一種具有抗肝癌活性的楮實子提取物及其提取方法
【專利摘要】一種具有抗肝癌活性的楮實子提取物，其提取方法為將楮實子置于烘箱中烘干，并將烘干后的楮實子研磨成粉末，以1∶10(g／g)的比例加入石油醚震蕩5h，然后抽濾，再將濾渣置于通風櫥內去除殘余石油醚，收集脫脂后的楮實子，將脫脂楮實子以8倍、6倍量加水提取2次，再抽濾并收集濾液，真空抽濾5次，合并5次獲得的濾液并減壓濃縮至1g生藥/mL，藥液放冷后，邊攪拌邊緩慢加入乙醇，至終濃度為70%，密閉冷藏48h，濾過，濾液回收乙醇，得到精制液，再行離心沉淀獲得提取物。通過體內外藥理實驗證實，本發明提取物對小鼠移植性肝癌H22具有抑制作用，能延長EAC腹水瘤小鼠生存期，對人肝癌細胞HepG2生長具有抑制作用。
【專利說明】一種具有抗肝癌活性的楮實子提取物及其提取方法
一、【技術領域】
[0001]本發明涉及中草藥【技術領域】，具體地說是涉及一種具有抗肝癌活性的楮實子提取物及其提取方法，它是從楮實子中提取的一種有效物質，通過體內動物實驗及體外細胞實驗證實具有抗肝癌活性。
二、【背景技術】
[0002]原發性肝癌(HCC)是我國常見的惡性腫瘤之一，年死亡率居惡性腫瘤第二位，國際癌癥研究中心(IARC)估計2000年全球肝癌發病56.4萬,肝癌死亡54.9萬,其中中國肝癌發病30.6萬，死亡30.0萬。有資料顯示，肝癌患者出現臨床癥狀后生存期平均6月左右，單純手術費用在2萬元左右，還有術后的抗感染、并發癥處理等，費用難以確定，化療或者介入手術I次在I萬元左右，若出現副反應、并發癥、繼發癥等，則后續費用巨大。盡管費用高昂，療效仍很低，5年生存率低于12%。中醫藥治療肝癌有長期的臨床實踐基礎，通過辨證施治，從整體上改善患者的臨床癥狀，提高其生活質量，而且來自天然植物的中藥，藥源充足，相對價格低廉，毒副作用小，患者依從性好，具有良好的開發前景。
[0003]本發明人長期從事中醫藥抗肝癌研究，繼承發揚名老中醫抗肝癌的臨床經驗，已開展多項抗肝癌有效驗方的臨床與實驗課題研究，并于2007年獲得發明專利“一種利濕抗癌藥物和制備方法及在制備抗癌藥物中的應用”，證書號第358825號，專利號ZL200410041407.5。在前期研究的基礎上，本發明人從中藥楮實子中提取到一種具有抗肝癌活性的有效物質，并通過了初步的動物及細胞實驗驗證。
[0004]中藥堵實子(FructusBroussonetiae)始載于漢代《名醫別錄》，又名為堵實、榖實、榖子、堵桃，為桑科植物構樹Broussonetia papyrifera(L.) Vent.的干燥成熟果實,主產于河南、湖北、山西、甘肅等地。楮實子味甘性寒無毒，具有滋腎益陰、清肝明目、利水消腫等功效，常用于治療肝腎陰虛，骨蒸潮熱，盜汗夢遺，頭昏目眩，目昏翳障，水腫脹滿，小便不利等癥。劉漢基《藥性通考》中云:“楮實子，陰痿能強，水腫可退，充肌膚，助腰膝，益氣力，補虛勞，悅顏色，壯筋骨，明目”。楮實子果實含生物堿、皂甙(0.51 %)、維生素B及油脂。種子含油31.7%，油中含非皂化物2.67%，飽和脂肪酸9.0%，油酸15.0%，亞油酸76.0%。楮實子中含有17種氨基酸，以谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸含量最高。以100g干燥樣品粉末計算，楮實子總氨基酸含量為12.44g，人體必需氨基酸總量為3.92g。藥理研究顯示，楮實子具有抗氧化、抗老年癡呆、延緩衰老的作用，楮實子油能顯著降低血脂，防治心血管疾病。一些藥理實驗顯示，楮實子的相關成分有顯著的抑制腫瘤細胞生長的作用，楮實子總生物堿濃度50 μ g/L時，藥物對腫瘤細胞生長的抑制作用較明顯，MTT法測得抑制率在20%以上，集落形成法測得抑制率在30%以上。而當藥物濃度達到100μ g/L時，楮實子總生物堿顯示出較為顯著的腫瘤細胞抑制作用，兩種方法的細胞生長抑制率分別在50%和60%以上。三、
【發明內容】
[0005]1、發明目的:提供一種具有抗肝癌活性的楮實子提取物及其提取方法。
[0006]2、本發明目的是通過以下的技術方案來實現的:
[0007]—種具有抗肝癌活性的楮實子提取物，其特征是由中藥楮實子烘干粉碎后水提醇沉而得到的提取物；
[0008]楮實子提取物的提取方法如下:
[0009](I)將楮實子置于烘箱中烘干，并將烘干后的楮實子研磨成粉末；
[0010](2)將楮實子粉末以1: 10的重量比加入石油醚震蕩5h，然后抽濾；
[0011](3)將濾渣置于通風櫥內去除殘余石油醚，收集脫脂后的楮實子；
[0012](4)將脫脂楮實子以8倍、6倍量加水提取2次，再抽濾并收集濾液，反復濾取5次，合并5次獲得的濾液并減壓濃縮至Ig生藥/mL ；
[0013](5)藥液放冷后，邊攪拌邊緩慢加入乙醇，至終濃度為70%，密閉冷藏48h，濾過，濾液回收乙醇，得到精制液，再行離心沉淀獲得提取物。
[0014]所述一種具有抗肝癌活性的楮實子提取物，其特征在于該提取物是一種多糖成分，可以測定其含量。
[0015]所述一種具 有抗肝癌活性的楮實子提取物在制備治療肝癌藥物中的應用。
[0016]3、有益效果:
[0017]本發明為從中藥楮實子中獲得的提取物，用于小鼠移植性肝癌H22，其高、中、低劑量對腫瘤生長的抑制率分別為57.76%,48.45%,40.37%，用于艾氏腹水癌腹水型小鼠，與對照組相比能明顯延長荷瘤小鼠的生存期。體外細胞實驗研究顯示，本提取物高、中、低劑量對人肝癌細胞株IfepG2的抑制率分別為76.2%、70.5%、74.5%。
四、【具體實施方式】
[0018]實施例1:楮實子提取物的提取方法
[0019](I)將楮實子2000g置于烘箱中烘干，并將烘干后的楮實子研磨成粉末；
[0020](2)將楮實子粉末2000g以1: 10的重量比加入石油醚20Kg震蕩5h，然后真空抽濾；
[0021](3)將濾渣置于通風櫥內去除殘余石油醚，收集脫脂后的楮實子，測得重量為1800g ；
[0022](4)將1800g脫脂楮實子加水14.4L提取I次后抽濾并收集濾液，再加水10.8L提取I次并收集濾液，分別濾取5次，合并5次獲得的濾液并減壓濃縮至Ig生藥/mL ；
[0023](5)藥液放冷后，邊攪拌邊緩慢加入乙醇，至終濃度為70%，密閉冷藏48h，濾過，濾液回收乙醇，得到精制液，再行離心沉淀獲得楮實子提取物。
[0024]實施例2:楮實子提取物中多糖含量測定
[0025]I配制葡萄糖標準儲備液
[0026]精確稱取1050C干燥恒重的無水葡萄糖，對照品15mg，置100mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻即得葡萄糖標準儲備液，每1ml中含無水葡萄糖0.15mg。
[0027]2制備標準曲線
[0028]精密量取對照品溶液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5ml，分別置于IOml容量瓶中，加去離子水3.0ml，各精密加入5%甲苯酚溶液1ml，搖勻，迅速精密加入硫酸5ml，搖勻，放置lOmin，置400C水浴中保溫15min，取出后迅速冷卻至室溫，加入定容至刻度，搖勻，以相應的實際為空白，照紫外-可見分光光度法，在490nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，作圖得標準曲線，計算回歸方程。
[0029]3計算多糖含量
[0030]取提取物0.2mg，精密稱定，置100mL容量瓶中，加水振搖并稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液。精密量取濾液1ml，置IOml容量瓶中，加水3.0ml，照前法測定吸光度，樣品平行測定6次，代入回歸議程，計算多糖含量。
[0031]實施例3:楮實子提取物對小鼠移植性肝癌H22生長的作用
[0032]昆明種健康成年小鼠60只，雄性，體重18_22g，空白組10只，以下法造模:將凍存的腹水型肝癌細胞株H印s復蘇，體外培養傳代至對數生長期后進行離心，PBS緩沖液沖洗后，生理鹽水4倍稀釋，充分混勻，于每只小鼠右前肢腋窩下皮下注射0.2ml,接種完成后正常飲食飼養，造模后24h將50只小鼠按照隨機數字表法分為模型組、陽性藥物組(5-Fu，20mg/kg)、楮實子提取物高、中、低劑量組。接種后第5天開始給藥，各組小鼠以0.lmL/10g體重腹腔注射，隔天I次，共給藥5次，模型組給予生理鹽水，陽性藥物組按小鼠體重20mg/kg給予5-Fu,堵實子提取物高、中、低劑量組劑量分別為100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg。第15d頸椎脫臼法處死小鼠，摘眼球取血。檢測小鼠體重、瘤重、抑瘤率、血清ALT、AST、Urea、Crea、脾臟及胸腺指數。
[0033]表1小鼠用藥前、用藥中期、處死前體重變化(X 士SD,單位:g)
[0034]
【權利要求】
1.一種具有抗肝癌活性的楮實子提取物，其特征是由中藥楮實子烘干粉碎后水提醇沉而得到的提取物； 楮實子提取物的提取方法如下: (1)將楮實子置于烘箱中烘干，并將烘干后的楮實子研磨成粉末； (2)將楮實子粉末以1: 10的重量比加入石油醚震蕩5 h，然后真空抽濾； (3)將濾渣置于通風櫥內去除殘余石油醚，收集脫脂后的楮實子； (4)將脫脂楮實子以8倍、6倍量加水提取2次，再抽濾并收集濾液，反復濾取5次，合并5次獲得的濾液并減壓濃縮至Ig生藥/mL ； (5)藥液放冷后，邊攪拌邊緩慢加入乙醇，至終濃度為70%，密閉冷藏48h，濾過，濾液回收乙醇，得到精制液，再行離心沉淀獲得提取物。
2.根據權利要求1所述一種具有抗肝癌活性的楮實子提取物，其特征在于該提取物是一種多糖成分，可以測定其含量。
3.如權利要求 1所述一種具有抗肝癌活性的楮實子提取物在制備治療肝癌藥物中的應用。
【文檔編號】A61P35/00GK103989745SQ201410199454
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年5月12日 優先權日:2014年5月12日
【發明者】彭海燕 申請人:南京中醫藥大學