蠅蛆抗菌肽佐劑及其制備方法和含該佐劑的疫苗制劑及用途

蠅蛆抗菌肽佐劑及其制備方法和含該佐劑的疫苗制劑及用途
【專利摘要】本發明涉及具有免疫佐劑作用的蠅蛆抗菌肽及其制備方法和含該抗菌肽佐劑的疫苗制劑，以及它們在制備疫苗制劑中的應用。該抗菌肽是從蠅蛆中提取分離的多肽組分，可促進免疫小鼠的細胞免疫和體液免疫應答，誘生機體同時產生平衡的Th1型和Th2型免疫反應，顯示出比現有技術中已知的鋁膠佐劑更佳的佐劑特性，可以作為多種疫苗的免疫佐劑，發揮理想的免疫效果。以該抗菌肽為佐劑的疫苗制備工藝簡單、方法簡便、質量容易控制、使用方便、可冰凍保存，安全性好。
【專利說明】蠅蛆抗菌肽佐劑及其制備方法和含該佐劑的疫苗制劑及用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及從蠅蛆提取分離的具有免疫佐劑作用的蠅蛆抗菌肽，及其制備方法和含該抗菌肽佐劑的疫苗制劑，以及它們在制備疫苗制劑中的應用。
【背景技術】
[0002]疫苗接種是預防和控制傳染性疾病最經濟、有效的手段。DNA疫苗、重組疫苗和合成肽疫苗等新型疫苗是近年來發展迅速的一類生物制劑，比常規疫苗具有抗原純度高、特異性強、安全性好等優勢。然而，這些新型疫苗的免疫原性弱，免疫效力低下[OystonP， Robinso K.The current challenges for vaccine development.J Med Microbiol2012; 61(7): 889 - 894]。同此，當前疫苗研究正面臨一些復雜病原如瘧疾、結核、人免疫缺陷病毒等的重要挑戰[Leroux - Roels G.Unmet needs in modern vaccinology:Adjuvants to improve the immune response.Vaccine 2010; 28(Supp.3): C25 - 36]。佐劑是傳統疫苗和當前新型疫苗必不可少的組成成分，不僅能影響機體對疫苗免疫應答的強度，而且能針對特定病原體誘導最有效的免疫應答類型[Mbow ML, De GregorioEj Valiante NMj et al.New adjuvants for human vaccines.Current Opinion inImmunology 2010; 22(3): 411-416]。目前研究的免疫佐劑種類很多，如油佐劑、弗氏佐劑、微生物及其代謝產物、核酸及其類似物、細胞因子、脂質體等[Dey AKj Srivastava IK.Novel adjuvants and delivery systems for enhancing immune responses inducedby immunogens.Expert Rev Vaccines 2011; 10: 227 - 51]，但由于存在不同程度的毒副作用或安全隱患等一些不可避免的缺陷而難以實際應用[Mbow ML, De GregorioEj Valiante NMj Rappuoli R.New adjuvants for human vaccines.Curr OpinImmunol 2010，22(3): 411 - 6; Batista - Duharte A，Lindblad EBj Oviedo - Orta E.Progress in understanding adjuvant immunotoxicity mechanisms.Toxicol Lett2011; 203(2): 97 - 105]。鋁膠佐劑自1920s使用以來，直至最近由鋁鹽和TLR4激動劑3-O -去酰基-4’ -單磷酰脂質A組成的AS04被批準之前一直是唯一通過FDA批準的人用疫苗佐劑[Marrack P，McKee AS，Munks MW.Towards an understanding ofthe adjuvant action of aluminium.Nat Rev Immunol 2009; 9: 287 - 293]。然而，鋁膠佐劑存在一些弊端:①主要通過誘導Th2型免疫應答產生抗體起保護作用，不能誘生Thl型免疫應答和細胞介導的免疫反應，只適用于以抗體為主要保護性免疫的疫苗(Exley C， Siesjo P， Eriksson H.The immunobiology of aluminium adjuvants: howdo they really work? Trends Immunol 2010; 31: 103 - 109)熱對人免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、單純皰疹病毒、流感病毒以及血吸蟲病、百日咳和傷寒等多種抗原無佐劑作用[O，Hagan DTj De Gregorio E.The path to a successful vaccine adjuvant-‘the long and winding road，.Drug Discov Today 2009; 14: 541 - 551] 可促進IgE抗體產生，容易誘導機體產生過敏反應；④在局部形成肉芽腫，甚至發生局部無菌性膿腫；⑤因其理化性質特點，含鋁膠的疫苗怕凍，凍后鋁膠容易變性；⑥對人、畜神經系統可能有影響。因此，鋁膠佐劑已遠遠不能滿足新型疫苗發展的要求[Kool M, FierensK，Lambrecht BN.Alum adjuvant: some of the tricks of the oldest adjuvant.JMed Microbiol 2012; 61 (7): 927 - 934]。尋找安全、有效、新型的免疫佐劑是當前疫苗研究領域的一個熱點[Schijns VEJCj Lavelle EC.Trends in vaccine adjuvants.Expert Rev Vaccines 2011; 10(4): 539 - 550]。免疫佐劑研究已被列為疫苗研究的優先令頁域[Harandi AM，Medaglini Dj Shattock RJ.Vaccine adjuvants: A priority forvaccine research.Vaccine 2010; 28(12): 2363 - 2366; Harand AM，Brewe J，SchijnV.Conference Scene: Recent advancements in immunopotentiators for modernvaccines.1mmunotherapy 2011; 3(11): 1297 - 301]。
[0003]天然藥物用于防治疾病具有悠久的歷史。當今，FDA批準的藥物約30%來源于天然藥物。新的具有免疫活性的天然產物的發現日益成為研究重點，尤其在尋找新一代疫苗佐劑方面[Licciardi PVj Underwood JR.Plant - derived medicines: A novel class ofimmunological adjuvants.1nt ImmunopharmacoI 2011; 11 (3): 390 - 398]。[0004]蠅蛆為昆蟲綱雙翅目環裂亞目家蠅科家蠅ifesm domestica L.的幼蟲。蠅蛆在我國食用和藥用歷史悠久，主治臁爛、唇疔、毒痢作嘔、小兒疳積諸癥。蠅蛆的主要化學成分包括蛋白質、抗菌肽、不飽和脂肪酸、多糖、溶菌酶、凝集素、維生素和礦物質等[Feng X，Cheng Gj Chen SYj Yang H， Huang W.Evaluation of the burn healing propertiesof oil extraction from housefly larva in mice.J Ethnopharmacol 2010; 130(3):586 - 92] o 妮蛆抗菌妝具有抗氧化[Ai H，Wang F，Lei C.Antioxidant activities ofprotein - enriched fraction from the larvae of housefly, Musca domestica.NatProd Res 2008; 22(6): 507 - 15]、抗腫瘤[Hou Lj Shi Y，Zhai P，Le G.Antibacterialactivity and in vitro ant1- tumor activity of the extract of the larvae of thehousefly Qiusca domestica).J Ethnopharmacol 2007; 111 (2): 227 - 31; Jin XBjMei HF，Li XBj Ma Y，Zeng AHj Wang Y，et al.Apoptosis -1nducing activity ofthe antimicrobial peptide cecropin of Musca domestica in human hepatocellularcarcinoma cell line BEL - 7402 and the possible mechanism.Acta Biochim BiophysSin 2010; 42(4): 259 - 65; Zhu Lj Wang P，Qin QLj Zhang H，Wu YJ.Protectiveeffect of polypeptides from larva of housefly Qiusca domestica) on hydrogenperoxide -1nduced oxidative damage in HepG2 cells.Food Chem Toxicol 2013; 60:385 - 90]、抗真菌[Fu Pj Wu Jj Guo G.Purification and molecular identificationof an antifungal peptide from the hemolymph of Musca domestica (housefly).Cell Mol Immunol 2009; 6(4): 245 - 51.]、抗炎[Chu FJj Jin XBj Xu YYj Ma Y，Li XBj Lu XMj et al.1nflammatory regulation effect and action mechanismof ant1-1nflammatory effective parts of housefly Qiusca domestica) larvaeon atherosclerosis.Evid - based Complement Altern Med 2013; 2013:ArticleID 340267，10 pages]、抗動脈粥樣硬化[Chu FJj Jin XBj Zhu JY.Houseflymaggots (Musca domestica) protein - enriched fraction/extracts (PE) inhibitlipopolysaccharide -1nduced atherosclerosis pro -1nflammatory responses.JAtheroscler Thromb 2011; 18(4): 282 - 90]、保肝[Wang FR, Ai H, Chen XM, LeiCL.Hepatoprotective effect of a protein - fraction from the maggots (Muscadomestica) against CCl4 -1nduced hepatic damage.Biotechnol Letter 2007; 29:853 - 8]、抗病毒以及免疫調節[Ai H, Wang F，Zhang N, Zhang L, Lei C.Antiviral,immunomodulatory, and free radical scavenging activities of a protein - enrichedfraction from the larvae of the housefly, Musca domestica.J Insect Sci 2013;13:112.]等活性。然而，迄今蠅蛆抗菌肽作為疫苗佐劑的研究尚未見報道。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一類用于疫苗、具有免疫佐劑作用的蠅蛆抗菌肽佐劑。
[0006]本發明的另一個目的是提供從蠅蛆中提取分離蠅蛆抗菌肽佐劑的方法。
[0007]本發明的進一步目的是提供一種包含所述蠅蛆抗菌肽佐劑的疫苗制劑。
[0008]本發明的還有一個目的是提供所述蠅蛆抗菌肽佐劑在制備疫苗制劑中的應用。
[0009]本發明的蠅蛆抗菌肽佐劑是從蠅蛆中提取、分離的蠅蛆多肽組分。蠅蛆抗菌肽中蛋白質的質量百分含量為56.24%±3.9%，分子量約10 KDa0
[0010]本發明提供的蠅蛆抗菌肽是從蠅蛆中提取分離的，制備方法包括以下步驟:
a.將蠅蛆以質量濃度3%醋酸提取；
b.醋酸提取液100°C加熱Ih，4°C靜置，濾過；
c.濾液濃縮，冷凍干燥，得蠅蛆提取物；
d.蠅蛆提取物上大孔吸附樹脂柱進行色譜純化，以水和55%乙醇依次洗脫，收集55%乙醇洗脫液，濃縮，冷凍干燥，得蠅蛆抗菌肽。
[0011]上述步驟d中所說的大孔吸附樹脂為DlOl大孔吸附樹脂。
[0012]本發明的含蠅蛆抗菌肽佐劑的疫苗制劑，包含有免疫有效量的蠅蛆抗菌肽佐劑以及含有一種或多種藥物學上可接受的載體。
[0013]本發明的蠅蛆抗菌肽佐劑可在制備疫苗制劑中應用。
[0014]上文所述藥學上可接受的載體是指藥學領域的藥物載體。例如:稀釋劑、賦形劑如水、生理鹽水、葡萄糖、甘露醇、甘油、乙醇及其混合物等；填充劑如淀粉、蔗糖等；粘合劑如纖維素衍生物、海藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮；濕潤劑如甘油；崩解劑如碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進劑如季銨化合物；表面活性劑如吐溫-80 ;潤滑劑如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂和聚乙二醇等。另外還可以在組合物中加入其它輔料如香味劑、甜味劑等。
[0015]本發明的疫苗制劑可以是溶液、混懸液或乳濁液形式，可通過口服、鼻吸入、直腸、腸胃外或經皮給藥的方式施用于需要接種的對象。本發明的疫苗制劑用于口服時，可將其制成常規的固體制劑如片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊劑、丸劑、緩釋微丸、固體分散體、包含物等，制成的液體制劑如混懸劑、乳劑、溶膠劑、糖漿劑、合劑、溶液劑等；用于腸胃外給藥時，可將其制成注射用的溶液、水或油性混懸劑、乳劑、凍干粉、脂質體、微囊、微球、納米囊、納米球等。優先的形式是注射用凍干粉及溶液。
[0016]本發明的疫苗制劑可按照藥學和疫苗領域的任何常規生產方法制備。
[0017]疫苗制劑的典型單劑量可以根據制劑的形式而變化，并根據抗原種類、所需的抗體水平、接種對象的特異性及所需的免疫程序等各種因素進行確定。本發明的疫苗制劑中蠅蛆抗菌肽佐劑的量可為0.0 I Ug-1g /單劑量，優選為0.1~100 μ g/單劑量。可以一次或多次施用。
[0018]本發明的優點
本發明具有免疫佐劑作用的蠅蛆抗菌肽可促進免疫小鼠的細胞免疫和體液免疫應答，誘生機體同時產生平衡的Thl型和Th2型免疫反應，顯示出比現有技術中已知的鋁膠佐劑更佳的佐劑特性，可以作為多種疫苗的免疫佐劑，發揮理想的免疫效果。以該抗菌肽為佐劑的疫苗制備工藝簡單、方法簡便、質量容易控制、使用方便、可冰凍保存，安全性好。。所以，本發明的蠅蛆抗菌肽有望開發成疫苗佐劑。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為蠅蛆抗菌肽(MDPF)對卵清蛋白(OVA)受免小鼠血清中特異性IgG、IgGUIgG2a和IgG2b抗體效價的影響。Quil A:佐劑對照,系從南美阜樹(以/i77aj'a saponaria
樹皮中分離制備的佐劑活性總皂苷。aZX0.05、bZX0.01和7〈0.001 ks OVA對照組。
[0020]圖2為蠅蛆抗菌肽(MDPF)對Con A刺激的卵清蛋白(OVA)受免小鼠脾細胞增殖反應的影響。Quil A:佐劑對照。aZX0.05和bZX0.01 ks OVA對照組。
[0021]圖3為蠅蛆抗菌肽(MDPF)對LPS刺激的卵清蛋白(OVA)受免小鼠脾細胞增殖反應的影響。Quil A:佐劑對照。aZX0.和、bZX0.01 Ks OVA對照組組。
[0022]圖4為蠅蛆抗菌肽(MDPF)對卵清蛋白(OVA)受免小鼠脾細胞分泌IL_2能力的影響。Quil A:佐劑對照。ε/Χ0.001 KS OVA對照組。
[0023]圖5為蠅蛆抗菌肽(MDPF)對卵清蛋白(OVA)受免小鼠脾細胞分泌INF- Y能力的影響。Quil A:佐劑對照。aZX0.05、bZX0.01 和 Ψ<Λ.001 ks OVA 對照組。
[0024]圖6為蠅蛆抗菌肽(MDPF)對卵清蛋白(OVA)受免小鼠脾細胞分泌IL-10能力的影響。Quil A:佐劑對照。ε/Χ0.001 KS OVA對照組。
[0025]圖7為蠅蛆抗菌肽(MDPF)對禽流感_新城疫重組二聯活疫苗(rL_H5)受免小鼠血清中特異性IgG、IgGU IgG2a和IgG2b抗體效價的影響。Quil A:佐劑對照。aZX0.05、bZX0.01 和 cZX0.001 vs rL-H5 對照組。
[0026]圖8為蠅蛆抗菌肽(MDPF)對Con A刺激的禽流感_新城疫重組二聯活疫苗(rL-H5)受免小鼠脾細胞增殖反應的影響。Quil A:佐劑對照。a/X0.05、b/X0.01和Ψ<Λ.001vs rL_H5對照組。
[0027]圖9為蠅蛆抗菌肽(MDPF)對LPS刺激的禽流感_新城疫重組二聯活疫苗(rL_H5)受免小鼠脾細胞增殖反應的影響。Quil A:佐劑對照。aZX0.05、bZX0.01和7〈0.001 ksrL-H5對照組。
[0028]圖10為蠅蛆抗菌肽(MDPF)對H5抗原刺激的禽流感_新城疫重組二聯活疫苗(rL-H5)受免小鼠脾細胞增殖反應的影響。Quil A:佐劑對照。a/X0.05、b/X0.01和Ψ<Λ.001vs rL_H5對照組。
[0029]圖11為蠅蛆抗菌肽(MDPF)對禽流感_新城疫重組二聯活疫苗(rL_H5)受免小鼠自然殺傷(NK)細胞活性的影響。Quil A:佐劑對照。aZX0.05、bZX0.01和。/X0.001 ksrL-H5對照組。
[0030]圖12為蠅蛆抗菌肽(MDPF)對禽流感-新城疫重組二聯活疫苗(rL_H5)受免小鼠脾細胞分泌IL-2能力的影響。Quil A:佐劑對照。bZX0.01和C/X0.001 ks rL_H5對照組。
[0031]圖13為蠅蛆抗菌肽(MDPF)對禽流感-新城疫重組二聯活疫苗(rL_H5)受免小鼠脾細胞分泌INF-Y能力的影響。Quil A:佐劑對照。cZXO-OOl ks rL_H5對照組。
[0032]圖14為蠅蛆抗菌肽(MDPF)對禽流感_新城疫重組二聯活疫苗(rL - H5)受免小鼠脾細胞分泌IL-10能力的影響。Quil A:佐劑對照。cZXO-OOl ks rL_H5對照組。
【具體實施方式】
[0033]以下通過實例進一步說明本發明，而非限制其范圍。
[0034]以下百分比濃度均指質量百分比濃度。
[0035]實施例1:蠅蛆抗菌肽制備
取蠅蛆I kg，以3%醋酸水溶液于高速組織搗碎機中勻漿5 min,置4°C冰箱中放置過夜，離心，收集上清液；沉淀再以3%醋酸水溶液同法處理。合并兩次上清液，100 °C加熱I h，4°C冰箱中靜置，減壓抽濾。濾液減壓濃縮，冷凍干燥、得到蠅蛆提取物。蠅蛆提取物上DlOl大孔吸附樹脂色譜柱，用水和55%乙醇依次進行洗脫，收集55%乙醇洗脫液，減壓回收乙醇、濃縮，冷凍干燥，得蠅蛆抗菌肽。蠅蛆抗菌肽為淺黃白色粉末；茚三酮反應呈陽性；蛋白質質量百分含量為56.24%±3.9% ;分子量約10 KDa0 [0036]實施例2含蠅蛆抗菌肽佐劑的乙肝疫苗制劑
稱取蜆蛆抗菌肽500 μ g和重組乙型肝炎病毒表面抗原(rHBsAg) 100 μ g,以生理鹽水10 ml溶解，以0.22 μ m微孔濾膜濾過,無菌分裝,每支I ml。每ml含抗菌肽50 yg和rHBsAg 10 μ g。
[0037]實施例3含鋁膠和蠅蛆抗菌肽佐劑的乙肝疫苗制劑
稱取蠅蛆抗菌肽適量，以生理鹽水溶解，制成濃度為100 μ g/ml的溶液，以0.22 μ m微孔濾膜濾過。將該抗菌肽溶液與等體積的含鋁佐劑乙型肝炎病毒表面抗原疫苗原液(每ml含rHBsAg 20 μ g和氫氧化招500 μ g),混合均勻,無菌分裝,每支Iml。每ml含蜆蛆抗菌肽 50 μ g、rHBsAg 10 μ g 和氫氧化招 250 μ g。
[0038]實施例4蠅蛆抗菌肽對卵清蛋白受免小鼠免疫反應的佐劑作用
實驗方法:清潔級ICR小鼠隨機分6組，每組6只。生理鹽水對照組:每鼠注射生理鹽水(saline) 0.2 ml ;卵清蛋白(OVA)對照組:每鼠注射含OVA 25 μ g的生理鹽水0.2 ml ;Quil A對照組:每鼠注射含10 μ g Quil A和25 μ g OVA的生理鹽水0.2 ml ;蠅蛆抗菌肽實驗組:每鼠注射含蠅蛆抗菌肽(5、10、25、50 μ g)和25 μ g OVA的生理鹽水0.2 ml。各組皮下注射免疫2次，第一次免疫和第二次免疫間隔14天。二免后14天，采血，分離血清，檢測特異性抗體效價；將小鼠斷頸處死，無菌條件下取脾，制備脾細胞懸液，進行脾細胞增殖反應和細胞因子分析。
[0039]結果表明:蠅蛆抗菌肽能顯著提高OVA免疫小鼠血清中OVA特異性IgG、IgGUIgG2a和IgG2b抗體效價(圖1);增強Con A和LPS誘導的OVA受免小鼠脾細胞增殖反應(圖2~圖3);促進免疫小鼠脾細胞分泌細胞因子IL-2、INF-y和IL-10的能力(圖4~圖6)。說明蠅蛆抗菌肽不僅能促進免疫小鼠對OVA的體液免疫和細胞免疫應答，而且可誘導平衡的Thl/Th2免疫反應，對模式抗原OVA具有顯著的佐劑作用。
[0040]實施例5蠅蛆總抗菌肽對禽流感-新城疫重組二聯活疫苗的佐劑作用實驗方法:將蠅蛆抗菌肽以生理鹽水溶解制成濃度分別為0.5、1.0,2.0和3.0 mg/ml的稀釋液，以0.22 μ m微孔濾膜濾過，備用。將Quil A以生理鹽水溶解制成0.1 mg/ml的稀釋液。取商品禽流感-新城疫重組二聯活疫苗(rL-H5，500羽份/瓶)1瓶加入生理鹽水50 ml，混勻，制成疫苗稀釋液。取疫苗稀釋液與等量的生理鹽水、Quil A稀釋液、蠅蛆抗菌肽(MDPF)稀釋液，混勻，分別于第I和15天皮下注射免疫小鼠。二免后14天，采血，分離血清，進行H5抗原特異性抗體效價檢測；將小鼠斷頸處死，無菌條件下取脾，制備脾細胞懸液，進行脾細胞增殖反應、自然殺傷(NK)細胞活性和細胞因子分析。
[0041]結果表明:蠅蛆抗菌肽(MDPF)能顯著提高禽流感-新城疫重組二聯活疫苗(rL-H5)免疫小鼠血清中H5抗原特異性IgG、IgGU IgG2a和IgG2b抗體滴度(圖7);增強Con A、LPS和H5抗原誘導的受免小鼠脾細胞增殖反應(圖8~10)以及NK細胞對K562細胞的殺傷活性(圖11);促進免疫小鼠脾細胞分泌細胞因子IL-2、INF-Y和IL-10的能力(圖12~14)。說明蠅蛆抗菌肽不僅能促進免疫小鼠對禽流感-新城疫重組二聯活疫苗(rL-H5)的體液免疫和細胞免疫應答，而且可同時誘導免疫小鼠對rL-H5疫苗的Thl型和Th2型免疫反應，對禽流感-新城疫重組二聯活疫苗具有顯著的佐劑作用。
[0042] 綜上所述，本發明的蠅蛆抗菌肽具有顯著的免疫佐劑作用，可促進免疫小鼠的細胞免疫和體液免疫應答，誘生機體同時產生平衡的Thl型和Th2型免疫反應，顯示出比現有技術中已知的鋁膠佐劑更佳的佐劑特性。同時，以該抗菌肽為佐劑的疫苗制備工藝簡單、方法簡便、質量容易控制、使用方便、可冰凍保存、安全性好。因此，本發明的蠅蛆抗菌肽有望開發成疫苗佐劑。
【權利要求】
1.蠅蛆抗菌肽佐劑，其特征是從蠅蛆中提取、分離的蠅蛆多肽組分。
2.制備權利要求1所述的蠅蛆抗菌肽佐劑的方法，該方法包括以下步驟: a.將蠅蛆以質量濃度3%醋酸提取； b.醋酸提取液100°C加熱Ih，4°C靜置，濾過； c.濾液濃縮，冷凍干燥，得蠅蛆提取物； d.蠅蛆提取物上大孔吸附樹脂柱進行色譜純化，以水和55%乙醇依次洗脫，收集55%乙醇洗脫液，濃縮，冷凍干燥，得蠅蛆抗菌肽。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征是步驟d中所說的大孔吸附樹脂為DlOl大孔吸附樹脂。
4.含蠅蛆抗菌肽佐劑的疫苗制劑，其特征在于包含有免疫有效量的權利要求1所述的蠅蛆抗菌肽佐劑和藥物學上可接受的載體。
5.根據權利要求4所述的疫苗制劑，其特征在于蠅蛆抗菌肽佐劑的量為0.01 μ g~1g /單劑量。
6.根據權利要求1所述的蠅蛆抗菌肽佐劑在制備疫苗制劑中的應用。
【文檔編號】A61P37/04GK103908668SQ201410133703
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年4月3日 優先權日:2014年4月3日
【發明者】孫紅祥 申請人:浙江大學