化的因子IX或X(分別為因子IXa或Xa)。就本發明目的而言，因子VIIa的生物活性可按照例如美國專利No.5,997,864中所述，使用因子VII-缺失血漿和促凝血酶原激酶，通過測量制劑促進血液凝固的能力而量化。在該測定法中，生物活性以凝固時間相對于對照樣品的減少來表示，并通過與含1個單位/ml因子VII活性的混合人血清標準品比較而轉化成“因子VII單位”。可選擇性地，因子VIIa的生物活性可通過如下方法而量化(i)在含有包埋在脂質膜中的TF和因子X的系統中，測量因子VIIa產生因子Xa的能力(Persson等人，J.Biol.Chem.27219919-19924，1997)；(ii)測量含水系統中的因子X的水解(見，下面的“一般方法”)；(iii)使用基于表面胞質團共振的儀器，測量其與TF的物理結合(Persson，FEBS Letts.413359-363，1997)(iv)測量合成底物的水解(見，下面的“一般方法”)；和(v)測量體外系統中，TF-獨立性的凝血酶的產生(見，下面的“一般方法”)。
因子IX多肽和因子IX-相關多肽本發明包括因子IX多肽，如具有例如Jaye等人，Nucleic AcidsRes.112325-2335，1983(野生型人因子IX)中公開的氨基酸序列的那些。
在實踐本發明時，可有效預防或治療出血的任意因子IX多肽均可使用。這包括來源于血液或血漿，或通過重組方式產生的因子IX多肽。
此處所用“因子IX多肽”包括，不限于，因子IX，以及因子IX-相關多肽。術語“因子IX”欲包括，不限于，具有如Jaye等人，NucleicAcids Res.1 983(見上面)(野生型人因子IX)所述氨基酸序列的多肽，以及來源于其它物種的野生型因子IX，如牛、豬、犬、鼠和鮭魚因子IX。它還包括因子IX的天然等位變異形式，其可從一個個體到另外一個個體中存在并發生。另外，糖基化或其它翻譯后修飾的程度和位置可根據所選宿主細胞和宿主細胞環境的性質而變化。術語“因子IX”還欲包括它們未裂解(酶原)形式的因子IX多肽，以及已被蛋白酶解加工產生它們各自的生物活性形式的因子IX多肽，其可被命名為因子IXa。
“因子IX-相關多肽”包括，不限于，相對于人因子IX被化學修飾和/或相對于人因子IX含有一個或多個氨基酸序列改變(即，因子IX變體)的因子IX多肽，和/或相對于人因子IX含有截短氨基酸序列(即，因子IX的片段)的因子IX多肽。這類因子IX-相關多肽可顯示出相對于人因子IX不同的性質，包括穩定性、磷脂結合、比活性改變等。
術語“因子IX-相關多肽”欲包括它們未裂解(酶原)形式的這類多肽，以及已被蛋白酶解加工產生它們各自的生物活性形式的那些，其可被命名為“因子IXa-相關多肽”或“活化的因子IX-相關多肽”。
此處所用“因子IX-相關多肽”包括，不限于，相對于野生型人因子IX，生物活性實質上相同或提高的多肽，以及相對于野生型人因子IX的活性，其中因子IX的生物活性已被實質上改變或降低的多肽。這些多肽包括，不限于，已被化學修飾的因子IX或因子IXa和其中已經引入特異的氨基酸序列改變的因子IX變體，其改變或破壞了該多肽的生物活性。
它還包括具有稍被修飾的氨基酸序列的多肽，例如，具有修飾的N-末端，包括N-末端氨基酸缺失或加成的多肽，和/或相對于人因子IX已經被化學修飾的多肽。
因子IX-相關多肽，包括因子IX的變體，無論相對于野生型因子IX顯示實質上相同或更好的生物活性，還是，可選擇性地，相對于野生型因子IX顯示實質上改變或降低的生物活性，包括，不限于，通過一個或多個氨基酸的插入、缺失、或置換而具有不同于野生型因子IX序列的氨基酸序列的多肽。
因子IX-相關多肽(包括變體)，包括顯示出野生型因子IX比活性的至少約10％，至少約20％，至少約30％，至少約40％，至少約50％，至少約60％，至少約70％，至少約80％，至少約90％，至少約100％，至少約110％，至少約120％，并且至少約130％的那些，其已在相同的細胞類型中生產，在本發明說明書中描述的因子IX活性測定法中測試。
相對于野生型因子IX，生物活性實質上相同或提高的因子IX-相關多肽(包括變體)包括顯示出野生型人因子IX特異性生物活性的至少約25％，優選至少約50％，更優選至少約75％，更優選至少約100％，更優選至少約110％，更優選至少約120％，并且最優選至少約130％的那些，其已在相同的細胞類型中產生，在一種或多種所述的特異性因子IX活性測定法中測試時。就本發明目的而言，因子IX的生物活性可按照本發明說明書后面所述的進行量化(見“一般方法”)。
相對于野生型因子IX，生物活性實質上降低的因子IX-相關多肽(包括變體)是顯示出低于野生型因子IX的比活性的約25％，優選低于約10％，更優選低于約5％且最優選低于約1％的那些，其已在相同的細胞類型中生產，在上述一種或多種特異性因子IX活性測定法中測試時。
因子IX多肽的非-限制性例子包括血漿-衍生的人因子IX，如例如Chandra等人，Biochem.Biophys.Acta 1973，328456；Andersson等人，Thromb.Res.1975，7451；Suomela等人，Eur.J.Biochem.1976，71145所述。
用于測試因子IX的活性，并由此提供選擇用于本發明的適宜因子IX變體的方法適宜測定法可按照例如Wagenvoord等人，Haemostasis 1990；20(5)276-88所述的簡單體外試驗進行。因子IX的生物活性還可通過測量制劑校正因子IX-不足的血漿的凝固時間的能力，如Nilsson等人1959.(Nilsson IM，Blombaeck M，Thilen A，vonFrancken I.，Carriers of haemophilia A-A laboratory study，Acta MedScan 1959；165357)所述而量化。在該測定法中，生物活性以單位/ml血漿表示(1個單位相當于標準混合血漿中存在的FIX的量)。
在本發明的一些實施方案中，因子IX是在“產色測定法”(見下面)中測試時，所述因子IX多肽的活性與天然人因子IX(野生型因子IX)的活性之間的比為至少約1.25的因子IX-相關多肽；在其它實施方案中，該比值為至少約2.0；在其它實施方案中，該比值為至少約4.0。
O-連接的糖基化在實踐本發明時，寡糖的模式可使用本領域已知的任意方法測定，包括，不限于高效液相色譜法(HPLC)；毛細管電泳(CE)；核磁共振(NMR)；使用離子化技術，如快速-原子轟擊、電噴霧、或基質-輔助的激光解吸(MALDI)的質譜法(MS)；氣相色譜法(GC)；和使用外糖苷酶連同陰離子-交換(AIE)-HPLC、尺寸排阻色譜法(SEC)或MS處理。見，例如，Weber等人，Anal.Biochem.225135(1995)；Klausen等人，J.Chromatog.718195(1995)；Morris等人，in Mass Spectrometryof Biological Materials，McEwen等人，eds.，Marcel Dekker，(1990)，pp137-167；Conboy等人，Biol.Mass Spectrom.21397，1992；Hellerqvist，Meth.Enzymol.193554(1990)；Sutton等人，Anal.Biohcem.31834(1994)；Harvey等人，Organic Mass Spectrometry 29752(1994)。
例如可通過胰蛋白酶肽作圖測定O-糖型的相對含量。簡言之，糖蛋白使用胰蛋白酶消化，根據聚糖結構，通過RP-HPLC色譜法，質譜法或其它適宜的分析分離技術來分離含O-糖基化位點的多肽。如果需要，為了獲得適宜的分離，可在使用胰蛋白酶消化之前，使該糖蛋白還原并烷基化，并通過RP-HPLC色譜法純化含O-糖基化位點的多肽鏈。然后，使該純化多肽經過胰蛋白酶消化，接著按照上面所述分析。
用于生產具有預定模式的O-連接寡糖的糖蛋白制劑的方法接受體糖蛋白的來源不是本發明的關鍵方面。通常，糖蛋白在培養的原核生物細胞或真核生物細胞，如哺乳動物、酵母菌、昆蟲、真菌或植物細胞中表達。然而，該蛋白還可從天然來源，如血漿、血清或血液中分離。該糖蛋白可以是全長蛋白或片段。
本發明提供包括具有實質上均勻的糖基化模式的糖蛋白種類的組合物。該方法適用于在其初始表達之后，重建或改變存在于糖蛋白上的糖基化模式。因此，本發明的方法提供用于大規模制備具有預選或預定均勻衍生化模式的糖型的實踐方法。該方法特別適于修飾治療性肽，包括但不限于，在細胞培養細胞或轉基因動物中生產的過程中未完全糖基化的糖蛋白。然而，本發明的制劑和組合物還可通過純化天然來源，如血漿，血清或血液，或細胞培養液并分離其中所需糖型而制備。
按照本發明重建的多肽通常通過細胞培養過程制備。適宜的宿主細胞包括，不限于，表達內源基因，如，因子VII、IX、X、或XII基因或蛋白Z基因的人細胞。在這些細胞中，內源基因可以是完整的或已被原位修飾，或內源基因以外的序列可被原位修飾，從而改變內源糖蛋白基因的表達。可使用能夠表達內源糖蛋白基因的任意人細胞。其它包括的宿主細胞是被設計表達糖蛋白，如，來源于重組基因的人因子VII或IX或X或XII的異源宿主細胞。宿主細胞可以是脊椎動物、昆蟲或真菌細胞。優選，細胞是哺乳動物細胞，具有哺乳動物N-連接的糖基化；O-連接的糖基化；和γ-羧化的完全譜。見，例如，美國專利Nos.4,784,950。優選的哺乳動物細胞系包括CHO(ATCC CCL61)，COS-1(ATCC CRL 1650)，幼小倉鼠的腎(BHK)和HEK293(ATCC CRL 1573；Graham等人，J.Gen.Virol.3659-72，1977)細胞系。優選的BHK細胞系是tk-ts13 BHK細胞系(Waechter和Baserga，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 791106-1110，1982)，此后稱其為BHK 570細胞。BHK 570細胞系可從美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)，12301 Parklawn Dr.，Rockville，MD 20852獲得，ATCC登記號為CRL 10314。tk-ts13 BHK細胞系也可從ATCC獲得，登記號為CRL 1632。此外，可使用許多其它細胞系，包括Rat Hep I(Rat hepatoma；ATCC CRL 1600)、Rat Hep II(Rathepatoma；ATCC CRL 1548)、TCMK(ATCC CCL 139)、人肺(ATCCHB 8065)、NCTC 1469(ATCC CCL 9.1)和DUKX細胞(CHO細胞系)(Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774216-4220，1980)。(DUKX細胞也稱作CXB11細胞)，和DG44(CHO細胞系)(Cell，33405，1983和Somatic Cell and Molecular Genetics 12555，1986)。3T3細胞、Namalwa細胞、骨髓瘤和骨髓瘤與其它細胞的融合體也是適用的。適宜宿主細胞包括BHK 21細胞，其已經適應在沒有血清的條件下生長并已被設計表達因子VII。該細胞可以是表達較之衍生它們的細胞類型定性或定量不同的糖基化酶(如，糖基轉移酶和/或糖苷酶)譜的突變體或重組細胞。該細胞還可被設計表達其它異源肽或蛋白，包括，如因子VII的截短形式。該宿主細胞還可以是CHO細胞，其已被設計共表達目標因子VII多肽(即，因子VII或因子-VII-相關多肽)和另一種異源肽或多肽，例如，修飾酶或因子VII片段。
方法本發明包括用于生產包含上述預定的絲氨酸/蘇氨酸-連接的糖型模式的制劑的方法，在其它實施方案中，包括用于優化糖蛋白的糖型分布的方法(見圖3)。所述單個加工步驟可用于不同組合中，以便獲得所需糖型模式。下面給出非限制性例子。
一方面，這些方法通過下列步驟實施
(a)從制備它的細胞，例如，從工程細胞(細胞培養物)中或通過從天然來源中分離糖蛋白，獲得含有Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys基序并且其中所述絲氨酸/蘇氨酸形成Glc-O-Ser/Thr共價鍵的一部分的糖蛋白的制劑；(b)在適于將單糖或寡糖基團從供體部分轉移到接受體部分的條件下，使該糖蛋白制劑與所需單-或寡糖部分的活化供體及適于轉移所需單-或寡糖基團的酶接觸，由此生產具有改變的糖基化模式的糖肽。
另一方面，這些方法通過下列步驟實施(aa)從制備它的細胞，例如，從工程細胞(細胞培養物)中或通過從天然來源中分離糖蛋白，獲得含有Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys基序并且其中所述絲氨酸/蘇氨酸形成Glc-O-Ser/Thr共價鍵的一部分的糖蛋白的制劑；(bb)在適于除去單糖或寡糖基團的條件下，使該糖蛋白制劑與適于除去所述末端單糖或寡糖基團的酶接觸，由此產生具有改變的糖基化模式的糖肽。
在其中一個實施方案中，該方法包括步驟(b)和(bb)的組合。在一個實施方案中，該方法進一步包括分離具有改變的糖基化模式的糖蛋白的步驟。
在一個實施方案中，該方法進一步包括下列步驟分析與該多肽連接的寡糖結構以確定糖型模式，并且，任選地，重復步驟(b)和/或(bb)，直到獲得所需糖型模式。
這些方法可進一步包括如下步驟使具有預定糖型模式的制劑經過至少一次生物活性(包括，例如，凝固，因子X蛋白酶解，或TF結合)或其它功能性(如，藥物動力學特征或穩定性)的試驗，并將特定的糖型模式與特定的生物活性或功能性特征關聯起來，以便鑒定所需糖型模式。
在一個實施方案中，所需糖型模式是實質上均勻的葡萄糖-O-絲氨酸/蘇氨酸糖基化在該實施方案中，其中最初獲得的糖蛋白含有末端木糖，該方法(方法B)包括下列步驟
(a)從制備它的細胞；例如，從工程細胞(細胞培養物)中或通過從天然來源中分離糖蛋白，獲得含有Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys基序并且其中所述絲氨酸/蘇氨酸形成Glc-O-Ser/Thr共價鍵的一部分的糖蛋白的制劑；(b)在適于從糖蛋白中除去木糖殘基的條件下，使步驟(a)中獲得的制劑與α-木糖苷酶接觸，由此產生具有改變的糖基化模式的糖蛋白。
在一個實施方案中，該方法進一步包括分離步驟b中制備的具有Glc-O-Ser/Thr糖基化的糖蛋白的步驟。
在一個實施方案中，該方法進一步包括如下步驟分析與該多肽連接的寡糖結構，以確定糖型模式，并且，任選地，重復步驟(b)直到獲得所需糖型。
在用于制備實質上均勻的葡萄糖-O-絲氨酸/蘇氨酸糖基化形式的所需糖型模式的另一個實施方案中，該方法(方法C)包括下列步驟(a)例如從工程細胞(細胞培養物)中或通過從天然來源中分離糖蛋白，獲得含Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys基序的多肽的制劑；(b)在適于將葡萄糖殘基從葡萄糖供體部分轉移到絲氨酸/蘇氨酸接受體部分的條件下，使步驟(a)中獲得的制劑與O-葡萄糖基轉移酶及活化的葡萄糖供體接觸，由此產生具有改變的糖基化模式的多肽。
在一個實施方案中，該方法進一步包括分離步驟b中制備的具有Glc-O-Ser/Thr糖基化的糖蛋白的步驟。
在一個實施方案中，該方法進一步包括如下步驟分析與該多肽連接的寡糖結構，以確定糖型模式，并且，任選地，重復步驟(b)直到獲得所需糖型。
在一個實施方案中，所需糖型模式是實質上均勻的木糖-葡萄糖-O-絲氨酸/蘇氨酸糖基化在該實施方案中，該方法(方法A1)包括下列步驟(a)例如從工程細胞(細胞培養物)中或通過從天然來源中分離糖蛋白，獲得含Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys基序并且其中所述絲氨酸/蘇氨酸形成Glc-O-Ser/Thr共價鍵的一部分的糖蛋白的制劑；
(b)在適于將木糖殘基從木糖供體部分轉移到接受體部分的條件下，使步驟(a)中獲得的制劑與UDP-D-木糖β-D-葡糖苷α-1，3-D-木糖基轉移酶及活化的木糖基供體接觸，由此產生具有改變的糖基化模式的糖肽。
在一個實施方案中，該方法進一步包括分離步驟b中制備的具有Xyl-Glc-O-Ser/Thr糖基化的糖蛋白的步驟。
在一個實施方案中，該方法進一步包括如下步驟分析與該多肽連接的寡糖結構，以確定糖型模式，并且，任選地，重復步驟(b)直到獲得所需糖型。
在一個實施方案中，該方法進一步包括在步驟(b)之前，通過使步驟(a)中獲得的制劑經過方法B而除去末端木糖-殘基的步驟。
在一個實施方案中，所需糖型模式是實質上均勻的木糖-木糖-葡萄糖-O-絲氨酸/蘇氨酸糖基化在該實施方案中，該方法(方法A2)包括下列步驟(a)例如從工程細胞(細胞培養物)中或通過以天然來源中分離糖蛋白，獲得含Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys基序并且其中所述絲氨酸/蘇氨酸形成Glc-O-Ser/Thr共價鍵的一部分的糖蛋白的制劑；(b)在適于將木糖殘基從木糖供體部分轉移到接受體部分的條件下，使步驟(a)中獲得的制劑與UDP-D-木糖β-D-葡糖苷α-1，3-D-木糖基轉移酶及活化的木糖基供體接觸，由此產生具有改變的糖基化模式的糖肽；(c)在適于將木糖殘基從木糖供體部分轉移到接受體部分的條件下，使步驟(b)中獲得的制劑與UDP-D-木糖α-D-木糖苷α-1，3-木糖基轉移酶及活化的木糖基供體接觸，由此產生具有改變的糖基化模式的糖肽。
在其中一個實施方案中，該方法進一步包括在使制劑經過步驟(c)之前，分離步驟(b)中獲得的制劑的步驟。
在一個實施方案中，該方法進一步包括分離步驟(c)中制備的具有Xyl-Xyl-Glc-O-Ser/Thr糖基化的糖蛋白的步驟。
在一個實施方案中，該方法進一步包括如下步驟分析與該多肽連接的寡糖結構從而確定糖型模式，并且任選地，重復步驟(b)和/或步驟(c)直到獲得所需糖型模式。
在一個實施方案中，該方法進一步包括在步驟(b)之前，通過使步驟(a)中獲得的制劑經過方法B而除去末端木糖-殘基的步驟。
在不同的實施方案中，糖蛋白顯示實質上均勻的Xyl-Xyl-Glc-O-Ser糖基化、Xyl-Glc-O-Ser糖基化和Glc-O-Ser糖基化；Ser是所含Cys-X1-Ser-X2-Pro-Cys基序的絲氨酸(X1和X2獨立地是任意氨基酸殘基)。在其它不同的實施方案中，糖蛋白顯示實質上均勻的Xyl-Xyl-Glc-O-Thr糖基化、Xyl-Glc-O-Thr糖基化和Glc-O-Thr糖基化；Thr是所含Cys-X1-Thr-X2-Pro-Cys基序的蘇氨酸(X1和X2獨立地是任意氨基酸殘基)。
在不同的實施方案中，該多肽選自下列清單因子VII多肽、因子VII-相關多肽、因子IX多肽、因子IX-相關多肽、因子X多肽和因子X-相關多肽。
在優選實施方案中，該糖蛋白制劑選自下列清單顯示實質上均勻的Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52糖基化的因子VII多肽，顯示實質上均勻的Xyl-Glc-O-Ser52糖基化的因子VII多肽顯示實質上均勻的Glc-O-Ser52糖基化的因子VII多肽顯示實質上均勻的Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52糖基化的因子VII-相關多肽顯示實質上均勻的Xyl-Glc-O-Ser52糖基化的因子VII-相關多肽顯示實質上均勻的Glc-O-Ser52糖基化的因子VII-相關多肽顯示實質上均勻的Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52糖基化的因子VII變體顯示實質上均勻的Xyl-Glc-O-Ser52糖基化的因子VII變體顯示實質上均勻的Glc-O-Ser52糖基化的因子VII變體顯示實質上均勻的Xyl-Xyl-Glc-O-Ser53糖基化的因子IX多肽顯示實質上均勻的Xyl-Glc-O-Ser53糖基化的因子IX多肽顯示實質上均勻的Glc-O-Ser53糖基化的因子IX多肽顯示實質上均勻的Xyl-Xyl-Glc-O-Ser53糖基化的因子IX-相關多肽顯示實質上均勻的Xyl-Glc-O-Ser53糖基化的因子IX-相關多肽顯示實質上均勻的Glc-O-Ser53糖基化的因子IX-相關多肽顯示實質上均勻的Xyl-Xyl-Glc-O-Ser53糖基化的因子IX變體顯示實質上均勻的Xyl-Glc-O-Ser53糖基化的因子IX變體顯示實質上均勻的Glc-O-Ser53糖基化因子IX變體應了解，通過使用適宜的轉移酶及活化Xyl-Xyl-供體，可將寡糖如Xyl-Xyl-轉移到接受體Glc-O-Ser/Thr部分。
色譜方法本發明還包括用于生產上述包含預定絲氨酸/蘇氨酸-連接的糖型模式的制劑，并從包含所述多肽和具有不需要的糖型模式的多肽的組合物中純化具有所需糖型模式的O-糖基化多肽的疏水作用色譜方法。
一方面，該方法包括下列步驟(a)從制備它的細胞，例如，從工程細胞(細胞培養物)中或通過從天然來源中分離糖蛋白，獲得含有Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys基序并且其中所述絲氨酸/蘇氨酸形成Glc-O-Ser/Thr共價鍵的一部分的糖蛋白的制劑；(b)使用包含水，任選包含鹽成分，和任選包含緩沖液的溶液，使該糖蛋白與疏水作用材料結合，(c)任選使用包含水，任選包含鹽成分，和任選包含緩沖液的溶液洗滌該疏水作用材料，以從疏水作用材料中洗脫污染物；(d)使用包含有機修飾劑、水、任選包含鹽成分，和任選包含緩沖液的溶液，以線性或逐步梯度或在鹽成分中等度地，洗滌該疏水作用材料，以使將具有所需糖型模式的糖蛋白與不具有所需糖型的糖蛋白從疏水作用材料上分離；(e)收集包含具有所需糖型的糖蛋白的級分。
在一個實施方案中，上述方法進一步包括通過使步驟(e)中獲得的制劑經過步驟(a)-(e)而重復步驟(a)-(e)的步驟。如果認定需要，該進一步的步驟可重復多次。
應了解本發明的制劑還可通過包含純化步驟(由此從細胞培養液或天然來源中捕獲具有所需糖基化的糖蛋白種類)與上述酶方法的組合的方法制備。
上述方法可進一步包括如下步驟使具有預定糖型模式的制劑經過至少一種生物活性(包括，例如，凝固，因子X蛋白酶解，或TF結合)或其它功能性(例如，藥物動力學特征或穩定性)的試驗，并將特定糖型模式與特定生物活性或功能性特征關聯起來，以便鑒定所需糖型模式。
進一步的酶處理可與上述方法結合使用，以修飾制劑N-或O-連接聚糖的寡糖模式；這種處理包括，不限于，使用一種或多種唾液酸酶(神經氨酸苷酶)、半乳糖苷酶、巖藻糖苷酶；半乳糖基轉移酶、巖藻糖基轉移酶和/或唾液酸轉移酶處理，處理的順序和條件使得在具有特定末端結構的寡糖鏈的分布中獲得所需修飾。糖基轉移酶可從Calbiochem(La Jolla，CA)商業獲得且糖苷酶可從Glyko，Inc.，(Novato，CA)商業得到。
糖蛋白制劑此處所用“糖蛋白制劑”是指已經從合成它們的細胞中分離出來的眾多糖型。該糖蛋白制劑包括滅活形式，活化形式，功能相關多肽，如變體和化學修飾形式，其已經從合成它們的細胞中分離出來。
例如，此處所用“因子VII制劑”是指已經從合成它們的細胞中分離出來或從天然來源中分離出來的眾多因子VII多肽、因子VIIa多肽、或因子VII-相關多肽，包括變體和化學修飾形式。同樣，“因子IX制劑”是指已經從合成它們的細胞中分離出來或從天然來源(例如，血漿，血清，血液)中分離出來的眾多因子IX多肽、因子IXa多肽、或因子IX-相關多肽，包括變體或化學修飾形式。
多肽自它們源細胞中的分離可通過本領域已知的任何方法實現，包括，不限于，從粘附細胞培養物中取出含所需產物的細胞培養基；離心或過濾以除去未-粘附細胞等。
任選地，該多肽可被進一步純化。純化可使用本領域已知的任何方法實現，包括，不限于，如，在抗-因子VII或抗-因子IX抗體柱上進行的親和色譜法(見，例如，Wakabayashi等人，J.Biol.Chem.26111097，1986；和Thim等人，Biochem.277785，1988)；疏水作用色譜法；離子-交換色譜法；尺寸排阻色譜法；電泳操作(例如，制備型等電點聚焦(IEF)、差別溶解性(例如，硫酸銨沉淀法)，或提取法等。通常，見，Scopes，Protein Purification，Springer-Verlag，New York，1982；和Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden，editors，VCHPublishers，New York，1989。純化之后，該制劑優選含有低于約10重量％，更優選低于約5％且最優選低于約1％的來源于宿主細胞的非-相關蛋白。
因子VII和因子VII-相關多肽、因子IX和因子IX-相關多肽、或因子X和因子X-相關多肽分別可通過蛋白酶解裂解獲得，其中使用因子XIIa或具有胰蛋白酶-樣特異性的其它蛋白酶，如，因子IXa、激肽釋放酶、因子Xa和凝血酶。見，例如，Osterud等人，Biochem.112853(1972)；Thomas，美國專利No.4,456,591；和Hedner等人，J.Clin.Invest.711836(1983)。可選擇性地，因子VII、IX或X分別可通過使它通過離子-交換色譜柱，如Mono Q(Pharmacia)等而被活化。然后可配制所得活化多肽，例如，因子VII，并按照下面所述給藥。
糖蛋白制劑的功能性質本發明具有預定寡糖模式的糖蛋白制劑(包括因子VII多肽、因子VII-相關多肽、因子IX多肽和因子IX-相關多肽)相對于對照制劑顯示改進的功能性質。該改進的功能性質可包括，不限于，a)物理性質，如儲藏穩定性；b)藥物動力學性質，如生物利用度和半衰期；c)人中的免疫原性，和d)生物活性，如凝固活性。
對照制劑是指包含與其進行比較的本發明制劑中所含多肽相同的多肽的制劑(如，野生型因子VII或野生型因子IX或特定變體或化學修飾形式)，除了顯示不同的絲氨酸/蘇氨酸-連接的糖基化模式以外。
糖蛋白(例如，因子VII)制劑的儲藏穩定性可通過測量下列指標來評價(a)25℃下以干粉形式儲藏時，制劑的生物活性衰減20％所需的時間，和/或(b)制劑中所述糖蛋白的(例如，因子VIIa)聚集物的比例加倍所需的時間。
在一些實施方案中，當兩種制劑均在25℃下以干粉形式儲藏時，相對于對照制劑中出現相同現象所需的時間，本發明制劑顯示生物活性衰減20％所需的時間增加至少約30％，優選至少約60％且更優選至少約100％。生物活性的測量可使用凝固測定法、蛋白酶解測定法、TF-結合測定法、或TF-非依賴性凝血酶產生中的任一測定法來進行。
在一些實施方案中，當兩種制劑均在25℃下以干粉形式儲藏時，相對于對照制劑，本發明制劑顯示聚集物加倍所需的時間增加至少約30％，優選至少約60％，并且更優選至少約100％。聚集物的含量可按照技術人員已知的方法測定，例如，凝膠滲透HPLC法。例如，因子VII聚集物的含量是如下通過在Protein Pak 300 SW柱(7.5×300mm)(Waters，80013)上進行凝膠滲透HPLC而測定的。該柱使用洗脫劑A(0.2M硫酸銨，5％異丙醇，用磷酸將pH調節至2.5，之后用三乙胺將pH調節至7.0)平衡，之后將25μg樣品應用到柱上。洗脫是使用洗脫劑A，以0.5ml/分流速進行30分鐘，并通過測量215nm處的吸光度而進行檢測。聚集物的含量是根據因子VII聚集物的峰面積/因子VII峰的總面積(單體和聚集物)計算的。
“生物利用度”是指在給藥后的預定時間，可在血漿中檢測到的所給予劑量的(例如，因子VII或因子VII-相關)糖蛋白制劑的比例。通常，通過如下步驟在試驗動物中測量生物利用度給予約25-250μg/kg劑量的制劑；在給藥后的預定時間獲得血漿樣品；并使用凝固測定法(或任意生物測定法)、免疫測定法或等價方法中的一種或多種測定樣品中(例如，因子VII或因子VII-相關)糖基化多肽的含量。數據通常以多肽[例如，因子VII]對時間的圖表示，生物利用度以曲線下的面積(AUC)表示。試驗制劑的相對生物利用度是指試驗制劑的AUC與對照制劑的AUC之間的比值。
在一些實施方案中，本發明制劑顯示出對照制劑生物利用度的至少約110％，優選至少約120％，更優選至少約130％且最優選至少約140％的相對生物利用度。生物利用度可在任意哺乳動物物種中測量，優選狗，并且用于計算AUC的預定時間可包括10分鐘-8小時的不同增量。
“半衰期”是指(例如，因子VII多肽或因子VII-相關多肽)糖蛋白的血漿濃度從特定值降至該值一半所需的時間。半衰期可使用與用于測定生物利用度的相同程序測定。在一些實施方案中，相對于對照制劑的半衰期，本發明制劑顯示半衰期增加至少約0.25h，優選至少約0.5h，更優選至少約1h，并且最優選至少約2h。
制劑的“免疫原性”是指給予人時，制劑引發不論是體液的、細胞的、還是兩者的有害免疫反應的能力。還不知曉因子VIIa多肽和因子VIIa-相關多肽在人中引發可檢測的免疫反應。然而，在任何人亞居群中，可能存在顯示出對所給予的特定蛋白敏感的個體。免疫原性可使用本領域已知的常規方法，通過量化敏感個體中抗-因子VII抗體和/或因子VII-應答T-細胞而測量。在一些實施方案中，相對于對照制劑的所述個體免疫原性，本發明制劑顯示敏感個體中的免疫原性降低至少約10％，優選至少約25％，更優選至少約40％且最優選至少約50％。
藥物組合物和使用方法本發明制劑可用于治療應答相關糖蛋白的任何綜合征。因子VII-、FIX和FX-應答綜合征，分別，包括綜合征如，出血病癥，包括，不限于，由凝血因子缺乏引起的那些(例如，A和B型血友病或凝血因子XI或VII的缺乏)；由血小板減少癥或馮維勒布蘭德氏病引起的那些，或由凝血因子抑制劑引起的那些，或任何原因引起的過量出血。該制劑還可給予與手術或其它創傷有關的患者，或接受抗凝劑治療的患者。
本發明含因子VII-相關多肽的制劑，其相對于野生型因子VII具有實質上降低的生物活性，可在例如經歷血管成形術或其它外科手術(其可能增加發生于例如再狹窄中的血栓形成或血管阻塞危險)的患者中用作抗凝劑。開抗凝劑處方的其它醫學適應征包括，不限于，深度靜脈血栓形成、肺栓塞、中風、彌散性血管內血凝血(DIC)、與革蘭氏陰性內毒血癥有關的肺和腎中的血纖蛋白沉積、心肌梗塞；急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、系統性炎性反應綜合征(SIRS)、溶血性尿毒癥綜合征(HUS)、MOF、和TTP。
本發明含因子VII和因子VII-相關制劑的藥物組合物主要計劃用于胃腸道外給藥，用于預防性和/或治療性治療。優選，胃腸道外，即靜脈內、皮下或肌內給予該藥物組合物。它們可通過連續或脈動輸注給藥。
藥物組合物或制劑含有本發明的制劑以及，優選溶于其中的，藥學上可接受的載體，優選含水載體或稀釋劑。可使用各種含水載體，如水，緩沖水，0.4％鹽水，0.3％甘氨酸等。還可將本發明制劑配制成用于遞送或靶向損傷部位的脂質體制劑。脂質體制劑一般地在，例如，美國專利Nos.4,837,028、4,501,728和4,975,282中描述。該組合物可通過常規、熟知的滅菌技術滅菌。可將所得水溶液包裝使用，或在無菌條件下過濾并凍干，在給藥之前，將該凍干制劑與無菌水溶液混合。
該組合物可含有藥學上可接受的輔助性物質或助劑，包括，不限于，pH調節劑和緩沖劑和/或張力調節劑，如醋酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣等。
這些制劑中的因子VII或因子VII-相關多肽的濃度可廣泛變化，即從低于約0.5重量％，通常為或至少約1重量％到多達15或20重量％，并且主要可根據所選擇的特定給藥模式，通過流體體積、粘度等選擇。
因此，用于靜脈內輸注的典型藥物組合物可被配制含有250ml無菌林格氏溶液和10mg所述制劑。用于制備可胃腸道外給藥的組合物的實際方法是本領域技術人員已知或顯而易見的，并例如在Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th ed.，Mack PublishingCompany，Easton，PA(1990)中更詳細描述。
可給予含本發明制劑的組合物用于預防性和/或治療性治療。在治療性應用中，以足以治愈、減輕或部分抑制疾病及其并發癥的量，將組合物給予已經患有上述疾病的受治療者。足以實現該目的的用量被定義為“治療有效量”。各目的的有效量取決于疾病或損傷的嚴重程度以及受治療者的體重和一般狀況。然而，通常對于70kg受治療者而言，有效量為約0.05mg直至約500mg制劑/天，更常使用約1.0mg至約200mg制劑/天的劑量。應了解測定適宜的劑量可使用常規實驗，通過構造值的矩陣并測試矩陣中的不同點而實現。
本發明制劑的局部送遞，例如，局部應用，可通過噴霧、灌注、雙氣囊導管、或插入到血管移植物中的支架、或支架、用于涂覆氣囊導管的水凝膠或其它已經建立的方法實施。無論如何，該藥物組合物應提供足以有效治療受治療者量的制劑。
本發明的藥物組合物可進一步包括其它生物活性劑，如，非-因子VII-相關凝血劑或抗凝劑。
實驗一般方法α-木糖苷酶測定法α-木糖苷酶測定法在含有適宜底物，例如，可從相關糖蛋白(例如，rFVIIa)的O-糖肽圖獲得的O-糖肽的pH4.5的適宜緩沖液，例如，50mM醋酸鈉中進行。在可進行實驗測定的適宜時間后，通過加入例如三氟乙酸終止反應，并通過HPLC分析試驗混合物。
α-木糖基轉移酶測定法α-木糖基轉移酶測定法是在含有適宜底物，例如可從相關糖蛋白(例如，rFVIIa)的O-糖肽圖獲得的O-糖肽或按照Minamida等人所述制備的吡啶基-胺化寡糖(Minamida等人，Detection of UDP-D-xyloseα-D-xylosideα1-3xylosyltransferase activity in human hepatoma cellline HepG2.J.Biochem.120 1002-1006，1996)的適宜緩沖液，例如，10mM Hepes，pH7-2，0.1％Triton X-100，0.5mM UDP-木糖(SigmaU5875)中進行的。在可進行實驗性測定的適宜時間后，通過加入三氟乙酸終止反應，并通過HPLC分析試驗混合物。
使α-木糖苷酶和α-木糖基轉移酶測定法的時間最佳化且任選使溫度和pH最佳化。
O-葡萄糖基轉移酶測定法O-葡萄糖基轉移酶測定法按照例如Shao等人(Glycobiology 12(11)763-770 2002)所述進行。
因子VII測定法測試因子VIIa活性并由此選擇適宜的因子VIIa變體的適宜測定法可作為簡單的初步體外試驗進行。該測定法還適于選擇適宜的因子VIIA變體。
體外水解測定法可測定天然的(野生型)因子VIIa和因子VIIa變體(此后將兩者稱作“因子VIIa”)的比活性。還可對它們進行平行測定，以直接比較它們的比活性。該測定在微量滴定板(MaxiSorp，Nunc，Denmark)中進行。將產色底物D-Ile-Pro-Arg-對-硝基酰苯胺(S-2288，Chromogenix，Sweden)，終濃度1mM，加入到因子VIIa(終濃度100nM)的含0.1MNaCl，5mM CaCl2和1mg/ml牛血清白蛋白的50mM Hepes，pH7.4的溶液中。在SpectraMaxTM340平板閱讀器(Molecular Devices，USA)中連續測量405nm處的吸光度。減去不含酶的空白孔中的吸光度后，20-分鐘培育時間內產生的吸光度用于計算變體與野生型因子VIIa活性之間的比值比值＝(A405nm因子VIIa變體)/(A405nm因子VIIa野生型)基于上述比值，可鑒定出具有可與天然因子VIIa相比較的或更高活性的因子VIIa變體，例如，變體活性與天然因子VII(野生型FVII)活性之間的比值約為1，對高于1.0。
因子VIIa或因子VIIa變體的活性還可使用生理學底物，如因子X，適當地，在100-1000nM濃度下測量，其中所產生的因子Xa在加入適宜產色底物(例如，S-2765)之后測量。此外，活性測定可在生理溫度下運行。
體外蛋白酶解測定法平行測定天然的(野生型)因子VIIa和因子VIIa變體(此后將兩者稱作“因子VIIa”)，以比較它們的比活性。該測定在微量滴定平板(MaxiSorp，Nunc，Denmark)中進行。將100微升含0.1M NaCl，5mMCaCl2和1mg/ml牛血清白蛋白的50mM Hepes，pH7.4中的因子VIIa(10nM)和因子X(0.8微摩爾濃度)培育15分鐘。然后，通過加入50微升含0.1M NaCl，20mM EDTA和1mg/ml牛血清白蛋白的50mMHepes，pH7.4終止因子X裂解。所產生因子Xa的量是通過加入產色底物Z-D-Arg-Gly-Arg-對-硝基酰苯胺(S-2765，Chromogenix，Sweden)，終濃度0.5mM而測量的。在SpectraMaxTM340平板閱讀器(Molecular Devices，USA)中連續測量405nm處的吸光度。減去不合FVIIa的空白孔的吸光度后，在10分鐘內產生的吸光度用于計算變體與野生型因子VIIa蛋白酶解活性之間的比值比值＝(A405nm因子VIIa變體)/(A405nm因子VIIa野生型)。
基于上述比值，可鑒定出具有可與天然因子VIIa相比較的或更高活性的因子VIIa變體，例如，變體活性與天然因子VII(野生型FVII)活性之間的比值約為1，對高于1.0。
凝血酶產生測定法因子VII或因子VII-相關多肽(例如，變體)產生凝血酶的能力可在包含生理學濃度的所有相關凝血因子和抑制劑以及活化血小板的測定中測量(如在Monroe等人(1997)Brit.J.Haematol.99，542-547第543頁中所述，其引入此處作為參考)。
凝固測定法第一代測定法因子VII多肽的活性還可主要按照WO 92/15686或US 5,997,864中所述，使用一步凝固測定法測量。簡言之，在50mM Tris(pH7.5)，0.1％BSA中稀釋要測試的樣品，并取100μL與100μL因子VII缺失血漿和200μL含10mM Ca2+的促凝血酶原激酶C一起培育。測量凝固時間并將其與使用連續稀釋的對照標準品或含枸櫞酸鹽的正常人血漿混合物的標準曲線相比較。
第二代測定法基本上相同，除了使用重組人組織因子代替促凝血酶原激酶C以外。
因子IX測定法因子IX活性的試驗用于測試因子IX活性，并由此提供用于選擇用于本發明的適宜因子IX的方法的適宜測定法可按例如Wagenvoord等人Haemostasis1990；20(5)276-88所述作為簡單體外試驗進行。
因子IX的生物活性還可通過測量制劑校正因子IX-缺失血漿的凝固時間的能力而量化，如在Nilsson等人，1959.(Nilsson IM，BlombaeckM，Thilen A，von Francken I.，Carriers of haemophilia A-Alaboratory study，Acta Med Scan 1959；165357)中所述。在該測定法中，將生物活性表示為單位/ml血漿(1個單位相當于正常混合血漿中存在的FIX的量)。
實施例下列實施例是本發明的非-限制性舉例說明。
實施例1通過提取和純化制備α-木糖苷酶酶，α-木糖苷酶，可從各種來源制備，例如，按照Monroe等人(Plant Physiology and Biochemistry 41877-885(2003))所述從植物材料制備。例如，將來源于例如鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)的植物組織在含有2個體積緩沖液A(40mM Hepes，pH7.0，1M NaCl)的研缽中，使用石英砂研杵研磨，并以15000xg離心過濾的提取物15分鐘。加入硫酸銨至例如80％飽和。通過15000xg離心15分鐘而收集沉淀出來的蛋白，并將其再次溶于緩沖液A中。通過色譜法，例如，在Concanavalin A-Sepharose柱、陰離子交換柱和/或技術人員已知的其它色譜柱上純化α-木糖苷酶。在洗脫過程中收集各級分，并利用α-木糖苷酶測定法鑒定含α-木糖苷酶的級分。
實施例2通過在大腸桿菌(E.coli)中克隆和表達并純化而制備α-木糖苷酶編碼α-木糖苷酶的基因，其可水解α木糖苷鍵，先前已被克隆并表征，顯示與所表征的α-木糖苷酶明顯同源性的基因已在來源于多種原核生物和真核生物的基因組中被注釋。該基因序列可在數據庫如SWISS-PROT或NCBI中獲得，并且可通過PCR從各自生物的基因組DNA擴增。檢索蛋白數據庫存在α-木糖苷酶蛋白之后，選擇幾個候選物在大腸桿菌中克隆并表達。下列候選基因是基于數據庫(A)中已經存在的注釋，先前公開的表征(P)或基于對已知α-木糖苷酶的同源性分析(H)而選擇的基因tm0308(海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)A)；基因bt3085(2139 bp)和基因bt3659(2475 bp)(多形擬桿菌(Bacteroides thetaiotaomicron)A)；基因bf0551(2238 bp)和基因bf1247(2538 bp)(脆弱類桿菌(Bacteroides fragilis)A)；基因bl02681(2310 bp)(地衣型芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)H)；基因bh1905(2328 bp)(Bacillus haloduransH)，基因xylS(2196 bp)(硫磺礦硫化葉菌Sulfolobus solfataricusP)；基因yicI(2319 bp)(大腸桿菌P)。
α-木糖苷酶在大腸桿菌中克隆和表達的策略
SignalP軟件(Bendtsen，J.D.等人，J.Mol.Biol.，340783-795，2004)用于評價信號肽是否可能存在于候選酶的N-末端中。推測分泌BF0551、BF1247、BT3085、BT3659，如通過信號肽酶I裂解位點的強預測顯示的。編碼起始-甲硫氨酸的甲硫氨酸密碼子包括在第一個氨基酸的前面，在預測的裂解位點之后。
來源于多形擬桿菌(ATCC 29148D)、脆弱類桿菌(ATCC 25285D)、Bacillus haludurans(ATCC 21591D&BAA-125D)、硫磺礦硫化葉菌(ATCC 35092D)、海棲熱袍菌(ATCC 43589D)的純化基因組DNA自美國典型培養物保藏中心獲得。在大腸桿菌(K-12株衍生物)和地衣型芽孢桿菌(ATCC 28450)的情況下，基因組DNA是按照制造商的說明，使用DNeasy組織試劑盒(Qiagen)，從在LB培養基中過夜培養的細菌細胞制備的。
用于PCR擴增的正向和反向引物被設計在分別包含限制酶裂解位點NdeI(或XbaI)和XmaI的5’-末端伸展。PCR使用下列條件進行1)95℃ 3分鐘變性，2)94℃ 30秒變性，3)55 ℃或60℃ 30秒退火，4)72℃ 2分鐘伸展。步驟2-4重復15個循環。在1％溴化乙錠瓊脂凝膠上分離PCR產物，并切除凝膠中顯示合適預測大小的帶，并使用GFX DNA純化試劑盒(Amersham Pharmacia)純化。按照制造商(Invitrogen)的說明，將純化的PCR產物克隆到pCR2.1TOPO載體中。對顯示合適的限制酶裂解分布的克隆測序，以評價DNA序列。使用相關限制酶，使代表α-木糖苷酶基因的插入物從pCR2.1TOPO載體中釋放。使用相關限制酶裂解含有NdeI(和XbaI)和XmaI位點的pET11a大腸桿菌表達載體(Novagen)，并按照對于PCR產物所述純化載體部分。按照制造商的說明，使用快速連接試劑盒(Rapid Ligation Kit)(Roche)將載體和插入物連接在一起。
通過技術人員已知的化學轉化或熱激方法將連接產物轉化到大腸桿菌TOP10(Invitrogen)中。將細胞接種在LB/氨芐西林(Amp)-培養基培養平板上過夜。從平板中選擇單一集落，并在LB/Amp培養基中生長過夜。使用限制裂解酶和所釋放插入物的大小的評價，篩選各集落的純化pET質粒是否存在合適的插入物。
大腸桿菌Rosetta DE3(Novagen)是用含α-木糖苷酶基因的pET質粒轉化的并接種在chloramphinicol(Cam)/Amp LB平板上。將來源于過夜平板的細胞重懸浮于液體Cam/Amp LB培養基中，并稀釋至OD600＝0.1。繁殖液體培養基中的細胞，直到OD600＝0.4-0.8。然后使細胞平衡至18℃的溫度30分鐘，并在18℃下，使用0.5mM IPTG o/n誘導蛋白誘導。采集細胞，并將沉淀顆粒重懸浮于緩沖液(例如，25mMTris HCl pH7或10mM磷酸鉀緩沖液，pH7)中，至相當于OD600＝～10的細胞密度。在冰上聲波處理細胞3-7次15-30秒，在冰上間斷30秒。離心除去細胞碎片并測定上清液的活性。
α-木糖苷酶活性的測定評價聲波處理所得上清液的對硝基苯基α-D吡喃木糖苷(Sigma)是否存在α-木糖苷酶活性。37℃下，在緩沖液(例如，10mM鉀緩沖液，pH7或25mM Tris HCl pH7緩沖液)中，將粗酶與5mM對-硝基苯基α-D吡喃木糖苷培養1-2小時。也測定粗酶含Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52糖基化的人FVII的片段(由FVII的氨基酸殘基39-62組成的肽片段)以評價該酶是否可裂解α-1，3木糖苷鍵。與肽的培養在37℃下進行3小時或過夜。然后在培養之后，通過MALDI MS直接評價有或沒有與α-木糖苷酶培育的肽，從而評價該酶是否可從糖肽中除去0、1或2個木糖。
α-木糖苷酶的純化表達的α-木糖苷酶的部分純化是在與rFVII培育之前進行的。在適宜緩沖液(例如，10mM磷酸鹽緩沖液，pH7)中的細胞破裂之后，獲得上清液(來源于約20-50ml細胞培養物)。就來源于嗜熱菌(例如，tm0308，BH1905，XylS)的酶而言，在50-70℃加熱上清液30分鐘，在冰上冷卻10分鐘并通過15.000 G離心15分鐘而除去沉淀，以便除去熱不穩定的大腸桿菌污染物。
將該上清液無菌過濾并涂在1ml DEAE FF柱(AmershamPharmacia)上。純化是使用AKTA探測器(AmershamPharmacia)FPLC進行的，并使用下列緩沖液緩沖液A25mM磷酸鈉pH7，緩沖液B25mM磷酸鈉pH7和1M NaCl。上樣后，使用緩沖液A洗去未結合的樣品5 CV。0-100％緩沖液B的梯度用于20CV，在這過程之中，分級洗脫靶蛋白。純化之后，通過在對-硝基苯基α-D吡喃木糖苷上培育或通過SDS PAGE，測定在所得色譜圖中包含主峰的級分。將含α-木糖苷酶活性的級分在20mM Tris HCl pH7，2mMCaCl2緩沖液中稀釋，并在Vivaspin 20 50.000 MWCO柱(Vivascience)上，通過以2900rpm離心而濃縮。
絲氨酸52上僅為葡萄糖的rFVIIa的O-糖型絲氨酸52上僅為葡萄糖的rFVIIa的O-糖型是通過在適宜緩沖液，例如雙甘氨肽或20mM Tris HCl pH7.0，2mM CaCl2中，與純化的α-木糖苷酶培育適宜的時間而獲得的，該時間可實驗確定。顯現脫糖基化的質譜是通過分析rFVII α-木糖苷酶培育物ESI-MS(Q-STAR)而獲得的。
所得聚糖-重建的rFVIIa從α-木糖苷酶純化，例如通過陰離子交換色譜法或凝膠過濾或適宜組合。所制備的rFVIIa的O-糖型的純度通過rFVIIa的O-糖肽圖進行證實。
實施例3通過海棲熱袍菌推定α-木糖苷酶基因(tm0308)在大腸桿菌中克隆和表達并純化而制備α-木糖苷酶對于tm0308自始至終遵循上述策略(見實施例2)。海棲熱袍菌推定α-木糖苷酶基因(tm0308)被PCR擴增并克隆到大腸桿菌pET11a載體中。在大腸桿菌Rosetta(DE3)表達株中表達并用對-硝基苯基α-D吡喃木糖苷評價粗TM0308制劑之后，可獲得可溶性tm0308，其清楚顯示出α-木糖苷酶活性。使用DEAE FF色譜法，接著通過超濾向上-濃縮而部分純化α-木糖苷酶。以不同的酶/FVII比，將部分純化的酶與溶于25mM Tris pH7，2mM CaCl2緩沖液中的FVII在50℃培育3小時或37℃培育過夜。具有相同組成的α-木糖苷酶和rFVII，并向其中加入合成底物的對照表明，該酶在這些條件下是活性的并且在用和沒用木糖苷酶處理下在SDS-凝膠上和通過ESI-MS顯現FVII是可能的。然而，可在該第一次實驗中檢測到沒有明顯除去與Glc-O-Ser52連接的木糖。相反，觀察到從含Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52的純化還原且烷基化的FVIIa肽中除去了木糖。
實施例4通過在大腸桿菌中克隆并表達而制備α-木糖苷酶按照實施例2描述的策略，已將下列構建體克隆到pET表達載體中基因bl02681(2310 bp)(地衣型芽孢桿菌H)；基因bl1905(2328bp)(Bacillus haloduransH)、基因xylS(2196 bp)(硫磺礦硫化葉菌P)；基因yicI(2319 bp)(大腸桿菌P)。
根據上述策略該構建體將在Rosetta中表達，分離，純化并評價α-木糖苷酶活性。
將各α-木糖苷酶與rFVIIa在適宜緩沖液，例如雙甘氨肽或20mMTris HCl pH7.0，2mM CaCl2中培育適宜的時間，該時間可實驗測定，顯現脫糖基化的MS光譜可通過分析rFVIIα-木糖苷酶培育物ESI-LC-MS(Q-STAR)獲得。
通過例如陰離子交換色譜法或凝膠過濾或其適宜組合，從α-木糖苷酶中純化所得聚糖-重建的rFVIIa。所制備的rFVIIa的O-糖型的純度通過rFVIIa的O-糖肽圖加以證實。
實施例5通過在大腸桿菌中克隆并表達而制備截短的α-木糖苷酶近來解開了YicI的晶體結構。因此，表示YicI蛋白的活性、催化結構域的截短α-木糖苷酶(或其它相似的α-木糖苷酶)的克隆可是可能的且正被設計，因為較小的酶，如果是活性的，可更好地接近存在于天然rFVIIa中的Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52。從該結構預測酶中包含活性位點的結構域。編碼YicI序列該部分的基因序列是從已經存在的YicI pET11a質粒，例如通過YicI基因相關區域的PCR擴增而制備的。用于PCR的引物將和限制酶位點一起擴展，其可用于將截短的YicI基因連接到pET11a載體中。表達和純化之后，評價該截短酶的如上所述rFVIIa脫糖基化的可能性。
實施例6通過α-木糖基轉移酶處理制備絲氨酸52上僅為木糖-葡萄糖或絲氨酸52上僅為木糖-木糖-葡萄糖的rFVIIaα-木糖基轉移酶的制備酶，UDP-D-木糖β-D-葡萄糖苷α-1，3-D-木糖基轉移酶可按照Omichi等人(1997)所述，從HepG2細胞制備。簡言之，使HepG2細胞在補充有10％胎牛血清的培養基中生長。微粒體部分是通過細胞的勻化，接著離心而制備。α-木糖基轉移酶是通過色譜法純化的，例如陰離子交換柱和/或本領域技術人員已知的其它色譜柱。在洗脫過程中收集級分，并使用α-木糖基轉移酶測定法鑒定含α-木糖基轉移酶的級分。
酶，UDP-D-木糖α-D-木糖苷α1，3-木糖基轉移酶可按照Minamida等人(1996)所述從HepG2細胞制備。簡言之，使HepG2細胞在補充了10％胎牛血清的培養基中生長。微粒體部分是通過細胞的勻化，接著離心而制備。α-木糖基轉移酶是通過色譜法純化的，例如陰離子交換柱和/或本領域技術人員已知的其它色譜柱。在洗脫過程中收集級分，并使用α-木糖基轉移酶測定法鑒定含α-木糖基轉移酶的級分。
α-木糖基轉移酶測定法α-木糖基轉移酶測定法在適宜緩沖液中進行，例如，10mM Hepes，pH7.2，0.1％Triton X-100，0.5mM UDP-木糖(Sigma U5875)，其中含有適宜底物，例如，可從rFVIIa的O-糖肽圖或按照Minamida等人所述(Minamida等人，Detection of UDP-D-xyloseα-D-xylosideα1-3xylosyltransferase activity in human hepatoma cell line HepG2.J.Biocham.120 1002-1006，1996)制備的吡啶基胺化寡糖獲得的O-糖肽。該反應在適宜時間后通過加入三氟乙酸終止，所述時間可實驗測定，并通過HPLC分析測定混合物。
絲氨酸52上僅為木糖-葡萄糖的rFVIIa的O-糖型絲氨酸52上僅為木糖-葡萄糖的rFVIIa的O-糖型是通過下列方法獲得的(1)如上所述，使用木糖苷酶處理rFVIIa，(2)通過例如陰離子-交換色譜法從木糖苷酶中純化木糖苷酶處理的rFVIIa，和(3)在適宜緩沖液，例如雙甘氨肽，pH7.0，10mM氯化鈣中，培養木糖苷酶-處理的rFVIIa和純化的UDP-D-木糖β-D-葡萄糖苷α-1，3-D-木糖基轉移酶及UDP-D-木糖適宜的時間，該時間可實驗測定。例如通過陰離子-交換色譜法從UDP-D-木糖β-D-葡萄糖苷α-1，3-D-木糖基轉移酶中純化所得糖-重建的rFVIIa。所制備的rFVIIa的O-糖型的純度通過rFVIIa的O-糖肽圖加以證實。
絲氨酸52止僅為木糖-木糖-葡萄糖的rFVIIa的O-糖型絲氨酸52上為木糖-木糖-葡萄糖的O-糖型是通過下列方法獲得的(1)如上所述，使用木糖苷酶處理rFVIIa，(2)通過例如陰離子-交換色譜法從木糖苷酶中純化木糖苷酶處理的rFVIIa，(3)如上所述使用UDP-D-木糖β-D-葡萄糖苷α-1，3-D-木糖基轉移酶和UDP-D-木糖進一步處理，和(4)在適宜緩沖液，例如雙甘氨肽，pH7.0，10mM氯化鈣中，培養該產物和純化的UDP-D-木糖α-D-木糖苷α1，3-木糖基轉移酶及UDP-D-木糖適宜的時間，該時間可實驗測定。例如通過陰離子-交換色譜法從UDP-D-木糖α-D-木糖苷α1，3-D-木糖基轉移酶中純化所得糖-重建的rFVIIa。所制備的rFVIIa的O-糖型的純度通過rFVIIa的O-糖肽圖加以證實。
實施例7rFVIIa的O-糖型模式的分析rFVIIa羥鏈的胰蛋白酶肽作圖rFVIIa的O-糖型的相對含量是通過rFVIIa輕鏈的胰蛋白酶肽作圖測定的。rFVIIa被還原和烷基化，并在RP-HPLC柱上純化rFVIIa輕鏈，其中使用溶于水三氟乙酸中的乙腈梯度洗脫。純化的rFVIIa輕鏈被緩沖-交換到Tris緩沖液，pH7.5，并用胰蛋白酶消化。在RP-HPLC柱上(例如，Nucleosil C18，5μ，300 ，4.0×250mm，Macherey-Nagel 720065)分析rFVIIa輕鏈的胰蛋白酶消化物，其中使用溶于水三氟乙酸中的乙腈梯度(0％-45％乙腈，100分鐘內)洗脫(見圖2)。流速1.0ml/分，檢測是215nm UV。
約60-65分鐘之后，洗脫出含rFVIIa的O-糖肽的峰，其中第一和第三個峰包含具有與絲氨酸52連接的木糖-木糖-葡萄糖的O-糖肽，第二和第四個峰包含具有與絲氨酸52連接的葡萄糖的O-糖肽。
相似地，第一和第二個峰包含具有與絲氨酸60連接的四糖的O-糖肽，第三和第四個峰包含具有與絲氨酸60連接的巖藻糖的O-糖肽。
rFVIIa的胰蛋白酶肽作圖O-糖型模式可通過rFVIIa的胰蛋白酶肽作圖分析。rFVIIa被緩沖-交換到Tris緩沖液，pH7.5并用胰蛋白酶消化。在RP-HPLC柱(例如，Nucleosil C18，5μ，300 ，4.0×250mm，Macherey-Nagel 720065)上分析rFVIIa的胰蛋白酶消化產物，用水三氟乙酸中的乙腈梯度(0％-45％乙腈，100分鐘內)洗脫。流速1.0ml/分并在215nm UV檢測。
約67-70分鐘之后，洗脫出含rFVIIa的O-糖肽的峰，其中第一個峰包含具有與絲氨酸52連接的木糖-木糖-葡萄糖的O-糖肽，第二個峰包含具有與絲氨酸52連接的葡萄糖的O-糖肽。
rFVIIa的總質量分析O-糖型模式可通過rFVIIa的總質量分析進行分析。在用1％甲酸平衡并用90％甲醇中的3％甲酸洗脫而在Millipore ZipTip C4柱上使rFVIIa脫鹽。通過毫微噴霧技術，在Qstar XL質譜儀上分析洗脫出的樣品。
約50500 Da的主峰代表具有與絲氨酸52連接的葡萄糖的rFVIIaO-糖型，約50800 Da的主峰代表具有與絲氨酸52連接的木糖-木糖-葡萄糖的rFVIIa O-糖型。
實施例8Glc-O-Ser52-FVII和Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52-FVII的純化Glc-O-ser52-FVII和Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52-FVII是使用疏水作用色譜法(HIC)的兩次循環純化的。裝有Toso Haas TSK-Gel苯基5 PW的柱子(1.0cm內徑×7.0cm長度＝5.5ml柱體積(CV))使用5 CV 10mM組氨酸，10mM CaCl2，2.0 M NH4-醋酸鹽，pH6.0平衡。給該柱裝載約2.5mg FVII pr.ml樹脂。在裝載之前，向裝載溶液中加入2.0 M NH4-醋酸鹽和10mM CaCl2。用5 CV 10mM組氨酸，10mMCaCl2，2.0 M NH4-醋酸鹽，pH6.0洗滌該柱。使用從10mM組氨酸，10mM CaCl2，2.0 M NH4-醋酸鹽，pH6.0到10mM組氨酸，10mMCaCl2，pH6.0的20CV的線性梯度進行洗脫。純化以6 CV/h的流速在5℃下進行。在洗脫過程中收集級分。
在兩個重疊的主峰中洗脫出FVII(見圖4第一次HIC循環的色譜圖)。混合含第一個峰的級分(級分“A”，圖4)并通過HIC的第二次循環進一步純化，其中使用與第一次HIC循環相同的色譜過程(見圖5通過將級分“A”再次裝載到HIC柱上獲得的色譜圖)。充分混合含第二個峰的級分(級分“B”，圖4)并通過HIC的第二次循環進一步純化，其中使用與第一次HIC循環相同的色譜過程(見圖6通過將級分“B”再次裝載到HIC柱上獲得的色譜圖)。
鑒定通過將級分“A ”再次裝載到第二HIC步驟上獲得的峰級分，部分10中的純化Glc-O-Ser52-FVII(圖5)。鑒定通過將部分“B ”再次裝載到第二HIC步驟上獲得的峰部分，部分15中的純化Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52-FVII(圖6)。該鑒定通過實施例7中所述rFVIIa的胰蛋白酶肽作圖(圖7A和7B)和實施例7中所述rFVIIa的總質量分析(圖8A和8B)獲得。兩種分析均顯示峰部分，部分10中較高含量的Glc-O-Ser52-rFVIIa和較低含量的Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52-rFVIIa，以及峰部分，部分15中較低含量的Glc-O-Ser52-rFVIIa和較高含量的Xyl-Xyl-GIc-O-Ser52-rFVIIa。兩個峰部分中O-糖型含量的量化不能獲得，這是由于該部分中相對較低的rFVIIa含量(圖7A和7B胰蛋白酶肽作圖與O-糖肽共同-洗脫或接近洗脫的rFVIIa的其它肽片段，因此不能測定出含量低的O-糖肽含量)(圖8A和8B總質量分析rFVIIa的其它O-和/或N-糖型，例如，在質譜中出現的缺少一個N-乙酰基神經氨酸的rFVIIa的N-糖型，并且因此不能測定含量低的rFVIIa的O-糖型含量)。
從HIC獲得的峰部分的比活性(表1)是通過第一代凝固測定法測定的。發現Glc-O-Ser52-rFVIIa O-糖型具有低的比活性，而Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52-rFVIIa O-糖型具有高的比活性。
表1.使用第一代凝固測定法測定從HIC獲得的峰部分的比活性。rFVIIa的含量通過HPLC測定
實施例9通過疏水作用色譜法純化高度純化的Glc-O-Ser52-rFVIIa制劑和高度純化的Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52-rFVIIa制劑可按照上面所述，通過用疏水作用色譜法反復純化而獲得。具有較高rFVIIa含量的高度純化的Glc-O-Ser52-rFVIIa和Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52-rFVIIa制劑可通過增加原料的用量如上述進行疏水作用色譜法而獲得。具有較高rFVIIa含量的高度純化制劑中的rFVIIa的各O-糖型含量可按照實施例7中所述，通過rFVIIa輕鏈的胰蛋白酶肽作圖而量化。高度純化制劑的比活性可通過上述第一代凝固測定法測定。
權利要求
1.一種含有Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys基序并且其中所述絲氨酸/蘇氨酸形成Glc-O-Ser/Thr共價鍵的一部分的糖蛋白的制劑，其中該制劑含有實質上均勻的絲氨酸/蘇氨酸-連接的糖基化模式。
2.根據權利要求1所述的制劑，其中所述糖基化模式是至少80％均勻的，優選至少85％，至少90％，至少95％，或至少98％均勻的。
3.根據權利要求1或權利要求2所述的制劑，其中絲氨酸/蘇氨酸-連接的聚糖是Xyl-Xyl-Glc-。
4.根據權利要求1或權利要求2所述的制劑，其中絲氨酸/蘇氨酸-連接的聚糖是Xyl-Glc-。
5.根據權利要求1或權利要求2所述的制劑，其中絲氨酸/蘇氨酸-連接的聚糖是Glc-。
6.根據權利要求1至5任何一項所述的制劑，其中糖蛋白選自因子VII多肽、因子VII-相關多肽、因子IX多肽、因子X多肽、因子XII多肽和蛋白Z多肽。
7.根據權利要求6所述的制劑，其中糖蛋白為人因子VII。
8.根據權利要求6所述的制劑，其中糖蛋白為因子VII的變體并且當在如本說明書中所描述的“體外水解測定法”或“體外蛋白酶解測定法”中測試時，其中因子VII-變體的活性與天然人因子VIIa(野生型FVIIa)的活性之間的比為至少約1.25，優選至少約2.0，或至少約4.0。
9.根據權利要求6所述的制劑，其中糖蛋白選自人因子IX、因子IX序列變體。
10.一種制備權利要求1至9所述制劑的方法，其中絲氨酸/蘇氨酸-連接的聚糖是-Glc；該方法包括下列步驟(a)從制備它的細胞中；例如，從工程細胞(細胞培養物)中或通過從天然來源中分離糖蛋白，獲得含有Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys基序并且其中所述絲氨酸/蘇氨酸形成Glc-O-Ser/Thr共價鍵的一部分的糖蛋白的制劑；(b)在適于從糖蛋白中除去木糖殘基的條件下，使在步驟(a)中獲得的制劑與α-木糖苷酶接觸，由此產生具有改變的糖基化模式的糖蛋白。
11.根據權利要求10所述的方法，它還包括分離在步驟b中制備的具有葡萄糖-O-絲氨酸/蘇氨酸糖基化的糖蛋白的步驟。
12.根據權利要求10至11任何一項所述的方法，其中糖基化為絲氨酸糖基化。
13.根據權利要求10至12任何一項所述的方法，它還包括如下步驟分析與多肽連接的寡糖的結構，以測定糖型模式，并且任選地，重復步驟(b)直到獲得所需的糖型模式。
14.一種制備權利要求1至9所述制劑的方法，其中絲氨酸/蘇氨酸-連接的聚糖是Glc；該方法包括下列步驟(a)從工程細胞(細胞培養物)中或通過從天然來源中分離糖蛋白，獲得含Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys基序的多肽的制劑；(b)在適于將葡萄糖殘基從葡萄糖供體部分轉移到絲氨酸/蘇氨酸接受體部分的條件下，使在步驟(a)中獲得的制劑與O-葡萄糖基轉移酶和活化的葡萄糖供體接觸，由此產生具有改變的糖基化模式的多肽。
15.根據權利要求14所述的方法，它還包括分離步驟b中制備的具有葡萄糖-O-絲氨酸/蘇氨酸糖基化的糖蛋白的步驟。
16.根據權利要求14至15任何一項所述的方法，其中糖基化為絲氨酸糖基化。
17.根據權利要求14至16任何一項所述的方法，它還包括如下步驟分析與多肽連接的寡糖的結構，以確定糖型模式，并且，任選地，重復步驟(b)直到獲得所需的糖型模式。
18.一種制備權利要求1至9所述制劑的方法，其中絲氨酸/蘇氨酸-連接的聚糖是Xyl-Glc-；該方法包括下列步驟(a)例如從工程細胞(細胞培養物)中或通過從天然來源中分離糖蛋白，獲得含Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys基序并且其中所述絲氨酸/蘇氨酸形成Glc-O-Ser/Thr共價鍵的一部分的糖蛋白的制劑；(b)在適于將木糖殘基從木糖供體部分轉移到接受體部分的條件下，使步驟(a)中獲得的制劑與UDP-D-木糖β-D-葡糖苷α-1，3-D-木糖基轉移酶及活化的木糖基供體接觸，由此產生具有改變的糖基化模式的糖肽。
19.根據權利要求18所述的方法，它還包括分離步驟b中制備的具有木糖-葡萄糖-O-絲氨酸/蘇氨酸糖基化的糖蛋白的步驟。
20.根據權利要求18至19任何一項所述的方法，其中糖基化為絲氨酸糖基化。
21.根據權利要求18至20任何一項所述的方法，它還包括如下步驟分析與多肽連接的寡糖的結構，以確定糖型模式，并且，任選地，重復步驟(b)直到獲得所需的糖型模式。
22.根據權利要求18至21任何一項所述的方法，它還包括如下步驟在步驟(b)之前，通過使步驟(a)中獲得的制劑經歷權利要求10至13所述的方法，除去末端木糖-殘基。
23.一種制備權利要求1至9所述制劑的方法，其中絲氨酸/蘇氨酸-連接的聚糖是Xyl-Xyl-Glc-；該方法包括下列步驟(a)例如從工程細胞(細胞培養物)中或通過從天然來源中分離糖蛋白，獲得含Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys基序并且其中所述絲氨酸/蘇氨酸形成Glc-O-Ser/Thr共價鍵的一部分的糖蛋白的制劑；(b)在適于將木糖殘基從木糖供體部分轉移到接受體部分的條件下，使步驟(a)中獲得的制劑與UDP-D-木糖β-D-葡糖苷α-1，3-D-木糖基轉移酶及活化的木糖基供體接觸，由此產生具有改變的糖基化模式的糖肽；(c)在適于將木糖殘基從木糖供體部分轉移到接受體部分的條件下，使步驟(b)中獲得的制劑與UDP-D-木糖α-D-木糖苷α-1，3-木糖基轉移酶及活化的木糖基供體接觸，由此產生具有改變的糖基化模式的糖肽。
24.根據權利要求23所述的方法，它還包括在使制劑經歷步驟(c)之前，分離步驟(b)中獲得的制劑的步驟。
25.根據權利要求23至24任何一項所述的方法，它還包括分離步驟(c)中制備的具有木糖-木糖-葡萄糖-O-絲氨酸/蘇氨酸糖基化的糖蛋白的步驟。
26.根據權利要求23至25任何一項所述的方法，其中糖基化為絲氨酸糖基化。
27.根據權利要求23至26任何一項所述的方法，它還包括如下步驟分析與多肽連接的寡糖的結構，以確定糖型模式，并且，任選地，重復步驟(b)和/或步驟(c)直到獲得所需的糖型模式。
28.根據權利要求23至27任何一項所述的方法，它還包括在步驟(b)之前，通過使步驟(a)中獲得的制劑經歷權利要求10至13所述的方法，除去末端木糖-殘基的步驟。
全文摘要
本發明涉及包含具有改變的O－連接的糖基化的模式的糖蛋白，特別是因子VII，因子IX的組合物，以及制備這些的方法。
文檔編號C12N9/64GK101023180SQ200580014109
公開日2007年8月22日 申請日期2005年5月3日 優先權日2004年5月4日
發明者N·K·克勞森, D·拉斯穆森 申請人:諾和諾德醫療保健公司