多價肺炎球菌莢膜多糖組合物、其制備方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種多價肺炎球菌莢膜多糖組合物、其制備方法及應用，其是含有血清型6A和至少一種選自下組的額外血清型的肺炎鏈球菌莢膜多糖的組合物；其中，所述額外血清型為1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F或33F。本發明的多價肺炎球菌莢膜多糖組合物能誘導機體產生體液免疫，對由上述24種最常見血清型肺炎球菌引起的感染性疾病能產生較好的保護效果，免疫覆蓋率廣，效果優于市面上已有的各類肺炎球菌多糖疫苗和結合疫苗。
【專利說明】多價肺炎球菌莢膜多糖組合物、其制備方法及應用
【技術領域】[0001]本發明屬于微生物學及免疫學領域，具體地說，涉及一種多價肺炎球菌莢膜多糖組合物、其制備方法及應用。
【背景技術】
[0002]肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae),簡稱肺炎球菌(pneumococcus), 1881年首次由法國人巴斯德(Louis Pasteur)及美國人G.M.Sternberg分別從患者痰液中分離出。該菌為革蘭染色陽性，菌體似矛頭狀，成雙或成短鏈狀排列的雙球菌，有毒株在其菌體外形成莢膜多糖。肺炎球菌是細菌感染性疾病的主要病原菌之一，可引起肺炎、腦膜炎、敗血癥、中耳炎等疾病，59TlO%健康成年人以及209^40%兒童的鼻咽等呼吸道中攜帶此菌，有毒株是引起人類疾病的重要病原菌。據聯合國統計，每年有超過一百萬兩歲以下兒童死于肺炎球菌引起的疾病。在我國，由肺炎球菌引起的菌血癥的死亡率約為259^29%。肺炎鏈球菌寄居在人類上呼吸道內，通過飛沫傳播。不同人群均可被肺炎鏈球菌感染，但以下3類人群特別容易受到侵襲:65歲以上的人群，5歲以下兒童，特別是2歲以下的幼童，高危族，如長期病患者等。當前由于肺炎球菌對抗菌藥物的抗藥性增加，以及抗藥菌株在世界范圍的傳播，因此除使用疫苗預防外，尚無其他有效的公共干預措施。
[0003]肺炎鏈球菌具有幾種致病因子，包括多糖莢膜，能幫助入侵寄主的免疫系統。已經發現的肺炎鏈球菌有90多個血清型，肺炎球菌多糖抗原是非T細胞依賴性抗原，初次免疫能誘導產生保護水平的抗體，再次免疫不能誘導產生免疫記憶；并且該疫苗對2歲以下的兒童不能引起有效的保護性抗體應答，而該年齡段人群是肺炎球菌感染的高危人群。
[0004]1880年美國Steinberg和法國Pasteur最先分離出肺炎球菌,并于1882年的實驗中指出通過疫苗預防肺炎球菌感染的可能性。1914年，全菌體疫苗首次得以使用，但因副反應強、效果差，其安全性和有效性受到廣泛質疑，之后逐漸被淘汰。1927年，Sehiemann等證明了肺炎球菌莢膜多糖對人的免疫原性，并開始了對肺炎球菌多糖疫苗的研究。
[0005]目前我國僅有7價肺炎球菌結合疫苗，如沛兒⑩被批準上市，針對2~23個月大的嬰兒或2飛歲有存在風險的孩童進行被動免疫，保護孩童免受肺炎鏈球菌的深層感染，如敗血病及腦膜炎；僅能保護7個價次，保護范圍有限，而23價肺炎球菌多糖疫苗(如“紐莫法?'”)可以對85%的55歲以上的人群提供長達五年的保護，由于上述血清型組合主要針對歐美發達國家流行情況而設計，對亞洲特有的血清型缺乏保護。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種多價肺炎球菌莢膜多糖組合物、其制備方法及應用。
[0007]本發明的另一目的是提供一種含有上述組合物的多價肺炎球菌莢膜多糖結合疫苗。
[0008]為了實現本發明目的，本發明的一種多價肺炎球菌莢膜多糖組合物，其為含有肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型6A和至少一種選自下組的額外血清型的莢膜多糖的組合物；其中，所述額外血清型為1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 或 33F。
[0009]優選地，所述多價肺炎球菌莢膜多糖組合物為含有血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、
8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 33F 的肺炎鏈球菌的莢膜
多糖的組合物。
[0010]前述多價肺炎球菌莢膜多糖組合物中，不同血清型的莢膜多糖按等質量混合。優選各型莢膜多糖含量為25-7511§/1111，更優選的為5011§/1111。其中，24價肺炎球菌多糖組合物各型多糖的標準物質可購自美國標準生物品收藏中心(ATCC)。
[0011]前述多價肺炎球菌莢膜多糖組合物中，還含有賦形劑，所述賦形劑為氯化鈉和磷酸鹽緩沖劑等。
[0012]本發明還提供一種制備多價肺炎球菌莢膜多糖組合物的方法:分別對肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型6A和至少一種選自下組的額外血清型的莢膜多糖進行分離純化，然后將各純化的血清型莢膜多糖混合，任選加入賦形劑，即得多價肺炎球菌莢膜多糖組合物；其中，所述額外血清型為1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 或 33F。
[0013]其中，肺炎鏈球菌莢膜多糖分離純化的步驟為:
[0014]I)建立肺炎球菌菌種庫，采用肺炎球菌工作種子進行肺炎球菌發酵；
[0015]2)向肺炎球菌發酵液中加入適量的去氧膽酸鈉進行殺菌并剝離肺炎球菌莢膜多糖；
[0016]3)對殺菌后的發酵液進行離心，去除菌體，收集離心上清，然后進行超濾濃縮；
[0017]4)向濃縮液中加入無水乙醇，使乙醇終濃度為259^45%，攪拌后離心去除核酸；
[0018]5)向上清中加入乙醇使其終濃度達到55%~80%，攪拌后，離心，去除上清收集沉淀；
[0019]6)加水溶解沉淀，加入1-3倍溶液體積的苯酚進行多次抽提，去除蛋白質；
[0020]7)向上清中加入乙醇，使其終濃度達到559^80%，離心后收集沉淀，即得純化的肺炎球菌莢膜多糖。
[0021]還可采用本領域熟知的其它純化技術，如柱層析、乙醇沉淀、酶切等方法對肺炎鏈球菌莢膜多糖進行純化。
[0022]本發明還提供所述多價肺炎球菌莢膜多糖組合物在制備用于預防或治療肺炎鏈球菌所致疾病的藥物中的應用。
[0023]本發明還提供一種多價肺炎球菌莢膜多糖結合疫苗，其含有將上述多價肺炎球菌莢膜多糖組合物與載體蛋白共價連接形成的綴合物，以及任選基于鋁的佐劑。所述載體蛋白應為無毒性，且能與肺炎球菌莢膜多糖結合并且能夠引起多糖免疫原性顯著升高的蛋白，同時易于大量獲得。本發明的載體蛋白優選為白喉類毒素或破傷風毒素，更優選為白喉類毒素CRM197。上述蛋白載體的獲得，需經過菌體發酵、超濾、純化、脫毒等步驟，均為本領域常規技術。
[0024]本發明還提供制備所述多價肺炎球菌莢膜多糖結合疫苗的方法，分別對不同血清型肺炎鏈球菌的莢膜多糖進行分離純化，然后將各血清型莢膜多糖分別與載體蛋白進行共價連接(例如，先將純化的莢膜多糖化學活化，通過還原胺化法將活化莢膜多糖分別單獨結合到載體蛋白上)，形成單價綴合物，將各型單價綴合物分別采用鋁佐劑吸附后混合，或各型單價綴合物混合后再采用鋁佐劑吸附，即得多價肺炎球菌莢膜多糖結合疫苗。所述基于鋁的佐劑，如氧化鋁、氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等，其終濃度為0.25-4.0mg/ml。所述基于鋁的佐劑可市售獲得，也可以采用本領域常規方法進行制備。
[0025]前述的多價肺炎球菌莢膜多糖結合疫苗，其可以為噴霧劑、注射劑、凍干劑、膠囊劑、片劑或丸劑等。可通過以下方式進行免疫:皮膚、注射(包括皮下注射、肌肉注射、靜脈注射)、口服、滴鼻或粘膜噴霧等。
[0026]本發明的多價肺炎球菌莢膜多糖結合疫苗可以用于保護或者治療由于肺炎球菌感染引發肺炎的病人，疫苗可以通過肌肉、皮下、皮內途徑注射或經過粘膜給藥，適于接種人和動物。
[0027]本發明是針對我國特有血清型肺炎球菌的流行情況，首次選擇了 6A以及1、2、3、
4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 或 33F 中至少一
種的血清型組合，從而開發出針對我國特有血清型肺炎球菌的流行情況而設計的多價肺炎球菌莢膜多糖組合物，提供最大限度的保護。
[0028]采用本發明方法制備的多價肺炎球菌莢膜多糖組合物，其穩定性較好。該組合物具有針對上述24種血清型的肺炎球菌侵襲的多重免疫原性和保護性能，血清型覆蓋范圍更廣，理化性質穩定，互無干擾，優于已上市的低價次肺炎組合物，且免疫應答不低于低價次的組合物。接種本發明的多價肺炎球菌莢膜多糖疫苗可以減少接種針次，簡化免疫程序，同時可有效預防人及動物因上述24種血清型肺炎球菌所致的疾病，覆蓋更加廣泛，免疫效果更好。
[0029]本發明的多價肺炎球菌莢膜多糖結合疫苗可以由預防上述24種血清型肺炎球菌所致的侵襲性疾病，更加方便多效，成本更低。上述24種血清型莢膜多糖的生產，均采用發酵后純化的方式進行制備，具有相似的生產工藝，便于工業化大規模生產，且通過滅活后提純莢膜多糖，使疫苗具有更高的安全性及良好的免疫原性，同時，所述多價肺炎球菌莢膜多糖組合物吸附完全，理化性質穩定，互無干擾。另外，該多價結合疫苗免疫原性效果遠高于同類多價次的多糖類疫苗，可有效激活2歲以下兒童B細胞，從而產生抗體，并激活記憶B細胞，誘發免疫記憶反應，可以起到更好的保護效果。
[0030]動物實驗表明，本發明的多價肺炎球菌莢膜多糖結合疫苗可有效誘導機體產生針對上述24種血清型莢膜多糖的高滴度、特異性抗體，體外實驗表明，由該多價結合疫苗所誘導的抗體具有明顯的反應性與中和活性；特別是組合物中各血清型莢膜多糖的免疫效果不受另一組分的影響與干擾，吸附率大于75%，免疫原性不低于單價綴合物。該多價結合疫苗具有與各血清型單價結合原液相同的免疫原性，組合接種可以在不影響療效的基礎上大大減少接種次數。
【具體實施方式】
[0031]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。
[0032]實施例1肺炎球菌莢膜多糖原液制備
[0033]1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F血清型肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)菌株均來源于中國藥品生物制品檢定所與丹麥血清研究所(SSI)。將上述菌種進行傳代建立原始種子庫、主種子庫和工作種子庫，代次分別為:原始種子批為第I代，主種子批為第4代，工作種子批為第8代。工作種子批啟開后至接種發酵罐培養，傳代應不超過10代。每代種子采用奶粉做凍干保護劑，凍干保藏。取工作種子在大豆蛋白胨固體培養基劃線挑取菌種，接種于5ml的液體綜合培養基，35°C ±2°C培養后，轉種到500ml的培養液后經過培養再擴增至IOL培養液和50L培養液。于對數生長期的后期或靜止期的前期中止培養，取樣進行純菌檢查，純菌檢查合格后在收獲的培養液中加入合適量的無菌的去氧膽酸鈉至終濃度為1%殺菌兩小時以裂解細菌細胞并釋放莢膜多糖。將已殺菌的培養液離心后收集上清液，上清液用100KD截留分子量的超濾膜包超濾濃縮3-10倍。
[0034]用pH7.0左右的磷酸鹽緩沖液對超濾液采進行超濾換液，然后加入無水乙醇，使乙醇終濃度為259^45%，充分攪拌后離心去除核酸。
[0035]向上清中加入乙醇使其終濃度達到559^80%，攪拌后，離心，去除上清收集沉淀。
[0036]加水溶解沉淀，加入1-3倍溶液體積的苯酚進行多次抽提，去除蛋白。
[0037]向上清中加入乙醇，使其終濃度達到559^80%，離心后收集沉淀，將沉淀采用注射水復溶，經過0.22 iim的無菌濾器除菌過濾后，獲得1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和 33F共 24 種純化血清型的肺炎球菌莢膜多糖。
[0038]實施例2多價肺炎球菌莢膜多糖組合物的制備
[0039]將實施例1中制備的24種肺炎球菌莢膜多糖原液，按照各血清型多糖含量終濃度50ug/ml混合后添加緩沖液(注射水、生理鹽水或磷酸鹽緩沖液)定容至終體積，制成24價肺炎球菌多糖組合物。
[0040]將上述制備的24價肺炎球菌莢膜多糖疫苗，采用低溫干燥的方式制成凍干劑型，使用前采用注射水、生理鹽水或者磷酸鹽緩沖`液進行復溶。
[0041]采用免疫濁度法檢測凍干后多價肺炎球菌多糖組合物的各型多糖含量，并與凍干前的檢測結果進行對比，比較抗原物質的變化。結果見表1。
[0042]表1 24價肺炎球菌多糖疫苗各型多糖含量
【權利要求】
1.多價肺炎球菌莢膜多糖組合物，其特征在于，其為含有肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)血清型6A和至少一種選自下組的額外血清型的莢膜多糖的組合物；其中，所述額外血清型為 1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 或 33F。
2.根據權利要求1所述的組合物，其特征在于，其為含有血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 33F 的肺炎鏈球菌的莢膜多糖的組合物。
3.根據權利要求1所述的組合物，其特征在于，不同血清型的莢膜多糖按等質量混合。
4.根據權利要求1所述的組合物，其特征在于，各型莢膜多糖含量為25-75y g/ml。
5.根據權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物中還含有賦形劑，所述賦形劑為氯化鈉和磷酸鹽緩沖劑。
6.一種制備多價肺炎球菌莢膜多糖組合物的方法，其特征在于，分別對肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型6A和至少一種選自下組的額外血清型的莢膜多糖進行分離純化，然后將各純化的血清型莢膜多糖混合，任選加入賦形劑，即得多價肺炎球菌莢膜多糖組合物；其中，所述額外血清型為1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 或 33F。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，肺炎鏈球菌莢膜多糖分離純化的步驟為: 1)建立肺炎球菌菌種庫，采用工作種子進行肺炎球菌發酵； 2)向肺炎球菌發酵液中加入適量的去氧膽酸鈉進行殺菌并剝離肺炎球菌莢膜多糖； 3)對殺菌后的發酵液進行離心，去除菌體，收集離心上清，然后進行超濾濃縮； 4)向濃縮液中加入無水乙醇，使乙醇終濃度為259^45%，攪拌后離心去除核酸； 5)向上清中加入乙醇使其終濃度達到559^80%，攪拌后，離心，去除上清收集沉淀； 6)加水溶解沉淀，加入1-3倍溶液體積的苯酚進行抽提，去除蛋白； 7)向上清中加入乙醇，使其終濃度達到559^80%，離心后收集沉淀，即得純化的肺炎球菌莢膜多糖。
8.權利要求1-5任一項所述組合物在制備用于預防或治療肺炎鏈球菌所致疾病的藥物中的應用。
9.多價肺炎球菌莢膜多糖結合疫苗，其含有將權利要求1-5任一項所述組合物與載體蛋白共價連接形成的綴合物，以及任選基于鋁的佐劑。
10.根據權利要求9所述的結合疫苗， 其特征在于，其為噴霧劑、注射劑、凍干劑、膠囊劑、片劑或丸劑。
【文檔編號】A61K39/385GK103656632SQ201210359369
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月24日 優先權日:2012年9月24日
【發明者】高強, 蔡芳, 王見冬, 孫勝軍, 王治偉, 陳磊, 王新立, 阮力, 尹衛東 申請人:北京科興中維生物技術有限公司