一種能夠增強13價肺炎球菌多糖蛋白結合物免疫原性的方法

一種能夠增強13價肺炎球菌多糖蛋白結合物免疫原性的方法
【專利摘要】本發明公開了一種能夠增強13價肺炎球菌多糖蛋白結合物免疫原性的方法，通過在CRM197A中加入萬能表位肽OVAp，并采用基因重組大腸桿菌來生產含有萬能表位肽的白喉毒素變異體CRM197的A鏈的蛋白載體OVApCRM197A；然后將13種不同血清型多糖通過共價鍵連接至所述含有萬能表位肽的OVApCRM197A蛋白載體上形成13價肺炎球菌多糖-OVApCRM197A結合物；采用這種方法獲得的13價肺炎球菌多糖-OVApCRM197A結合物與不含有萬能表位肽的對應蛋白載體CRM197A獲得的13價肺炎球菌多糖-CRM197A結合物相比較，其免疫原性比對照提高了3-5倍。
【專利說明】一種能夠增強13價肺炎球菌多糖蛋白結合物免疫原性的 方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種能夠增強13價肺炎球菌多糖蛋白結合物免疫原性的方法。

【背景技術】
[0002] 當多糖以共價鍵連接至蛋白載體上時，能將半抗原的多糖轉變成全抗原，使得多 糖的免疫原性得到增強。以此方法合成的多糖蛋白結合疫苗已被廣泛地應用于小兒，成功 地預防了包括肺炎球菌、流行性腦膜炎球菌以及流行性嗜血桿菌b型等細菌的感染。
[0003] 用于合成多糖蛋白結合物的蛋白載體有多種，如破傷風類毒素、白喉類毒素、白喉 毒素變異體CRM197以及基因重組技術生產的流行性嗜血桿菌表面蛋白D等；但是，由于不 同蛋白的免疫特性，以不同蛋白載體合成的多糖蛋白結合物的免疫原性有差異，動物體免 疫后，對于由不同蛋白載體與同一種多糖合成形成的多糖蛋白結合物，所顯現的多糖免疫 原性也不同。由此可見，采用不同技術生產的蛋白載體，合成出來的多糖蛋白結合物的免疫 原性有差異。
[0004] 進入動物機體內后，抗原經抗原處理細胞（Antigen Process Cell, APC)處理 后產生表位肽（epitope) [1]，在和主要組織相容性復合物（Major Histocompatibility Complex，MHC)分子結合后，進而呈現在APC細胞表面，能夠被T淋巴細胞識別，這是免疫學 通過實驗已經得出的結論。現在知道，一個已知表位肽的免疫原性取決于三個因素：
[0005] 第一、適當表位肽的產生；
[0006] 第二、和表位肽結合的主要組織相容性復合物分子的呈現；
[0007] 第三、識別表位肽與主要組織相容性復合物形成的結合物的Τ細胞的呈現。
[0008] 其中，任何一個環節的缺少都將導致免疫應答缺失。
[0009] 用小鼠進行的試驗表明，缺乏適當的表位肽與主要組織相容性復合物形成的結合 物分子是最常導致動物體免疫響應缺失的原因。主要組織相容性復合物具有高度的多形態 性，已知的表位肽僅通過一個或者幾個等位基因（Alleles)就可結合至主要組織相容性復 合物，而不是全部表位肽片段。另外，有實驗結果顯示，由于抗原處理不適當，或者T細胞耐 受性空缺,也會導致免疫響應的缺失。
[0010] 有實驗表明，OVAp表位肽是由ISQAVHAAHAEINEAGR氨基酸序列組成[2]，可和大量 不同的主要組織相容性復合物Class II結合，顯示其能夠被T細胞識別，具有萬能免疫原 性的特性，被稱之萬能表位肽。
[0011] 萬能免疫原性表位肽具有和多個人類主要組織相容性抗原復合物Class II分子 的同型和異型體結合。這種萬能表位肽和人類主要組織相容性抗原復合物Class II分子 隨機的結合可用于開發合成疫苗，因為其能夠激活人群中的大部分個體的獲得性免疫系統 的應答。
[0012] 研究表明，OVAp表位肽由卵清蛋白的323 - 339氨基酸序列組成 (ISQAVHAAHAEINEAGR)。在含有該表位肽的卵清蛋白進入機體后，蛋白將被攝入至APC細胞 內，被消化降解。但是，這些表位肽將保存完整，在和主要組織相容性復合物結合后，被呈現 在APC細胞表面，并被T細胞識別，這表明萬能表位肽以相同的方式和多種DR分子作用。
[0013] MHC分子是加工后抗原的雜性受體，其功能是在胸腺中的免疫耐受誘導和周邊免 疫響應外來抗原的過程中，來呈現其抗原中的表位肽。因此，MHC分子必須在呈現大量的表 位肽（容許更好的抗原識別，但更多的消耗T細胞儲備），和少許表位肽（大量的T細胞儲 備，但是少許有效地呈現外來抗原）中達到平衡。也就是說，如果抗原中含有在APC細胞處 理后能夠保存完整性、并具有代表性的少量表位肽，在和MHC結合后，就能夠刺激一定量的 T細胞，來建立免疫記憶效應，而這一過程不會消耗過量的T細胞，以避免消耗大量的T細 胞，造成免疫耐受。含有這種表位肽的抗原具有更強的免疫原性，這也就解釋了為什么破傷 風類毒素具有很強的免疫原性的原因。
[0014] 現發現的大部分T細胞的刺激表位肽對于不同MHC Class II單體（haplotype) 作用有限，不同動物保存和呈現不同的抗原多肽區域（印Hopes)來刺激其T細胞。這種T 細胞刺激活性的基因限制阻礙了以合成方法來開發疫苗，而這種方法對于基因上不同的人 群的應用，應該是非常有效的方法。那些被發現具有刺激多重小鼠個體和/或與大多數人 體MHCClassII分子相關聯的T細胞刺激表位肽，提供了一個設計萬能活化T細胞的有效途 徑。在普通的蛋白抗原中加入萬能表位肽（也稱為萬能T細胞抗原簇）0VAp，能夠被大多數 動物的MHC Class II分子識別。這種T細胞抗原簇能夠用于直接誘導T細胞，或提供幫助 B細胞生產針對于弱免疫原的抗體，增強機體獲得性免疫應答的效應。
[0015] 致病性細菌通常能夠表達高分子量，包裹在細菌表面的是莢膜多糖，簡稱多糖。對 于成人來說，莢膜多糖是具有很好的免疫原性抗原，可用于制備疫苗；但是，對于小兒，即2 歲以下的嬰幼兒，莢膜多糖被認為是非依賴于T細胞抗原。實驗顯示，當用作為抗原時，莢 膜多糖可誘導野株或者T細胞缺失小鼠生產多糖特異性IgM抗體的響應；但是，并不誘導 IgM抗體向IgG抗體的轉化。人體實驗也顯示，作為疫苗，多糖可以誘導成人生產保護性抗 體，但無法誘導嬰幼兒的免疫應答；也就是說，在小兒重復免疫莢膜多糖抗原后，無第二次 抗體增強響應，也無法誘導持續的T細胞記憶。
[0016] 現代免疫學實驗證實，多糖蛋白結合疫苗和純多糖疫苗比較的優勢在于，前者能 夠誘導免疫響應。當非依賴T細胞的莢膜多糖共價鍵地連接至載體蛋白而形成的多糖蛋白 結合物，在免疫了哺乳動物后，可誘導T細胞來幫助B細胞產生針對于結合物中的多糖部分 的IgG抗體。因此，多糖蛋白結合物誘導多糖特異性抗體IgM轉化為IgG，記憶B細胞的分 化，以及長期存在的T細胞記憶。
[0017] 肺炎球菌，也稱肺炎鏈球菌，是在世界范圍內導致人類發病和死亡的主要病菌之 一，尤其在嬰幼兒、慢性心肺疾病患者、老年人以及免疫功能低下者中，易引發諸如細菌性 肺炎、腦膜炎、菌血癥和急性中耳炎等疾病。據1999年世界衛生組織（WHO)流行病學調查報 告估計，每年至少有一百萬5歲以下的嬰幼兒和兒童死于肺炎球菌所致的各種疾病。據工 業發達國家報道，2歲以下嬰幼兒的侵入性肺炎球菌性肺炎的發病率高達每十萬人中160 個病例；在歐美國家，25% - 40%的細菌性腦膜炎是由肺炎球菌引起的。美國每年約有15 萬?57萬例肺炎球菌性肺炎，2600?6200例肺炎球菌性腦膜炎，每年兩者共計造成4萬 人死亡；肺炎球菌菌血癥的發病率在15/10萬?19/10萬左右，病死率約25%?30%。另 夕卜，細菌性中耳炎中有50%?67%為肺炎球菌所致，常難以根治，復發率高，影響兒童的健 康生長發育。據統計，僅在美國每年嬰幼兒因中耳炎到醫院就診就高達七百萬人次，給醫療 系統帶來了沉重負擔。因此，當美國惠氏制藥研制成功七價肺炎多糖結合疫苗，并得到美 國FDA生產銷售許可證后，美國兒科學會的傳染病委員會以及美國免疫試驗顧問委員會于 2000年初立即建議在2歲以下的嬰幼兒以及免疫力低下的2 - 4歲的兒童中接種該疫苗。
[0018] 多項肺炎球菌的流行病學調查結果表明，不同的國家和地區，肺炎球菌的流行菌 株即血清型有所不同。以美國惠氏公司的7價肺炎球菌多糖結合疫苗為例，其疫苗在北美 的涵蓋率為80 - 90%,歐洲的涵蓋率約為70 - 80%,而在亞洲的涵蓋率僅為40 - 50%。分 析其原因所在，發達國家的肺炎球菌血清型譜的分布比較狹窄，而不發達國家的肺炎球菌 血清型譜的分布比較寬廣。這就是為什么美國惠氏公司的7價肺炎球菌多糖結合疫苗無法 在亞洲地區進行推廣應用的根本原因。根據中國以及東南亞地區近5年的臨床上0 - 5歲 的兒童，特別是2歲以下嬰幼兒的肺炎球菌的流行病學調查報告，發現有13種血清型基本 涵蓋了 80 - 90% 的流行菌株，包括 1、3、4、5、6八、68、7?、聽、14、18(：、194、19?和23?。據此， 美國輝瑞開發出來13價肺炎球菌多糖結合疫苗，歐洲的GSK開發出了 10價肺炎球菌多糖 結合疫苗。
[0019] 肺炎球菌多糖結合疫苗在預防小兒由肺炎球菌感染導致的肺炎、腦膜炎、中耳炎 等嚴重的傳染病中發揮了巨大的作用。不過，市場上現有的肺炎球菌多糖蛋白結合疫苗的 免疫原性變異性較大，這種變異性除了是由于不同血清型多糖的結構差異性的原因外，不 同免疫原性蛋白載體的使用，也是導致13價肺炎球菌多糖蛋白結合物的免疫原差異主要 原因。在某些高危人群中，比如小兒、老年人或免疫功能低下人，低免疫原性的多糖蛋白質 結合疫苗的免疫效果不佳，保護性受到限制。因此，開發出免疫原性更強的肺炎球菌多糖蛋 白結合疫苗，仍然是該領域努力的方向。


【發明內容】

[0020] 本發明的目的是提供一種能夠增強13價肺炎球菌多糖蛋白結合物免疫原性的方 法，采用基因重組技術生產的含有萬能表位肽蛋白載體〇VApCRM197A，在多糖蛋白質結合物 中引入萬能表位肽OVAp。在這種多糖蛋白結合物進入動物體后，經過抗原呈遞細胞（APC) 吞噬消化降解后，其萬能表位肽OVAp和部分肺炎球菌多糖重復單位、主要組織相容性復合 物ClassII結合，可有效地刺激T細胞，進而增強結合物中肺炎球菌多糖的免疫原性，導致 針對于肺炎球菌莢膜多糖的抗體濃度增加。
[0021] 本發明采取的技術方案如下：
[0022] -種能夠增強13價肺炎球菌多糖蛋白結合物免疫原性的方法，其特征在于：
[0023] 步驟一：在白喉毒素變異體CRM197的A鏈（簡稱CRM197A)中加入萬能表位肽 ISQAVHAAHAEINEAGR(簡稱OVAp)，通過基因重組工程菌來生產含有OVAp的CRM197A蛋白載 體（簡稱 〇VApCRM197A);
[0024] 步驟二：將13種不同血清型的肺炎球菌莢膜多糖，包括1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、 14、18C、19A、19F和23F，通過共價鍵分別與0VApCRM197A蛋白載體連接形成13種單價肺炎 球菌多糖-0VApCRM197A結合物；
[0025] 步驟三：將步驟二獲得的13種單價肺炎球菌多糖-0VApCRM197A結合物進行混合 得到免疫原性增強的13價肺炎球菌多糖蛋白結合物。
[0026] 進一步，在所述0VApCRM197A蛋白載體中含有X個0VAp，l彡X彡3。
[0027] 進一步，在所述0VApCRM197A蛋白載體中，OVAp連結在CRM197A蛋白的N -末端或 C -末端，或者同時連接在N -末端和C -末端。
[0028] 進一步，所述OVAp與CRM197A蛋白之間是通過GSGSG氨基酸序列進行連接。
[0029] 進一步，所述基因重組工程菌是通過基因重組方法構建的大腸桿菌。
[0030] 進一步，所述肺炎莢膜多糖是通過分別培養13個不同血清型的肺炎球菌獲得的 莢膜多糖。

【具體實施方式】
[0031] 下面舉例說明本發明的具體實施方法，但不僅局限于以下實例。
[0032] 第一步，載體蛋白和肺炎球菌多糖的制備
[0033] 為說明本發明的有效性，制備了兩種載體蛋白，即含有OVAp的蛋白載體 0VApCRM197A和不含OVAp的蛋白載體CRM197A。其中，CRM197A蛋白載體是用于合成對照 用13價肺炎球菌多糖-CRM197A結合物樣品。
[0034] 一、CRM197A蛋白載體和0VApCRM197A蛋白載體氨基酸序列的設計
[0035] 1、CRM197A蛋白載體氨基酸序列的設計
[0036] 白喉毒素是由帶有白喉毒素基因的β噬菌體在白喉桿菌內表達，在細菌胞漿中 存在形式為多肽，由560個氨基酸組成，分子量為62, 000道爾頓。其氨基酸序列如下：
[0037] MSRKLFASILIGALLGIGAPPSAHAGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQG NYDDDffKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTE EFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSS LSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSE SPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFA GANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELV DIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLP IAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAID⑶VTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEIS SDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS
[0038] 當分泌至細菌體外前，多肽N -末端的25個引導氨基酸序列被切除掉，變成了由 535個氨基酸組成，分子量為58kD的單鏈多肽而分泌至細菌體外，其氨基酸序列如下 ：
[0039] GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDffKGFYSTDNKYDAAGYSVDN ENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSS VEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDffDVIRDKTKTKIESLKEH GPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKT TAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNR PAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNG RKIRMRCRAID⑶VTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFF EIKS
[0040] 分泌至細菌體外的白喉毒素被酶切為A鏈和B鏈，其間由一個二硫鍵連接而形成 一個蛋白分子。這兩個多肽鏈具有不同的功能，A鏈為白喉毒素蛋白分子的N-末端片段， 分子量為21kD，由193個氨基酸組成。它是白喉毒素的毒性功能部分，通過在真核生物細胞 漿內，將二磷酸三腺苷核糖（ADP -Ribosyl)的異檸檬酸脫氫酶（NAD+)部分轉移至延伸因子 2(Elongation Factor - 2, EF - 2)上，從而抑制細胞中的蛋白質合成，進而抑制細胞生長， 造成細胞傷亡。B鏈為白喉毒素蛋白分子的C -末端片段，分子量大約為37kD，由342個氨 基酸組成。B鏈的功能是識別敏感細胞表面的特異性受體，將白喉毒素吸附在敏感細胞上， 幫助A鏈進入細胞內。
[0041] 白喉毒素的A鏈具有良好的水溶性，其氨基酸序列如下：
[0042] GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDffKGFYSTDNKYDAAGYSVDN ENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSS VEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR
[0043] 研究發現[3]，由于β噬菌體上的毒素基因 tox的突變，對于噬菌體的復制沒有影 響；但是，合成出來的毒素的毒性可能消失，或大大地降低，而形成白喉毒素突變體（Cross Reacting Material，CRM)，而且白喉毒素突變體的血清學免疫原性仍然和毒素相關聯。比 如，白喉毒素突變體CRM197,無白喉毒素的毒性，從氨基酸序列分析來看是由于A鏈中的第 52位氨基酸，由甘氨酸（Gly)突變成谷氨酸（Glu)，其氨基酸序列如下：
[0044] GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDffKEFYSTDNKYDAAGYSVDN ENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSS VEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR
[0045] 試驗研究表明，與其它現在市場上用于肺炎球菌結合疫苗合成的蛋白載體比較， 白喉毒素變異體CRM197蛋白A鏈多肽具備以下一些優勢，如其免疫原性和白喉毒素及白喉 內毒素相關聯、分子量小、水溶性高、易于生產和進行大分子合成反應。長期的白喉類毒素 疫苗的臨床使用，已經證明其安全性和有效性。
[0046] 2、含有OVAp萬能表位肽的0VApCRM197A蛋白載體氨基酸序列的設計
[0047] 將萬能表位肽OVAp連接至CRM197A蛋白載體上，構建出一種新的用于合成多糖蛋 白質結合物的蛋白載體。所用的萬能表位肽OVAp可連接至CRM197A蛋白的N -末端或C -末端；也可將兩個不同的萬能表位肽分別連接至CRM197A蛋白載體的N -末端或C -末端； 另一種方式是將兩個萬能表位肽自身連接，然后再連接至CRM197A蛋白載體N -末端或者 C -末端；還有一種方式是將一個萬能表位肽連接至C -末端或者N -末端，兩個自身連接的 萬能表位肽連接至另一端。
[0048] 2 - 1、含有萬能表位肽OVAp的0VApCRM197A蛋白載體氨基酸序列的設計
[0049] 2 - 1 - 1、OVAp - N -末端CRM197A蛋白載體（稱為OVAp - CRM197A)氨基酸序列的 設計
[0050] 通過將OVAp氨基酸序列ISQAVHAAHAEINEAGR加入至CRM197A蛋白載體的N -末 端，形成一個新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0051] ISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYD DDW
[0052] KEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVG T
[0053] EEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGN RVRR
[0054] 在OVAp氨基酸序列和CRM197A蛋白載體的N -末端間插入了 GSGSG片段來進行連 接，以此方法構建的蛋白稱為OVAp - CRM197A蛋白載體。
[0055] 2 - 1 - 2、CRM197AC -末端-OVAp蛋白載體（稱為CRM197A - OVAp)氨基酸序列的 設計
[0056] 通過將OVAp氨基酸序列ISQAVHAAHAEINEAGR加入至CRM197A蛋白載體的C -末 端，形成另一種新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0057] MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVD NENPLSGKAGGWKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRF ⑶ GASRWLSLPFAEGSS SVEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGR
[0058] 在OVAp氨基酸序列和CRM197A蛋白載體的C -末端間插入了 GSGSG片段來進行連 接，以此方法構建的蛋白稱為CRM197A - OVAp蛋白載體。
[0059] 2 - 1 - 3、OVAp - N -末端 CRM197AC -末端-OVAp 蛋白載體（稱為 OVAp - CRM197A - OVAp)氨基酸序列的設計
[0060] 通過將兩個OVAp氨基酸序列ISQAVHAAHAEINEAGR分別加入至CRM197A蛋白載體 的N -末端和C -末端，形成一種新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0061] ISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYD DDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFI KRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGISQ AVHAAHAEINEAGRL
[0062] 在OVAp氨基酸序列和CRM197A蛋白載體的N -末端和C -末端之間插入了 GSGSG 片段來進行連接，以此方法構建的蛋白稱為OVAp - CRM197A - OVAp蛋白載體。
[0063] 2 - 1 - 4、OVAp - OVAp - N -末端 CRM197A 蛋白載體（稱為 OVAp - OVAp - CRM197A) 氨基酸序列的設計
[0064] 通過將兩個OVAp氨基酸序列ISQAVHAAHAEINEAGR自身連接，然后再加入至 CRM197A蛋白載體的N -末端，形成一種新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0065] ISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKP GYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETI KKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMY EYMAQACAGNRVRR
[0066] 在兩個自身連接的OVAp氨基酸序列之間，以及和CRM197A蛋白載體的N -末端間 插入了 GSGSG片段來進行連接，以此方法構建的蛋白稱為OVAp - OVAp - CRM197A蛋白載體。
[0067] 2 - 1 - 5、CRM197AC -末端-OVAp - OVAp 蛋白載體（稱為 CRM197A - OVAp - OVAp) 氨基酸序列的設計
[0068] 通過將兩個OVAp氨基酸序列ISQAVHAAHAEINEAGR自身連接，然后再加入至 CRM197A蛋白載體的C -末端，形成一種新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0069] GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDN ENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSS VEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGISQ AVHAAHAEINEAGR
[0070] 在兩個自身連接OVAp氨基酸序列之間，以及和CRM197A蛋白載體的C -末端間插 入了 GSGSG片段來進行連接，以此方法構建的蛋白稱為CRM197A - OVAp - OVAp蛋白載體。
[0071] 2 - 1 - 6、OVAp - OVAp - N -末端 CRM197AC -末端-OVAp 蛋白載體（稱為 OVAp - OVAp - CRM197A - OVAp)氨基酸序列的設計
[0072] 通過將兩個OVAp氨基酸序列ISQAVHAAHAEINEAGR自身連接，然后再加入至 CRM197A蛋白載體的N -末端；另外，將一個OVAp加入至CRM197A蛋白載體的C -末端，形 成另一種新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0073] ISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKP GYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETI KKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMY EYMAQACAGNRVRRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGR
[0074] 在兩個自身連接OVAp氨基酸序列之間，以及和CRM197A蛋白的C -末端間插入了 GSGSG片段來進行連接，以此方法構建的蛋白稱為OVAp - OVAp - CRM197A - OVAp蛋白載體。
[0075] 2 - 1 - 7、OVAp - N -末端 CRM197AC -末端-OVAp - OVAp 蛋白載體（稱為 OVAp - CRM197A - OVAp - OVAp)氨基酸序列的設計
[0076] 通過將一個OVAp氨基酸序列ISQAVHAAHAEINEAGR連接至CRM197A蛋白載體的N -末端；另外，將兩個OVAp進行自身連接，然后再加入至CRM197A蛋白載體的C -末端，形成 另一種新的蛋白，其氣基酸序列如下：
[0077] ISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYD DDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFI KRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGISQ AVHAAHAEINEAGRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGR
[0078] 在兩個自身連接OVAp氨基酸序列之間，以及和CRM197A蛋白載體的C -末端間插 入了 GSGSG片段來進行連接，以此方法構建的蛋白稱為OVAp - CRM197A - OVAp - OVAp蛋白 載體。
[0079] 二、CRM197A蛋白載體和含有萬能表位肽的0VApCRM197A蛋白載體表達質粒的構 建
[0080] 1、CRM197A蛋白載體表達質粒的構建
[0081] 從GenBank獲取CRM197蛋白完整氨基酸序列PRF:224021，確定CRM197蛋白的A 鏈片段，CRM197的氨基酸1 - 193為CRM197的A鏈片段。以此為依據，對該片段的氨基酸 的核酸序列進行優化，以便在大腸桿菌表達系統中高效表達。采用自制的表達質粒，用Ndel 酶識別質粒位點CATATG，BamHI酶識別位點
[0082] GGATCC。經過對CRM197A的基因序列進行分析，在序列內，無 Nde I及Bam HI酶 切位點。CRM197A蛋白基因合成序列如下：
[0083] CATATG
[0084] GGTGCGGACGACGTTGTGGACTCCTCAAAATCGTTTGTCATGGAAAACTT
[0085] CAGCTCTTAT
[0086] CATGGCACCAAACCGGGTTACGTGGACTCCATTCAGAAGGGCATCCAAAA
[0087] ACCGAAGTCA
[0088] GGCACCCAGGGTAACTACGATGACGATTGGAAGGAATTCTACAGCACGGA
[0089] CAATAAGTAT
[0090] GATGCGGCCGGCTACTCTGTTGACAACGAAAATCCGCTGAGTGGTAAAGC
[0091] AGGCGGTGTG
[0092] GTTAAGGTCACCTATCCGGGTCTGACGAAAGTTCTGGCGCTGAAGGTCGA
[0093] TAACGCCGAA
[0094] ACCATTAAAAAGGAACTGGGCCTGTCTCTGACCGAACCGCTGATGGAACA
[0095] AGTGGGTACG
[0096] GAAGAATTTATCAAACGTTTCGGCGATGGTGCATCGCGTGTCGTGCTGAG
[0097] CCTGCCGTTT
[0098] GCTGAAGGCAGTTCCTCAGTGGAATACATTAACAATTGGGAACAAGCAAA
[0099] AGCTCTGTCA
[0100] GTTGAACTGGAAATCAATTTCGAAACGCGTGGCAAACGCGGTCAAGATGC
[0101] TATGTATGAA
[0102] TATATGGCTCAGGCGTGTGCGGGCAATCGCGTCCGTCGCTAA
[0103] GGATCC
[0104] 將空白質粒和合成的CRM197A蛋白基因的PCR產物中，分別加入Nde I酶和Bam HI酶進行雙酶切反應；純化后，在連接體系中加入T4連接酶進行連接，完成后純化表達質 粒，并用PCR鑒定體系及酶切圖譜進行鑒定。用BL21(DE3)感受態細胞，將表達質粒轉化至 細胞內，篩選克隆。獲得陽性表達工程菌后，建立種子庫，包括主種子和工作種子，并儲存 于-20°C以下冰箱中。
[0105] 2、含有萬能表位肽的0VApCRM197A蛋白載體表達質粒的構建
[0106] 2 - 1、OVAp - CRM197A蛋白載體表達質粒的構建
[0107] 采用自制的空白表達質粒，用Nde I酶識別質粒位點CATATG，Bam HI酶識別位點 GGATCC。經過對OVAp -CRM197A蛋白載體基因序列進行分析，在序列內，無 Nde I及Bam HI 酶切位點。OVAp - CRM197A基因合成全序列如下：
[0108] CATATG
[0109] ATCAGCCAAGCGGTTCACGCAGCCCACGCCGAAATTAACGAAGCGGGTCG
[0110] CGGTAGCGGT
[0111] TCTGGCGGTGCAGACGATGTTGTTGACTCCAGCAAATCATTCGTCATGGA
[0112] AAACTTTAGC
[0113] TCTTATCATGGCACCAAACCGGGTTACGTGGACTCCATTCAGAAAGGCAT
[0114] CCAAAAACCG
[0115] AAATCAGGCACCCAGGGTAACTATGATGACGATTGGAAAGAATTCTACTC
[0116] TACGGACAAC
[0117] AAATACGATGCGGCCGGCTACTCTGTTGACAACGAAAATCCGCTGAGTGG
[0118] TAAAGCAGGC
[0119] GGTGTGGTTAAAGTCACCTATCCGGGTCTGACGAAAGTTCTGGCGCTGAA
[0120] AGTCGATAAC
[0121] GCCGAAACCATCAAAAAAGAACTGGGCCTGTCGCTGACCGAACCGCTGAT
[0122] GGAACAAGTG
[0123] GGTACGGAAGAATTTATCAAACGTTTCGGCGATGGTGCATCGCGTGTCGT
[0124] GCTGAGCCTG
[0125] CCGTTTGCTGAAGGCAGTTCCTCAGTGGAATACATTAACAATTGGGAACA
[0126] AGCAAAAGCT
[0127] CTGAGTGTTGAACTGGAAATCAATTTCGAAACGCGTGGTAAACGCGGTCA
[0128] GGACGCAATG
[0129] TATGAATATATGGCCCAGGCTTGTGCAGGCAACCGTGTTCGCCGTTAA
[0130] GGATCC
[0131] 將空白質粒和合成的OVAp - CRM197A蛋白基因的PCR產物中，分別加入Nde I酶 和Bam HI酶進行雙酶切反應；純化后，在連接體系中加入T4連接酶進行連接，完成后純化 表達質粒，并用PCR鑒定體系及酶切圖譜進行鑒定。用BL21(DE3)感受態細胞，將表達質 粒轉化至細胞內，篩選克隆，并用PCR鑒定體系及酶切圖譜進行鑒定。獲得陽性表達工程菌 后，建立種子庫，包括主種子和工作種子，并儲存于-20°C以下冰箱中。
[0132] 2 - 2、其它0VApCRM197A蛋白載體表達質粒的構建
[0133] 根據上節"2 - 1、OVAp - CRM197A蛋白載體表達質粒的構建"方法構建 下列 0VApCRM197A 蛋白載體表達質粒：CRM197A - OVAp、OVAp - CRM197A - OVAp、 OVAp - OVAp - CRM 197A、CRM 197A - OVAp - OVAp、OVAp - OVAp - CRM 197A - OVAp 以及 OVAp - CRM197A - OVAp - OVAp。
[0134] 三、含有萬能表位肽0VApCRM197A蛋白載體和CRM197A蛋白載體的制備
[0135] 本發明的實驗結果表明，CRM197A蛋白載體和含有萬能表位肽的0VApCRM197A 蛋白載體的特性相似；因此，這些蛋白載體的純化方法相似，以下以含有萬能表位肽的 0VApCRM197A蛋白載體為例說明方法。
[0136] 1、表達含有萬能表位肽0VApCRM197A蛋白載體工程菌的制備
[0137] 用分子生物學標準方法將各個表達蛋白載體的質粒轉入至感受態細胞內，并進行 表達檢定。篩選出蛋白表達量高，并且通過用抗血清檢定合格的克隆，建立主種子庫和工作 種子庫。
[0138] 2、含有萬能表位肽0VApCRM197A蛋白載體表達工程菌的發酵
[0139] 從大腸桿菌工程菌工作種子庫低溫冰箱中，取出一含有萬能表位肽0VApCRM197A 蛋白載體的工作種子管，在室溫下解凍；將種子管中的菌液無菌轉移至50毫升的培養基 中，在37°C，搖速為180rpm的搖床中培養至0D_ = 1. 0左右；將菌液無菌接種至1升的培 養基中，在37°C，搖速為180rpm的搖床中培養至0D_ = 1. 0左右；接種種子液至50升發 酵罐中的20升培養基中，在37°C下，240rpm條件下進行發酵，當0D6(?至7 -8時，加入IPTG 誘導重組蛋白在細菌中合成；發酵至14小時后，停止發酵，離心，收集菌體待用。
[0140] 3、含有萬能表位肽的0VApCRM197A蛋白載體的純化
[0141] 由于構建含有不同萬能表位肽的蛋白載體都是以CRM197A為主體，實驗表明，盡 管加入了萬能表位肽，但對蛋白純化的參數影響不大，只需要在純化CRM197A蛋白載體的 工藝參數上進行一些修飾，就可建立起其他含有萬能表位肽的〇VApCRM197A蛋白載體的純 化方法。
[0142] 稱重50g濕菌體于2升離心杯中，加入300mllxPBSpH7. 0緩沖液混懸菌體，在磁力 攪拌器上攪拌混勻30min ;在4°C下，4000rpm，離心20min，棄上清，收集菌體；重復該步驟兩 次；加入300mllxPBSpH7. 0至菌體離心管，在均質機上進行破碎；在4°C下，lOOOOrpm，離心 20min ;收集沉淀，棄上清液；加入300mllXPBSpH7. 0緩沖液，在磁力攪拌器上攪拌30min ; 在4°C下，4000rpm，離心20min ;棄上清液，收集包涵體，加入900ml變性緩沖液至洗漆后的 包涵體，在25°C下，lOOOOrpm離心30min，收集上清液，棄沉淀；將離心上清液轉移至6 -8KD 透析袋中，封閉透析袋；置透析袋于10升復性緩沖液1中，室溫下，在磁力攪拌器上攪拌透 析過夜；次日將透析袋轉入10升復性緩沖液2中，室溫攪拌透析8 - 10小時；將透析袋轉 入10升復性緩沖液3中，室溫攪拌透析過夜；次日將透析袋轉入10升復性緩沖液4中，室 溫攪拌透析8 -10小時；將透析袋轉入10升復性緩沖液5中，室溫攪拌透析過夜；次日將透 析袋轉入2升儲備緩沖液中，室溫攪拌透析8 - 10小時；更換儲備緩沖液二次，室溫透析過 夜；取lml透析液，室溫12000rpm離心10min,收集上清，測蛋白質濃度；將蛋白溶液上樣至 預先平衡的DEAE膠柱，用等梯度洗脫，并收集目的蛋白峰；然后上樣至Phenyl疏水柱進一 步純化，收集洗脫峰；最后上樣SP膠柱，收集洗脫峰；將收集獲得的純化目的蛋白轉至透析 袋中，在0. 15M的氯化鈉中透析，完成后轉移至4°C下儲存待用。
[0143] 四、細菌莢膜多糖的制備
[0144] 本發明對肺炎球菌的13種血清型肺炎球菌莢膜多糖，包括1、3、4、5、6A、6B、7F、 9V、14、18C、19A、19F和23F，進行純化，以便用于多糖結合物的合成，其質量達到WHO合成 多糖蛋白結合疫苗的多糖質量標準。
[0145] 1、肺炎球菌種子庫的建立
[0146] 從ATCC購買的13個血清型肺炎球菌，包括1(貨號：9163)、3(貨號：10813)、 4(貨號：BAA - 334)、5(貨號：BAA - 341)、6A(貨號：BAA - 659)、6B(貨號：700675)、7F(貨 號：10351)、9V(貨號：700671)、14(貨號：6314)、18C(貨號：10356)、19A(貨號：700673)、 19F(貨號：700905)和23F(貨號：700669)。取出ATCC購買的菌種（原始種子批），加入 0. 5ml的肺炎球菌AHC液體培養基將菌種混勻，取0. 25ml菌液于5 %羊血AHC培養液中。接 種后的5%羊血AHC培養液管置于36°C ± 1°C的培養搖床上，搖速120rpm，培養12 - 20小 時。待〇D_至1. 0時，用接種環將5 %羊血AHC培養液接種至AHC瓊脂培養基平皿上，置于 36°C ±1°C的培養箱內培養12 -20小時。用接種環將AHC瓊脂平皿上的1至數個菌落接種 于10ml的AHC培養液中，置于36°C ± 1°C，在培養搖床上培養12小時，搖速150 - 200rpm。 培養液中細菌〇D_長到1. 0,取出5ml細菌AHC培養液接種到200ml的新鮮AHC培養液中， 置于36°C ± 1°C的培養搖床上培養12小時左右，搖速150 - 200rpm。0D6(i(i至1. 0時，將細 菌培養液以lml分裝于200個小試管中，離心（4000rpm，10min)，去除上清培養液，然后加入 0. 5ml的新鮮AHC培養液和0. 5ml的無菌脫脂牛奶，混勻，在乙醇干冰上快速冷凍。真空凍 干，編號，作為主種子批保存于4°C冰箱內。取出主種子批建立，按照主種子建立方法，將細 菌培養液接種到另一個200ml的新鮮AHC培養液中，置于36°C ±1°C的培養搖床上培養12 小時左右，搖速150 -200rpm。待0D_至1. 0時，將細菌培養液以lml分裝于200個小試管 中，離心（4000rpm，10min)，去除上清培養液，然后加入0. 6ml的新鮮AHC培養液和0. 4ml的 40%甘油溶液，混勻。速凍于干冰上，作為工作種子保存于-70°C低溫冰箱中。
[0147] 2、肺炎球菌的發酵
[0148] 從種子庫中取出凍干工作種子管，加入lmlAHC富集培養液溶解凍干細菌。將溶 解的菌液接種于5mlAHC富集培養液試管中，在C0 2培養箱中靜置培養過夜。觀察有細菌 生長時，將菌液接種于l〇〇ml的AHC富集培養液三角瓶中。置培養瓶于搖床中，36°C下， 200rpm/min培養至0D 6(?為1. 0。將100ml細菌培養液分別接種于2個裝有1 -升的AHC富 集培養液瓶中。置培養瓶于搖床中，36°C下，200rpm/min培養至0D6(?為1.0。將35升的無 菌過濾AHC富集培養液注入50升發酵罐中。接種2升0D為1的菌液至發酵罐中。當細菌 生長到達平臺期，殺菌，收獲培養上清液。
[0149] 3、莢膜多糖的純化
[0150] 用深層濾膜過濾，進一步去除殘存細菌及碎片。將無菌的上清培養液用l〇〇Kd超 濾膜超濾濃縮十倍（約600ml)。以6升25mM醋酸鈉溶液進行超濾清洗。加入HB儲存液 使得最終濃度為1% (w/v)，混勻，將溶液放置于冷庫過夜。離心，4000rpm，l小時，收集多 糖/HB沉淀，擯棄離心液。加入25mM的sodium acetate+1 % HB至多糖/HB沉淀容器中，攪 拌懸浮沉淀，離心，4000rpm，1小時，收集多糖/HB沉淀，擯棄離心液。重復3次該步驟。用 600ml的0. 25M氯化鈉溶液溶解沉淀。離心，4000rpm，1小時，丟棄不溶的核酸污染物。加 入10%碘化鉀溶液入多糖+HB混合溶液中，混勻，碘化鉀最終濃度為0. 5%，將溶液置于冷 庫中過夜。用深層過濾器過濾溶液，除去溶液中的HB/Ι沉淀，并用0. 25M氯化鈉/0. 5%碘 化鉀溶液清洗深層過濾器上的沉淀，收集過濾液，棄去沉淀。將粗制的多糖溶液通入活性炭 深層過濾器進行循環過濾30分鐘（4%活性炭/0. 5mg/ml多糖粗制溶液）。加入磷酸鈉緩 沖液pH6. 8,最終濃度25mM加入到多糖溶液中。將以上溶液過HA柱（50 - 100ml)，循環30 分鐘。用相同磷酸鹽溶液洗柱4-5個柱體積。用30Kd膜超濾濃縮多糖溶液5-倍，用無熱 源水超濾清洗多糖溶液。用0.22 μ m膜過濾，凍干。
[0151] 第二步：13種血清型單價肺炎球菌多糖-0VApCRM197A結合物的制備
[0152] 不同肺炎球菌血清型莢膜多糖的化學結構中含有不同的基團，需要采用不同的 合成方法將多糖共價鍵地連接至蛋白載體形成結合物，并且不同方法合成的結合物的產 量和免疫原性有所不同。本發明根據實驗結果，采用三種合成方法，即還原胺法、CDAP法 (1 - (3 -二甲基氨基丙基）-3 -乙基碳化二亞胺鹽酸鹽法）和ADH法（己二酰二肼法）， 來合成特定的多糖蛋白結合物。
[0153] -、13種肺炎球菌血清型莢膜多糖-OVAp - CRM197A結合物的合成
[0154] 1、肺炎球菌血清型1莢膜多糖-OVAp - CRM197A蛋白結合物合成
[0155] 稱取5mg的Pnl降解多糖于反應瓶中，量取0. 5ml的lmol/LNaCl加入反應瓶中；磁 力攪拌使多糖完全溶解。記錄多糖溶液的初始pH，分別量取適量的CDAP溶液，加入反應瓶 中。室溫下攪拌反應1. 5min，30s時測定溶液的pH。1. 5min后，用0. 2mol/LNa0H調節溶液 的pH至9. 5,室溫下攪拌反應3min (用0· 2mol/LNa0H維持pH在9. 5)。3min后立即向反應 瓶中加入5mg的OVAp -CRM197A蛋白，在室溫下（25°C )攪拌反應lh。量取37. 5μ 12mol/L 賴氨酸加入反應瓶中，用〇. 1NHC1調節溶液pH至9.0。室溫下攪拌反應30min，將反應瓶轉 移到4°C下反應過夜。將反應混合物轉移至透析袋（MWC06 - 8000)中，在4°C下，對0. 85% NaCl溶液透析3次，6L/次。透析結束后將反應混合液lOOOOrpm，離心10min后取上清液， 采用SepharoseCL - 4B凝膠柱純化透析后的多糖結合物，并收集結合物峰，取樣送檢。
[0156] 2、肺炎球菌血清型3莢膜多糖-OVAp - CRM197A蛋白結合物合成
[0157] 稱取20mg的Pn3降解多糖于反應瓶中，量取2ml的0. 15MNaCl加入反應瓶中；磁 力攪拌使多糖完全溶解。量取適量的CDAP溶液，加入反應瓶中。室溫下攪拌反應1.5min， 30s時測定溶液的pH。1. 5min后，用0. 2mol/LNa0H調節溶液的pH至9. 5,室溫下攪拌反應 3min (用0. 2mol/LNa0H維持pH在9. 5)。加入最終濃度為0. 8M的ADH至反應瓶中，攪拌混 勻，室溫下反應2小時。將衍化后的多糖轉至10KD的透析袋中對0. 15MNaCl溶液進行透 析，換液三次。上樣G-50柱，用0.15MNaCl洗脫，收集外水體積峰。然后轉移至透析袋中， 對水透析，換液三次。稱取5mg衍化后的Pn3多糖，溶解至0. 5ml的0. 15M NaCl溶液中， 加入5mg的OVAp - CRM197A蛋白，攪拌混勻后，加入30mM的EDC，在室溫下反應4小時，轉 移到4°C下反應過夜。將反應混合物轉移至透析袋（MWC06 - 8000)中，在4°C下，對0. 85% NaCl溶液透析3次，6L/次。透析結束后將反應混合液lOOOOrpm，離心lOmin后取上清液， 采用Sepharose CL - 4B凝膠柱純化透析后的多糖結合物，并收集結合物峰，取樣送檢。
[0158] 3、肺炎球菌血清型4莢膜多糖-OVAp - CRM197A蛋白結合物合成
[0159] 稱取5mg活化多糖至反應瓶中，量取100μ 1的0. 5M磷酸鈉緩沖液，加入反應瓶 中，量取5mg的OVAp - CRM197A蛋白至反應瓶中，磁力攪拌使多糖完全溶解；量取0. 5ml純 水加入反應瓶中，磁力攪拌混勻；稱取5.0mg的sodium cyanoborohydride，加入反應瓶 中。將反應體系置于30°C的干浴器中反應12h。反應結束后，量取1. 5ml的0· 15Msodium chloride solution加入反應瓶中。稱取2. 5mg的sodium borohydride，加入反應瓶中。 反應體系置于22°C下反應5h ;將反應混合物轉移至透析袋（MWC012 - 14Kd)，在4°C下，對 0· 15M sodiumchloride solution透析3次，每次透析液量6L ;透析結束后將反應混合液 lOOOOrpm，離心lOmin后取上清液，采用Sepharose CL - 4B凝膠柱純化透析后的多糖結合 物，并收集結合物峰，取樣送檢。
[0160] 4、肺炎球菌血清型5莢膜多糖-OVAp - CRM197A蛋白結合物合成
[0161] 稱取5. Omg活化多糖，加入至反應瓶中，向反應瓶中加入100μ 1的0. 5M磷酸鈉緩 沖液；稱取4. Omg的OVAp -CRM197A蛋白，加入反應瓶中，量取0. 5ml純水加入反應瓶中，磁 力攪拌使反應物溶解，測定反應體系的pH ;稱取5. Omgsodium cyanoborohydride，加入反 應瓶中；將反應體系置于室溫下反應48小時；稱取2. 5mg的sodium borohydride，溶解于 10 μ 1純水中，用移液槍混勻溶解完全后，加入反應瓶中；將反應體系置于23°C下攪拌反應 5小時；將反應混合物轉移至透析袋（MWC06 - 8KD)中，在4°C下，對0. 15M氯化鈉溶液透析 3次，每5小時換液一次；透析結束后將反應混合液lOOOOrpm，離心lOmin后取上清液，采 用Sepharose CL - 4B凝膠柱純化透析后的多糖結合物，并收集結合物峰，取樣送檢。
[0162] 5、肺炎球菌血清型6A莢膜多糖-OVAp - CRM197A蛋白結合物合成
[0163] 稱取6. Omg活化Pn6A多糖，溶解于lmL純化水中，攪拌至完全溶解后測初始pH 值；用0. lMNaOH調節反應液pH值至7. 0 ;向反應體系中加入4mg的OVAp - CRM197A蛋白， 攪拌混勻；稱取5. Omg的sodium cyanoborohydride，加入上述反應瓶中，在室溫反應18小 時；反應結束后取樣送檢；稱取2. 7mg的Sodium borohydride，加入上述反應瓶中，在室溫 反應5小時；反應結束后取樣送檢；將反應混合物轉移至透析袋，在4°C下，對0. 15M氯化鈉 溶液透析5次，6L/次。透析結束后將反應混合液lOOOOrpm，離心lOmin后取上清液，采用 Sepharose CL - 4B凝膠柱純化透析后的多糖結合物，并收集結合物峰，取樣送檢。
[0164] 6、肺炎球菌血清型6B莢膜多糖-OVAp - CRM197A蛋白結合物合成
[0165] 稱取5. Omg的Pn6B溶解于lmL純化水中，攪拌至完全溶解后測初始pH值；用0· 1M NaOH調節反應液pH值至7. 0 ;向反應體系中加入2. 5mg的OVAp - CRM197A蛋白，攪拌混 勻；稱取5. Omg的sodium cyanoborohydride，加入上述反應瓶中，在室溫反應20小時；稱 取2. 5mg的Sodium borohydride，加入上述反應瓶中，在室溫反應6小時；將反應混合物 轉移至透析袋，在4°C下，對0. 15M NaCl溶液透析5次，6L/次；透析結束后將反應混合液 lOOOOrpm，離心lOmin后取上清液，采用Sepharose CL - 4B凝膠柱純化透析后的多糖結合 物，并收集結合物峰，取樣送檢。
[0166] 7、肺炎球菌血清型7F莢膜多糖-OVAp - CRM197A蛋白結合物合成
[0167] 稱取10. Omg的Pn7F多糖，溶解于lmL純化水中，攪拌至完全溶解；分別滴加 0. 1M NaOH溶液至多糖溶液中，調節pH至7. 0 ;向反應體系中加入3. 5mg的OVAp -CRM197A蛋白， 攪拌混勻；稱取5.011^的8〇(1;[1111105^1101301'0117(11^(16，加入上述反應瓶中，在室溫反應20小 時；往反應瓶中加入990 μ 1純水，攪拌混勻；稱取2. 5mg的Sodium borohydride，加入上述 反應瓶中，在室溫反應6小時；將反應混合物轉移至透析袋（MWC06000 -8000)，在4°C下，對 5mM succinate/Ο. 9(%氯化鈉緩沖液透析5次，617次；透析結束后將反應混合液10000印111, 離心lOmin后取上清液，采用Sepharose CL - 4B凝膠柱純化透析后的多糖結合物，并收集 結合物峰，取樣送檢。
[0168] 8、肺炎球菌血清型9V莢膜多糖-OVAp - CRM197A蛋白結合物合成
[0169] 稱取10mg的Pn9V活化多糖，量取125 μ 1的磷酸鈉緩沖液，量取125 μ 1純水加入 反應瓶中，磁力攪拌使多糖完全溶解；量取15mg的OVAp - CRM197A蛋白至加入反應瓶中， 攪拌溶解完全；稱取l〇mg的NaBH3(CN)，加入反應瓶中；將反應體系置于22°C下反應48小 時；稱取2. 5mg的NaBH4，加入反應瓶中，22°C下反應5小時；將反應混合液lOOOOrpm，離心 lOmin后取上清液，采用AKTA系統，S印haroseCL - 4B凝膠柱純化透析后的多糖結合物，并 收集結合峰。
[0170] 9、肺炎球菌血清型14莢膜多糖-OVAp - CRM197A蛋白結合物合成
[0171] 稱取5mg的Pnl4活化多糖，量取lml3. 9mg的OVAp -CRM197A蛋白，加入反應瓶中， 磁力攪拌使多糖完全溶解；加入弱還原劑sodium cyanoborohydride5mg后，在22°C下反應 48小時；加入強還原劑sodium borohydride2. 5mg，室溫下反應4小時；將反應混合液轉移 至透析袋（MWC012 - 14KD)中，用2ml的透析液潤洗反應瓶；在4°C下，對0. 15M氯化鈉溶液 透析3次，6L/次，每5小時換液一次。透析結束以后收集透析液，lOOOOrpm，離心lOmin后 取上清，采用SepharoseCL - 4B凝膠柱純化透析后的多糖結合物，并收集結合物峰。
[0172] 10、肺炎球菌血清型18C莢膜多糖-OVAp - CRM197A蛋白結合物合成
[0173] 稱取5mg的Pnl8C降解多糖，用lmLIM氯化鈉溶液溶解；溶解完全后測其初始pH 值；加入適量的CDAP溶液，室溫下攪拌1. 5min，加入0. 2M NaOH溶液調節溶液的pH至9. 0。 之后于室溫反應3min ;加入10mg的OVAp - CRM197A蛋白，于25°C下反應45min ;反應結束 后，加入37. 5μ 12M賴氨酸溶液；25°C下反應30min后置于4°C反應過夜；將反應混合液轉 至透析袋（麗〇)6000 -8000)中，在41：下，對0.85%氯化鈉溶液透析，換液3次。617次，每 5小時換液一次。透析結束以后收集透析液，lOOOOrpm離心lOmin，取上清，采用CL - 4B凝 膠純化該結合多糖，并收集結合物峰；檢測結合物溶液中的蛋白及多糖含量。
[0174] 11、肺炎球菌血清型19A莢膜多糖-OVAp - CRM197A蛋白結合物合成
[0175] 稱取10. Omg氧化Pnl9A多糖，溶解于0. 5mL的緩沖液中，置磁棒于反應瓶 中，攪拌至多糖完全溶解；加入l〇mg的OVAp - CRM197A蛋白；攪拌混勻，稱取5. Omg的 sodium cyanoborohydride，加入至反應瓶中，在室溫下反應20小時；稱取2. 5mg的 sodium borohydride，加入反應瓶中，在室溫下反應5小時；將反應混合液轉至透析袋 (麗〇)6000 -8000)中，在41：下，對0.85%氯化鈉溶液透析，換液3次。617次，每5小時換 液一次；透析結束以后收集透析液，l〇〇〇〇rpm離心10min,取上清，采用CL - 4B凝膠純化該 結合多糖，并收集結合物峰；檢測結合物溶液中的蛋白及多糖含量。
[0176] 12、肺炎球菌血清型19F莢膜多糖-OVAp - CRM197A蛋白結合物合成
[0177] 稱取5. 2mg氧化Pnl9F多糖，溶解于1ml純水，置磁棒于反應瓶中，在磁力攪拌器 上室溫下攪拌至多糖完全溶解；加入3. Omg的OVAp -CRM197A蛋白；攪拌混勻后，稱取4. 9mg 的sodium cyanoborohydride，加入置反應瓶中，在磁力攪拌器上一直保持攪拌；在室溫 18°C下反應24小時；稱取2. 5mg的sodium borohydride，加入至反應瓶；在恒溫箱18°C下 反應5小時；將反應混合物轉移至透析袋（MWC012 - 14000)，在4°C下，對緩沖液透析5次， 每次透析液量6L，每5小時換液一次；透析結束以后收集透析液，lOOOOrpm離心10min，取 上清，采用CL -4B凝膠純化該結合多糖，并收集結合物峰；檢測結合物溶液中的蛋白及多糖 含量。
[0178] 13、肺炎球菌血清型23F莢膜多糖-OVAp - CRM197A蛋白結合物合成
[0179] 稱取4. 9mg氧化Pn23F多糖，溶解于1ml純水，置磁棒于反應瓶中，在磁力攪拌器 上室溫下攪拌至多糖完全溶解；加入5. Omg的OVAp - CRM197A蛋白；稱取5. lmg的sodium cyanoborohydride，加入置反應瓶中，在磁力攪拌器上一直保持攪拌；在恒溫箱18°C下反 應17小時；稱取2. 5mg的sodium borohydride，加入至反應瓶；在恒溫箱18°C下反應5小 時；將反應混合物轉移至透析袋（MWC012 - 14000)，在4°C下，對0. 15M氯化鈉溶液透析， 每次透析液量6L。每5小時換液一次，共5次；透析結束以后收集透析液，lOOOOrpm離心 10min，取上清，采用CL -4B凝膠純化該結合多糖，并收集結合物峰；檢測結合物溶液中的蛋 白及多糖含量。
[0180] 二、其它含有萬能表位肽的〇VApCRM197A蛋白載體的13種肺炎球菌莢膜多糖 0VApCRM197A結合物的合成
[0181] 本發明設計并生產出共7種0VApCRM197A蛋白載體來合成的多糖蛋白結合物，由 于蛋白質的結構相似，用于特定的肺炎球菌血清型多糖合成時，所采用的方法是還原胺法， ADH法或者CDAP法中的一種。在前節示例中的13種肺炎球菌多糖-OVAp - CRM197A合成 物的合成方法相似，在此不--列舉具體方法。
[0182] 第三步：13價肺炎球菌多糖0VApCRM197A結合物的制備及免疫原性的評估
[0183] 用制備獲得的肺炎球菌多糖蛋白結合物來配制相應的疫苗，對小白鼠進行免疫注 射、采血、用ELISA法檢測血清中多糖抗體濃度以及調理吞噬試驗，來評估不同結合物的免 疫原性。
[0184] 一、13價肺炎球菌多糖-0VApCRM197A結合物的制備及免疫原性的評估
[0185] 為評估0VApCRM197A蛋白載體合成的肺炎球菌莢膜多糖0VApCRM197A結合物的免 疫原性優于不含有萬能表位肽的CRM197A蛋白載體合成的肺炎球菌莢膜多糖CRM197A結合 物，本發明合成了 13價肺炎球菌多糖-CRM197A作為對照，進行免疫原性增強效果的評估。
[0186] 1、13價肺炎球菌多糖-OVAp - CRM197A結合疫苗和13價肺炎球菌多糖-CRM197A 結合疫苗的制備
[0187] 用 Millipore 的 Labscale 超濾系統分別將 1，3,4,5,6A，7F，9V，14,18C，19A，19F 和23F肺炎球菌血清型莢膜多糖蛋白結合物溶液濃縮至多糖濃度為40 μ g/ml ;6B血清型結 合物溶液濃度濃縮至多糖濃度大約為80 μ g/ml ;按照下列表格計算加入相應容量的單價 血清型結合物溶液至制劑瓶中。
[0188]

【權利要求】
1. 一種能夠增強13價肺炎球菌多糖蛋白結合物免疫原性的方法，其特征在于： 步驟一：在白喉毒素變異體CRM197的A鏈（簡稱CRM197A)中加入萬能表位肽 ISQAVHAAHAEINEAGR(簡稱OVAp)，通過基因重組工程菌來生產含有OVAp的CRM197A蛋白載 體（簡稱 〇VApCRM197A); 步驟二：將13種不同血清型的肺炎球菌莢膜多糖通過共價鍵分別與0VApCRM197A蛋白 載體形成的13種單價肺炎球菌多糖-0VApCRM197A結合物。 步驟三：將步驟二獲得的13種單價肺炎球菌多糖-0VApCRM197A結合物進行混合得到 免疫原性增強的13價肺炎球菌多糖蛋白結合物。
2. 根據權利要求1所述的能夠增強13價肺炎球菌多糖蛋白結合物免疫原性的方法，其 特征在于：在所述含有〇VApCRM197A的蛋白載體中含有X個OVAp，1彡X彡3。
3. 根據權利要求1所述的能夠增強13價肺炎球菌多糖蛋白結合物免疫原性的方法，其 特征在于：在〇VApCRM197A蛋白載體中，OVAp連結在CRM197A蛋白的N -末端或C -末端， 或者同時連接在N -末端和C -末端。
4. 根據權利要求1、2或3所述的能夠增強13價肺炎球菌多糖蛋白結合物免疫原性的 方法，其特征在于：所述OVAp與CRM197A蛋白之間是通過GSGSG氨基酸序列進行連接。
5. 根據權利要求1所述的能夠增強13價肺炎球菌多糖蛋白結合物免疫原性的方法，其 特征在于：所述基因重組工程菌是通過基因重組方法構建的大腸桿菌。
6. 根據權利要求1所述的能夠增強13價肺炎球菌多糖蛋白結合物免疫原性的方法，其 特征在于：所述肺炎莢膜多糖是通過分別培養出13個不同血清型的肺炎球菌獲得的莢膜 多糖。
【文檔編號】A61K47/48GK104107428SQ201410197046
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2014年5月11日 優先權日:2014年5月11日
【發明者】李建平 申請人:江蘇康泰生物醫學技術有限公司