專利名稱：重組的降糖肽及其生產菌株的構建和培養方法
技術領域：
本發明屬于生物技術工程領域，更具體的，本發明涉及一種由多個Exendin-4多肽或其類似物串聯而成的重組蛋白，編碼該重組蛋白的DNA序列，含該DNA序列的載體，含該載體的宿主細胞，用基因工程技術制備該重組蛋白的方法，以及該重組蛋白在制備預防或治療糖尿病的藥物中的應用。
背景技術：
促胰島素分泌肽(Exendin-4)和GLP-1具有較高的同源性，它們是目前用于治療II型糖尿病的新型藥物，在功能上其具有葡萄糖依賴性的促胰島素分泌作用，不會產生低血糖效應，能夠抑制胰高血糖素分泌，降低胃排空的速率，促進飽食感，另外，研究表明Exendin-4能增加胰島β細胞的新生和繁殖，抑制β細胞凋亡，調節外周組織葡萄糖濃度，阻止糖尿病人的病情惡化。由于Exendin-4具有優越的降血糖特性，是目前國內外重點開發的治療II型糖尿病的藥物。
Amylin公司的開發的名為Exenatide的Exendin-4藥物作為一種新型的治療II型糖尿病的藥物，2005年在美國上市，每天注射兩次，可改善血漿葡萄糖水平，抗體反應不明顯，還可降低體重。對于單獨口服糖尿病藥物二甲雙胍，磺酰尿或兩者聯合用藥均無法達到理想血糖水平的II型糖尿病患者，經Exenatide治療后，一半以上的患者達到糖尿病協會推薦的或更低的目標血糖水平，且不會引起低血糖，患者體重平均也有顯著減少。Exendin-4作為近十年來治療糖尿病的新藥，市場需求巨大，預計2007年銷售額將達到3.16億美元，到2010年將達到7.3億美元。
Exendin-4的制備方法主要有化學合成法和基因工程菌發酵生產法。目前，國外Amylin等公司一般采用化學合成的方法生產Exendin-4或其類似物，由于化學合成方法成本高，導致產品價格昂貴，所以此類藥物的開發都轉向基因工程菌生產，以實現低成本和大規模生產。
國內，上海復興醫藥研究有限公司利用基因工程手段，將Exendin-4的基因克隆至表達質粒并轉入大腸桿菌和畢赤酵母中，構建基因工程菌進行發酵培養生產Exendin-4，該項技術目前已申請了專利(專利號CN1455001A)。
上海華誼技術有限公司利用大腸桿菌表達系統表達了Exendin-4的類似物并申請了專利(專利號CN 1363559A)。
然而，目前采用基因工程手段生產的Exendin-4及其功能類似物GLP-1均具有表達量低的問題，并且，穩定性也較差，不符合工業化生產的要求。因此，本領域迫切需要在保留Exendin-4活性的基礎上對其進行結構改造或修飾、或改進Exendin-4的生產工藝，以期實現規模化低成本生產。
發明內容
本發明的目的在于提供一種降血糖多肽，其具有高的表達量以及穩定性。
本發明的目的還在于提供編碼所述降血糖多肽的基因，含有該基因的載體，以及含有所述載體或基因組中整合有所述基因的宿主細胞。
本發明的目的還在于提供所述降血糖多肽的生產方法。
在本發明的第一方面，提供一種重組蛋白，所述的重組蛋白含有式I所示的結構(X-Y)n-XI其中，X是Exendin-4多肽或其類似物；Y是連接肽，長度為1-15個氨基酸；n＝1-9；優選地，n＝2-6；更優選的，n＝2-4。
在本發明的另一優選例中，所述的連接肽具有選自下組的氨基酸序列(a)(Asp4LysGluSerAsp4Lys)m，其中m＝1-3；優選地，m＝1；(b)(Met)t，其中，t＝1-5；優選地，t＝1-3；最優選的，t＝1；(c)多克隆位點的氨基酸序列；或(d)由(a)、(b)或(c)組合形成的氨基酸序列。
在本發明的另一優選例中，在所述的重組蛋白的氨基端還包含糖基化位點或腸激酶識別序列。
在本發明的另一優選例中，所述的糖基化位點的氨基酸序列是Asn-Thr-Thr。
在本發明的另一優選例中，所述的腸激酶識別序列的氨基酸序列是Asp-Asp-Asp-Asp-Lys。
在本發明的另一優選例中，所述的Exendin-4多肽或其類似物具有SEQ IDNO3(EXA)，或SEQ ID NO1(天然Exendin-4多肽)所示的序列。
在本發明的第二方面，提供一種多核苷酸，該多核苷酸選自下組(i)編碼所述的重組蛋白的多核苷酸；或(ii)與(i)中的多核苷酸互補的多核苷酸。
在本發明的另一優選例中，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
在本發明的第三方面，提供一種載體，它含有所述的多核苷酸。
在本發明的另一優選例中，所述的載體來源于甲醇營養型重組酵母表達載體。
在本發明的第四方面，提供一種遺傳工程化的宿主細胞，它含有所述的載體；或它的基因組中整合有所述的多核苷酸。
在本發明的另一優選例中，所述的宿主細胞是甲醇營養型酵母。
在本發明的另一優選例中，所述的甲醇營養型酵母包括(但不限于)畢赤酵母(Pichia)、漢遜酵母(Hansenula)、假絲酵母(Candida)、或球擬酵母(Torulopsis)。最優選的，所述的甲醇營養型重組酵母為畢赤酵母(Pichia)。
在本發明的第五方面，提供所述的重組蛋白的用途，用于制備預防或治療糖尿病的組合物。
在本發明的第六方面，提供一種組合物，所述的組合物含有有效量(如0.0001-10wt％)的所述的重組蛋白，以及藥學上可接受的載體。
在本發明的第七方面，提供一種生產所述的重組蛋白的方法，包括步驟(1)在適合表達所述重組蛋白的條件下，培養所述的宿主細胞，獲得培養物，和(2)從培養物中分離出所述的重組蛋白。
本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
圖1A顯示了PCR擴增得到2-exa，3-exa，5-exa基因串聯體的瓊脂糖電泳結果。
圖1B顯示了PCR擴增得到1-exa基因的瓊脂糖電泳結果，其中，泳道1為marker，泳道2為陰性對照，泳道3為1-exa基因。
圖2A顯示了含有5拷貝exa基因的表達載體pEXA5的圖譜。
圖2B顯示了含有1拷貝exa基因的表達載體pEXA1的圖譜。
圖2C顯示了含有4拷貝exa基因的表達載體pEXA4的圖譜，該表達載體上4-exa基因的5’端帶有分泌信號序列α-MF和糖基化位點。
圖2D顯示了含有4拷貝exa基因的表達載體，該表達載體上4-exa基因的5’端帶有分泌信號序列α-MF，無糖基化位點。
圖3A顯示了由GS115/pEXA5表達5-EXA后，獲取上清進行蛋白電泳的結果；其中，泳道1為GS115/pPIC9K誘導48hr后的蛋白電泳結果；泳道2為Marker；泳道3GS115/pEXA5誘導48hr后的蛋白電泳結果；泳道4GS115/pEXA5誘導36hr后的蛋白電泳結果；泳道5GS115/pEXA5誘導24hr后的蛋白電泳結果；泳道6GS115/pEXA5未進行誘導的蛋白電泳結果。
圖3B顯示了GS115/pEXA3表達3-EXA后，獲取上清進行蛋白電泳的結果；其中，泳道1為GS115/pEXA3誘導0hr后的蛋白電泳結果；泳道2為GS115/pEXA3誘導12hr后的蛋白電泳結果；泳道3為GS115/pEXA3誘導24hr后的蛋白電泳結果；泳道4為GS115/pEXA3誘導36hr后的蛋白電泳結果；泳道5為GS115/pEXA3誘導48hr后的蛋白電泳結果；泳道6為GS115/pEXA3誘導55hr后的蛋白電泳結果；上樣量16μl。
圖3C顯示了GS115/pEXA2表達2-EXA后，獲取上清進行蛋白電泳的結果；其中，泳道1為GS115/pEXA2誘導0hr后的蛋白電泳結果；泳道2為GS115/pEXA2誘導24hr后的蛋白電泳結果；泳道3為GS115/pEXA2誘導36hr后的蛋白電泳結果；泳道4為GS115/pEXA2誘導48hr后的蛋白電泳結果；上樣量12μl。
圖3D顯示了GS115/pEXA1表達1-EXA后，獲取上清進行蛋白電泳的結果；其中，泳道1為Marker；泳道2為GS115/pEXA1誘導48hr后的蛋白電泳結果；泳道3為GS115/pEXA1誘導36hr后的蛋白電泳結果；泳道4為GS115/pEXA1誘導24hr后的蛋白電泳結果；泳道5為GS115/pEXA1誘導12hr后的蛋白電泳結果；泳道6為GS115/pEXA1未誘導的蛋白電泳結果；上樣量16μl。
圖4A顯示了軟件分析5-EXA所占上清總蛋白百分含量的結果，由分析結果可知，5-EXA占上清總蛋白含量的88.8％。
圖4B顯示了軟件分析3-EXA所占上清總蛋白百分含量的結果，由分析結果可知，3-EXA占上清總蛋白含量的69.0％。
圖4C顯示了軟件分析2-EXA所占上清總蛋白百分含量的結果，由分析結果可知，2-EXA占上清總蛋白含量的65.4％。
圖4D顯示了軟件分析1-EXA所占上清總蛋白百分含量的結果，由分析結果可知，1-EXA占上清總蛋白含量的39.1％。
圖5A顯示了GS115/pEXA5表達產物蛋白免疫印跡。其中，泳道1為GS115/pEXA5未進行誘導的免疫印跡結果；泳道2-泳道4為GS115/pEXA5經誘導表達的5-EXA的免疫印跡結果。
圖5B顯示了GS115/pEXA3、GS115/pEXA2表達產物蛋白免疫印跡。其中，泳道1為GS115/pEXA3經誘導表達后的免疫印跡結果；泳道2為GS115/pEXA2經誘導表達后的免疫印跡結果。
圖6A顯示了GS115/pEXA4表達4-EXA后，獲取上清進行蛋白電泳的結果；其中，泳道1為GS115/pEXA4誘導0hr后的電泳結果；泳道2為GS115/pEXA4誘導0hr+endo H處理后的電泳結果；泳道3為GS115/pEXA4誘導48hr+endo H處理后的電泳結果；泳道4為GS115/pEXA4誘導48hr后的電泳結果；泳道5-7為GS115/pEXA4誘導48hr+endo H處理后的電泳結果；泳道8為GS115/pPIC9K誘導48hr+endo H處理后的電泳結果；上樣量為12μl。
圖6B顯示了GS115/pEXA4C表達4-EXA后，獲取上清進行蛋白電泳的結果；其中，泳道1為GS115/pEXA4C誘導0hr后的電泳結果；泳道2為GS115/pEXA4C誘導24hr后的電泳結果；泳道3為GS115/pEXA4C誘導48hr后的電泳結果；泳道4為GS115/pEXA4C誘導72hr后的電泳結果；上樣量為16μl。
圖7顯示了GS115/pEXA4表達產物的蛋白免疫印記。其中泳道1為GS115/pEXA4經誘導表達后的免疫印記結果，泳道2為GS115/pEXA4誘導表達后產物經endo H處理后的免疫印記結果。
圖8A顯示5-EXA血清降解情況。純化后的5-EXA放置在人血清中，經過不同時間，取樣進行電泳，分析它的降解程度。其中泳道1為陰性對照，泳道2為37℃放置0hr，泳道3為37℃放置2hr，泳道4為37℃放置4hr，泳道5為37℃放置6hr。
圖8B顯示GLP-1血清降解情況。其中泳道1為37℃放置6hr，泳道2為37℃放置4hr，泳道3為37℃放置2hr，泳道4為37℃放置0hr。
圖8C顯示EXA血清降解情況。其中泳道1為37℃放置4hr，泳道2為37℃放置2hr，泳道3為37℃放置0hr，泳道4為陰性對照。
圖9顯示了5-EXA，EXA，GLP-1促鼠胰島細胞胰島素釋放。其中1為采用細胞培養液的空白對照，2為EXA，3為5-EXA，4為GLP-1。
具體實施例方式
針對現有技術中Exendin-4或其類似物GLP-1蛋白表達量低且穩定性差的問題，本發明人經過長期而深入的研究和試驗，首次發現由多個EXA或Exendin-4多肽串聯而成的重組多肽在保持與Exendin-4或GLP-1相當的活性的基礎上，具有比Exendin-4單體顯著更好的穩定性，并且表達量大大提高。基于此完成了本發明。
促胰島素分泌肽促胰島素分泌肽(Exendin-4)是一種最初發現于Heloderma suspectum(Gila畸形突變體)唾液分泌物中的多肽，其與哺乳動物胰高血糖素樣肽家族的一些成員相似，與GLP-1的在氨基酸序列上具有53％的同源性。所述的Exendin-4多肽具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
如本發明所用，“Exendin-4多肽類似物”是指經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的多肽。Exendin-4多肽類似物也包括在本發明中。比如，所述的Exendin-4多肽類似物的序列是對Exendin-4多肽的一個或多個保守氨基酸進行替代所形成的，所述經氨基酸替換后形成的序列并不影響其活性或保留了其大部分的活性。適當替換氨基酸是本領域的公知的技術，所述技術可以很容易地被實施并且確保不改變所得分子的生物活性。這些技術使本領域人員認識到，一般來說，在一種多肽的非必要區域改變一個或多個氨基酸基本上不會改變生物活性。見Watson等Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224。
作為本發明的一個實例，提供了一種Exendin-4多肽的類似物，本發明人將之稱為EXA多肽。所述的EXA多肽具有SEQ ID NO3所示的氨基酸序列，其編碼基因具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
重組蛋白及其編碼基因本發明提供了一種重組蛋白，所述的重組蛋白是由Exendin-4多肽或其類似物串聯而成的，其含有式I所示的結構(X-Y)n-X I式I中，X是Exendin-4多肽，或Exendin-4多肽類似物；Y是連接肽，長度為1-15個氨基酸；n＝1-9。
在構建本發明的重組蛋白時，本發明人發現，盡管多拷貝能夠顯著提高多肽的穩定性，然而當重組蛋白的序列過長時，會導致其分泌表達難度大大增加，甚至導致表達量發生顯著降低，說明重組蛋白中Exendin-4多肽或其類似物的拷貝數也不宜太多。因此，本發明所述的重組蛋白含有2-10個重復串聯的Exendin-4多肽或其類似物。作為本發明的優選方式，所述的重組蛋白含有3-7個重復串聯的Exendin-4多肽或其類似物；作為本發明的最優選的方式，所述的重組蛋白含有3-5個重復串聯的Exendin-4多肽或其類似物。
在進行串聯連接時，通常，Exendin-4多肽或其類似物按照“NH2-Exendin-4多肽或其類似物-COOH”→------→“NH2-Exendin-4多肽或其類似物-COOH”的次序同向連接。
作為本發明的更優選的方式，在所述的重組蛋白的氨基端還包含糖基化位點或腸激酶識別序列。更優選的所述的糖基化位點的氨基酸序列是Asn-Thr-Thr；所述的腸激酶識別序列氨基酸序列是Asp-Asp-Asp-Asp-Lys。所述的糖基化位點或腸激酶識別序列便于提高蛋白分泌表達的表達量。
此外，在所述的重組蛋白的氨基端或羧基端還可添加其它基本上不影響本發明所述的重組蛋白的活性、表達量和穩定性的氨基酸序列。較佳地，這些添加的氨基酸序列有利于表達(如信號肽)，有利于純化(如6×His序列、釀酒酵母α-因子信號肽切割位點(Glu-Lys-Arg))，或其它可促進所述的重組蛋白的活性、表達量或穩定性的序列。
本發明還包括編碼本發明的重組蛋白的DNA分子。所述的DNA分子可以全部人工合成，也可用PCR擴增的方法獲得。
為了進一步提高宿主細胞的表達量，可以對本發明的重組蛋白的編碼序列進行改造，例如采用宿主細胞偏好的密碼子，消除不利于基因轉錄及翻譯的序列。例如，采用了酵母偏好的密碼子，并采用計算機DNA軟件對本發明的重組蛋白基因進行檢測，排除在基因中不利于基因轉錄及翻譯的序列，包括內含子剪切位點，轉錄終止序列等。
重組蛋白的表達在獲得了編碼本發明新重組蛋白的DNA序列之后，將其克隆入合適的表達載體，再轉入合適的宿主細胞。最后，培養轉化后的宿主細胞，通過分離純化得到本發明的新的重組蛋白。
如本文所用，術語“載體”包括質粒、粘粒、表達載體、克隆載體、病毒載體等。
在本發明中，可選用本領域已知的各種載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發明新重組蛋白的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，可以形成蛋白表達載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰近，而對于分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發明中，術語“宿主細胞”包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，更佳地是酵母細胞。
作為本發明的優選方式，選擇甲醇營養型重組酵母作為本發明的重組蛋白的表達系統，其能夠高效地生產本發明的重組蛋白，且具有成本低廉、適于大規模生產等特點。
作為本發明的更優選的方式，本發明適用的菌株為采用醇氧化酶啟動子PAOX1、PAOX2甲醇營養型酵母，如畢赤酵母(Pichia)、漢遜酵母(Hansenula)、假絲酵母(Candida)或球擬酵母(Torulopsis)等。在重組酵母構建時可采用不同的表達載體(如pPIC9K等)，而且載體在酵母內可有不同存在方式(如附加型、整合型等)，所述的重組酵母可具備不同的表型(Mut+，Muts等)。
在獲得轉化的宿主細胞后，可在適合表達本發明重組蛋白的條件下培養該細胞，從而表達出重組蛋白；然后再分離出表達的重組蛋白。
在本發明的優選實例中，(1)構建了能高效表達exa基因的表達質粒根據畢赤酵母密碼子偏愛性合成exa基因，將exa基因克隆到載體pPIC9K上，并通過PCR技術在載體pPIC9K分泌信號序列3’端和exa基因5’端之間引入糖基化位點序列或腸激酶識別位點序列，構建表達載體。(2)構建了基因工程重組畢赤酵母將表達質粒經過SacI線性化以后，電轉化畢赤酵母GS115，通過His+以及G418來篩選所需要的重組酵母。(3)培養所述的重組畢赤酵母使之表達重組蛋白將能抗G4181.0mg/mL以上的基因工程重組酵母接入搖瓶中，進行搖瓶發酵，從發酵上清中獲取目的重組蛋白。
在本發明的優選實例中，采用甲醇營養型重組酵母菌株(優選畢赤酵母)生產EXA的方法為(1)菌種培養將單個新鮮菌落接種于培養液中。培養24小時。
(2)搖瓶培養將上述菌種按適當的比例(如2％-15％)接入含有培養液的搖瓶中，培養24小時后，用甲醇誘導2-3天，每天補加甲醇終濃度至1-2.5％。
當進行上述培養時，優選的菌種培養的培養液是YPD或者是BMGY培養液；優選的搖瓶培養的培養液是BSM或者是BMMY培養液。
當進行上述培養時，優選的培養溫度為25-35℃。
連接肽如本文所用，術語“連接肽”(linker)指位于各Exendin-4多肽或其類似物之間的、起連接作用的短肽。連接肽的長度沒有特別限制。連接肽的長度也可為0，此時各Exendin-4多肽或其類似物直接相連。通常，連接肽不影響或不顯著影響各Exendin-4多肽或其類似物的串聯體的氨基酸序列形成正確的折疊和空間構象。一些連接肽的例子包括(但并不限于)(a)(Asp4LysGluSerAsp4Lys)m，其中m＝1-3(優選地，m＝1)；(b)(Met)t，其中，t＝1-5(優選地，t＝1-3；最優選的，t＝1)；(c)多克隆位點所編碼的氨基酸序列，該序列通常為2-20個，較佳地2-10個氨基酸；或(d)由(a)、(b)、或(c)組合形成的氨基酸序列。
最優選地，本發明所述的重組蛋白含有(Asp4LysGluSerAsp4Lys)m。
重組蛋白的用途及其組合物本發明提供了所述重組蛋白的用途，其可被用于制備預防或治療糖尿病的組合物。
本發明還提供了一種組合物，它含有有效量(如0.0001-10wt％)的所述的重組蛋白，以及藥學上可接受的載體。
本發明的組合物可直接用于糖尿病的預防或治療。此外，還可同時與其它治療劑或輔劑聯合使用。
通常，可將本發明的重組蛋白配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。
如本文所用，術語“有效量”或“有效劑量”是指可對人和/或動物產生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。
如本文所用，“藥學上可接受的”的成分是適用于人和/或哺乳動物而無過度不良副反應(如毒性、刺激和變態反應)的，即具有合理的效益/風險比的物質。術語“藥學上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術語指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領域普通技術人員所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到關于藥學上可接受的載體的充分說明。在組合物中藥學上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質，如潤滑劑、助流劑、潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質等。
本發明的組合物含有安全有效量的所述的重組蛋白以及藥學上可接受的載體。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。通常藥物制劑應與給藥方式相匹配，本發明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行制備。所述的藥物組合物宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量。本發明的藥物制劑還可制成緩釋制劑。
本發明的主要優點在于本發明的重組蛋白是由多Exendin-4多肽或其類似物串聯而成的，其在保持與Exendin-4或GLP-1(一種Exendin-4類似物)相當的活性的基礎上，具有比Exendin-4單體或GLP-1單體更好的穩定性、且表達量大大提高。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
具體實施方式
實施例1攜帶含有腸激酶識別位點的不同拷貝exa基因的表達質粒的構建采用化學合成的方法，合成Exendin-4類似物的基因(命名為exa基因)，該基因的序列(SEQ ID NO2)如下CACGGTGAGGGTACTTTCACTTCCGACTTGTCCAAGCAAGTTGAGGAGGAGGCTGTTAGATTGTTCATTGAGTGGTTGAAGAACGGTGGTCCATCTTCCGGTGCTCCACCACCATCC其對應的氨基酸序列(SEQ ID NO3)如下HGEGTFTSDLSKQVEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS以上述全合成的exa基因為模板，利用引物進行PCR擴增，在exa基因兩端都引入腸激酶識別序列，并且腸激酶識別序列外側帶有限制性內切酶HinfI位點，HinfI酶切后的基因序列帶有非鏡像粘端，保證擴增出來的exa基因單體能按照正確方向一一首尾相連，成為多拷貝基因串聯體。其中，所用的引物如下(其中，下劃線部分為限制性內切酶HinfI位點；斜體部分為腸激酶識別序列)正向引物1(SEQ ID NO4)5’TTTGAGTCCGACGACGACGACAAGCACGGTGAGGGTACTTTCACTTC 3’反向引物1(SEQ ID NO5)5’AAAGACTCTTTATCATCATCATCGGATGGTGGTGGAGC ACCGGAA 3’將PCR得到的基因單體用HinfI酶切后，回收酶切產物進行連接反應，反應體系20μL，其中10×連接酶緩沖液2μL，T4連接酶1μL，16℃連接4hr。再以連接產物為模板，采用以下引物(其中，下劃線部分為限制性內切酶EcoR I、NotI位點)正向引物2(SEQ ID NO6)5’AAGAATTCGACGACGACGACAAGCACGGTGAGGGTACT 3’；
反向引物2(SEQ ID NO7)5’CTGCGGCCGCTTATTTATCATCATCATCGGA 3’；進行PCR反應，擴增得到不同拷貝數的exa基因串連體(每個單體片段約140bp)，并在基因串聯體兩端引入限制性內切酶位點EcoR I，Not I。將獲得的具有多拷貝的exa基因串連體進行瓊脂糖電泳，結果見圖1A和圖1B。
回收2、3、5拷貝exa基因串連體，即為2-exa、3-exa、5-exa。以exa為模板，由正向引物2，反向引物3(5’CTGCGGCCGCTTAGGATGGTGGTGG 3’(SEQ IDNO8)，下劃線部分為限制性內切酶Not I位點)擴增得到1-exa。
分別用EcoR I、Not I雙酶切1-exa，2-exa、3-exa、5-exa，插入載體pPIC9K的EcoR I、Not I位點中，得到表達載體pEXA1(圖2B)、pEXA2、pEXA3、pEXA5(圖2A)。其中，以含有1拷貝exa基因的表達載體pEXA1作為對照。
實施例2基因工程重組畢赤酵母的構建將所構建的重組質粒pEXA1至pEXA5用限制性內切酶Sac I進行線性化，經苯酚-氯仿抽提后，用乙醇沉淀回收線性化質粒片段。純化回收后的線性化質粒片段按照Invitrogen公司的Multi-copy Pichia Expression Kit說明書上的電轉化方法電轉畢赤酵母GS115(購自invitrogen公司)，電轉的條件按照Bio-RAD公司的MicroPulser電轉儀所預設的Pichia pastors程序進行。
電轉得到的菌液涂布在MD(含有1.34％酵母基礎氮源，4×10-5生物素，2％葡萄糖)平板上于30℃培養3-4天，篩選基因型His+的重組子，得到的重組子再按照Invitrogen公司的Multi-copy Pichia Expression Kit說明書上的G418篩選方法篩選得到高基因劑量的重組子GS 115/pEXA1，GS 115/pEXA2，GS115/pEXA3，GS115/pEXA5，其中以GS115/pEXA1作為對照菌。
實施例3EXA的搖瓶表達將能抗G4181.0-1.5mg/ml的基因工程重組畢赤酵母單克隆接入含5mLYPD培養基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)的試管中進行培養，培養溫度30℃，轉速220rpm。24小時以后按照2-10％的接種量接入至含25mL BSM培養基((NH4)2SO46g/L，CaSO40.46g/L，K2SO49.1g/L，MgSO4·7H2O 7.5g/L，Glycerol 20g/L，12mL/L微量元素PTM1的溶液。用0.2M的K2HPO4/KH2PO4緩沖液配制，pH5.0)的250ml搖瓶中進行培養，培養24小時后，開始補加甲醇2天，誘導EXA的分泌表達。每天用5M KOH控制pH4.0-6.0范圍，并且補加1-2.5％的甲醇。誘導2天后，取發酵液，4℃，12000rpm離心5min，取上清，用常規的考馬斯亮蘭法測定上清總蛋白。
結果測得，GS115/pEXA5、GS115/pEXA3、GS115/pEXA2發酵液上清總蛋白濃度分別達到0.32g/L，0.2g/L和0.11g/L，而對照GS115/pEXA1上清總蛋白濃度0.085g/L。
分別取GS115/pEXA5、GS115/pEXA3、GS115/pEXA2、GS115/pEXA1發酵液上清液進行膠濃度15％的蛋白電泳，結果見圖3A-D；并使用計算機掃描軟件bandscan4.5(Glyko)確定表達的EXA占上清總蛋白的百分含量，結果見圖4A-D。
GS115/pEXA5、GS115/pEXA3、GS115/pEXA2菌株EXA產量分別是0.27g/L、0.138g/L和0.07g/L，而對照1拷貝EXA產量只有0.03g/L，可見串聯融合的EXA的表達量顯著高于同樣條件下培養的1拷貝EXA的表達量。
實施例4EXA的蛋白免疫印跡將含有5拷貝、3拷貝、2拷貝EXA蛋白的發酵液上清總蛋白進行凝膠電泳后，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，采用抗GLP-1抗體(購自北京博奧森生物技術有限公司；由于GLP-1與exendin-4是功能類似物，其N端活性區域同源性高達70％，所以GLP-1具有與exendin-4同樣的抗原決定簇，可采用抗GLP-1抗體進行檢測)與發酵液上清總蛋白進行蛋白免疫雜交，并用GS115/pEXA5誘導前的發酵液上清總蛋白作為對照。
結果見圖5A-B，誘導后的上清總蛋白中相應位置出現明顯的雜交條帶，而誘導前的對照沒有，證明誘導表達后產生的目的條帶是EXA蛋白的條帶。并且，還說明，本發明獲得的5拷貝、3拷貝、2拷貝EXA蛋白保留了Exendin-4多肽的免疫活性。
實施例5糖基化4拷貝EXA表達載體的構建根據實施例1所述的方法，全基因合成4拷貝exa基因，各exa基因單元之間以甲硫氨酸密碼子ATG進行連接，并在4-exa基因兩端引入限制性內切酶位點EcoR I，Not I。利用限制性內切酶位點EcoR I，Not I將4-exa基因插入pPIC9K，得到載體pEXA4C，見圖2D。采用以下引物正向引物3(SEQ ID NO9)5’-GCGGATCCAAACGATGAGA-3’；反向引物4(SEQ ID NO10)5’-GAATTCAGTAGTGTTTACGTAAGCTTCAGC-3’；進行PCR反應，擴增pPIC9K中的分泌信號序列α-MF，從而在α-MF 3’端引入糖基化位點NTT的核苷酸編碼序列，并且改造的α-MF序列兩端含有限制性內切酶位點BamH I，EcoR I。
利用限制性內切酶位點BamH I，EcoR I，將改造的α-MF序列替換載體pPIC9K/4-exa中原有的α-MF，得到表達載體pEXA4(圖2C)。
實施例6糖基化4-EXA的搖瓶表達將實施例5中的載體pEXA4及pEXA4C按照實施例2所述的方法轉化畢赤酵母，得到轉化子GS115/pEXA4和GS115/pEXA4C，并按照實施例3所述的方法進行搖瓶表達。
誘導2-3天后，取發酵液，4℃，12000rpm離心5min，取上清，用考馬斯亮蘭法測定上清總蛋白。GS115/pEXA4上清蛋白濃度0.1g/L，GS115/pEXA4C上清蛋白濃度0.12g/L。
將各菌發酵液上清進行蛋白電泳，并且用去糖基化酶endo H對糖基化修飾的4-EXA蛋白進行去糖基化處理，以確定糖基化修飾的發生。
蛋白濃度分析表明，GS115/pEXAG4表達的糖基化4-EXA約48mg/L，見圖6A；而對照菌表達的4-EXA較少，見圖6B。可見糖基化修飾能明顯提高分泌表達。
實施例7糖基化4-EXA的蛋白免疫印跡將含有糖基化4-EXA的發酵液上清和經過去糖基化酶處理的發酵液上清總蛋白進行凝膠電泳后，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，采用抗GLP-1抗體與發酵液上清總蛋白進行蛋白免疫雜交。
免疫印跡結果表明，糖基化以及去糖基化的4-EXA蛋白都表現出陽性反應，見圖7。
實施例8串連體蛋白與單體穩定性對比GLP-1(0.1mg/mL)，EXA(0.05mg/mL)，5-EXA(0.1mg/mL)各100μL，裝于兩離心管中，各加入25μL血清，混勻，37攝氏度放置，考察蛋白在存在多種蛋白酶的體系中的穩定性。每2小時分別取樣20μL。以只加入血清，沒有加入蛋白樣品放置0hr的一組為陰性對照。
樣品進行蛋白電泳后，進行蛋白免疫印跡Western Blotting，觀察是否有降解片段，以分析穩定性。5-EXA串連體蛋白(泳道1陰性對照，泳道20hr，泳道32hr，泳道44hr，泳道56hr)在6hr仍無明顯降解；而GLP-1(泳道40hr，泳道32hr，泳道24hr，泳道16hr)在2hr時已經出現降解片段；同樣EXA(泳道4陰性對照，泳道3 0hr，泳道2 2hr，泳道1 4hr)在2hr也出現較明顯降解。結果見圖8A，B，C，可見串連體蛋白的穩定性高。
實施例9串聯體的生物活性取8周齡Wastor鼠胰腺的胰島細胞，用30％新生牛血清RMPI1640進行原代培養，培養6天，2天換液一次。
將培養好的胰島細胞分種于24孔板中，每孔1×106個細胞，每孔加入10mmol的葡萄糖。實驗組為EXA和5-EXA，濃度為10-6、10-7、10-8mol，對照組加細胞培養液，陽性對照組加入濃度為10-6、10-7、10-8mol的GLP-1。置5％的CO2培養箱中37℃孵育培養48h后，收集上清，測定胰島素含量(酶聯免疫法，胰島素測定試劑盒購自中國原子能研究院同位素研究所)，做三個平行，取均值。
結果見圖9。由圖9可見，EXA，5-EXA與GLP-1一樣具有顯著促胰島素釋放能力，從而能起到降血糖功效。
實施例10藥物組合物按以下表1配方，用常規方法制備藥物組合物
表1
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明做各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海國佳生化工程技術研究中心有限公司<120>重組的降糖肽及其生產菌株的構建和培養方法<130>067103<160>10<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>39<212>PRT<213>Heloderma suspectum<400>1His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu1 5 10 15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35<210>2<211>117<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>多肽<220>
<221>misc_feature<223>多核苷酸<400>2cacggtgagg gtactttcac ttccgacttg tccaagcaag ttgaggagga ggctgttaga60ttgttcattg agtggttgaa gaacggtggt ccatcttccg gtgctccacc accatcc 117<210>3<211>39<212>PRT
<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<223>多肽<400>3His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Val Glu Glu1 5 10 15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35<210>4<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4tttgagtccg acgacgacga caagcacggt gagggtactt tcacttc 47<210>5<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5aaagactctt tatcatcatc atcggatggt ggtggagcac cggaa 45<210>6<211>38<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6aagaattcga cgacgacgac aagcacggtg agggtact38<210>7<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>7ctgcggccgc ttatttatca tcatcatcgg a 31<210>8<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>8ctgcggccgc ttaggatggt ggtgg 25<210>9<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>9gcggatccaa acgatgaga 19
<210>10<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>10gaattcagta gtgtttacgt aagcttcagc 30
權利要求
1.一種重組蛋白，其特征在于，所述的重組蛋白含有式I所示的結構(X-Y)n-X I其中，X是Exendin-4多肽或其類似物；Y是連接肽，長度為1-15個氨基酸；n＝1-9。
2.如權利要求1所述的重組蛋白，其特征在于，所述的連接肽具有選自下組的氨基酸序列(a)(Asp4LysGluSerAsp4Lys)m，其中m＝1-3；(b)(Met)t，其中，t＝1-5；(c)多克隆位點的氨基酸序列；或(d)由(a)、(b)或(c)組合形成的氨基酸序列。
3.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，在所述的重組蛋白的氨基端還包含糖基化位點或腸激酶識別序列。
4.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的Exendin-4多肽或其類似物具有SEQ ID NO3，或SEQ ID NO1所示的序列。
5.一種多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸選自下組(i)編碼權利要求1所述的重組蛋白的多核苷酸；或(ii)與(i)中的多核苷酸互補的多核苷酸。
6.一種載體，其特征在于，它含有權利要求5所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它含有權利要求6所述的載體；或它的基因組中整合有權利要求5所述的多核苷酸。
8.權利要求1所述的重組蛋白的用途，其特征在于，用于制備預防或治療糖尿病的組合物。
9.一種組合物，其特征在于，所述的組合物含有有效量的權利要求1所述的重組蛋白，以及藥學上可接受的載體。
10.一種生產權利要求1所述的重組蛋白的方法，其特征在于，包括步驟(1)在適合表達權利要求1所述重組蛋白的條件下，培養權利要求7所述的宿主細胞，獲得培養物，和(2)從培養物中分離出權利要求1所述的重組蛋白。
全文摘要
本發明公開了一種降血糖多肽，其含有多個Exendin－4多肽或其類似物。本發明還公開了編碼所述降血糖多肽的基因，含有該基因的載體，以及含有所述載體或基因組中整合有所述基因的宿主細胞。本發明所述的降血糖多肽具有比Exendin－4單體顯著更好的穩定性，并且表達量大大提高。
文檔編號C12N15/12GK101029081SQ20071003713
公開日2007年9月5日 申請日期2007年2月5日 優先權日2007年2月5日
發明者莊英萍, 王暉, 儲炬, 張嗣良, 錢江潮, 王永紅 申請人:上海國佳生化工程技術研究中心有限公司