可注射型載藥黃原膠/甲基纖維素復合溶液及其制備方法與流程

本發明屬于醫藥技術領域，具體涉及一種具有剪切變稀和熱致凝膠化性能的可注射型載藥黃原膠/甲基纖維素復合溶液及其制備方法。

背景技術：
可注射型水凝膠由于具有操作簡單，力學性能可控，可填充不規則缺陷以及可以非侵入方式注射到特定的組織和部位等優點，在藥物傳遞，細胞封裝以及組織工程等生物醫學領域具有廣泛的應用。其中，具有剪切變稀性質的水凝膠或高粘度凝膠前體溶液在剪切力作用下處于低粘度的流體狀態，當剪切停止時能夠迅速恢復至原先的水凝膠或高粘度溶液狀態。這一特征使得剪切變稀可注射型水凝膠可以有效地避免注射后滲漏至鄰近組織，避免包載藥物的大量流失。黃原膠是一種由Xanthomonascampestris發酵產生的陰離子胞外多糖。黃原膠由線性（1-4）-β-D-葡萄糖連接的主鏈以及每隔兩個葡萄糖殘基連接的帶負電荷的三糖側鏈組成[Softmatter,2013,9,3063-3073.]。黃原膠在水溶液中具有兩種不同的構象：較低溫度下是有序的雙股螺旋構象，較高溫度下是無序結構構象；從有序結構到無序結構的轉變溫度依賴于溶液的離子強度，一般在40~50℃[Biomacromolecules,2014,15,1160-1170.]。由于黃原膠分子鏈之間的氫鍵作用，低濃度的黃原膠溶液表現出弱凝膠性質并且具有剪切變稀性質。黃原膠分子鏈間的聚集行為可以通過溶液的黃原膠濃度、離子強度和溫度進行調控[Softmatter,2013,9,3063-3073.]。甲基纖維素是甲基化疏水修飾的纖維素衍生物，具有良好的生物相容性[Macromolecules,2013,46,300-309.]。當每個葡萄糖單元的甲基取代度在1.6~2.1之間時，甲基纖維素表現出反相溫度凝膠化性質[Biomacromolecules,2013,14,2484-2488.]，其水溶液的反相凝膠轉變溫度與溶液中的甲基纖維素濃度有關。單獨的甲基纖維素溫敏性水凝膠不能作為注射型水凝膠使用。通過物理共混的方法制備復合水凝膠具有制備簡單、可以結合不同組分和不同性能的優點。但是，我們還沒有發現利用黃原膠和甲基纖維素制備可注射型載藥水凝膠的報道。

技術實現要素：
本發明的目的在于提供一種具有剪切變稀和熱致凝膠化性能的可注射型載藥復合溶液和復合水凝膠及其制備方法。本發明提供的可注射型載藥復合溶液，是一種載藥黃原膠/甲基纖維素復合溶液，溶劑為磷酸緩沖液；其中，黃原膠的質量體積百分比（w/v%）為0.5%~10%，甲基纖維素的質量體積百分比（w/v%）為3%~20%。所述藥物包括小分子藥物和大分子藥物，小分子藥物如抗腫瘤藥物，大分子藥物如蛋白質藥物。本發明提供的可注射型載藥復合溶液的制備方法，具體步驟如下：（1）將甲基纖維素與黃原膠在磷酸緩沖液中充分溶解和混合，得到黃原膠/甲基纖維素復合溶液；（2）將藥物溶解或者分散在黃原膠/甲基纖維素復合溶液中，即得到載藥復合溶液。上述載藥復合溶液可在35~40℃溫度（即人或動物體溫）條件下原位快速形成復合水凝膠。也即在室溫條件下將上述載藥復合溶液注射到動物或者人體內，復合溶液在體溫（如37℃）條件下原位快速形成復合水凝膠。本發明的載藥復合溶液中，所述黃原膠的質量體積百分比為0.5%~10%；所述甲基纖維素的質量體積百分比為3%~20%；所述藥物包括小分子藥物和大分子藥物，小分子藥物如抗腫瘤藥物但是不局限于抗腫瘤藥物，大分子藥物如蛋白質藥物。本發明提供的復合水溶液具有剪切變稀和熱致凝膠化性能。在室溫條件下，由于黃原膠的有序雙股螺旋結構導致載藥黃原膠/甲基纖維素復合水溶液具有高粘度性質并具有剪切變稀的可注射性能和快速恢復性能。當高粘度的復合水溶液注射至體內時，由于（37℃）體溫高于甲基纖維素的熱致凝膠溫度，復合水溶液在體溫條件下快速凝膠化形成固體的水凝膠。得到的載藥黃原膠/甲基纖維素復合水凝膠具有良好的力學性能、生物相容性、生物降解性、藥物緩釋和治療效果。附圖說明圖1為本發明載藥黃原膠/甲基纖維素復合水溶液和載藥黃原膠/甲基纖維素復合水凝膠的性能。其中，(A)高粘度黃原膠（XG）/甲基纖維素（MC）復合物溶液在23℃條件下的多步觸變剪切速率掃描，其中低剪切速率為0.1s-1，高剪切速率為10s-1;(B)XG/MC復合水凝膠在37℃條件下的多步觸變剪切速率掃描，其中低剪切速率為0.5s-1，高剪切速率為500s-1。圖2為負載不同濃度胰島素的XG2/MC10復合水凝膠在37℃磷酸緩沖液中的累積釋放曲線。圖3為載不同濃度阿霉素的XG2/MC10復合水凝膠在37℃磷酸緩沖液中的累積釋放曲線。圖4為XG2/MC10復合溶液注射至雄性SD大鼠體內1天和5周以后的凝膠狀態。具體實施方式實施例1.XG/MC復合溶液的制備。將15mL磷酸緩沖液（10mmol/LpH7.4磷酸緩沖液+0.15mol/LNaCl）加入到50mL燒杯中并置于80℃水浴中預熱5分鐘，然后將2.5g甲基纖維素（MC）粉末緩慢加入到80℃的磷酸緩沖液中并保持快速攪拌。待甲基纖維素粉末完全浸潤之后將溶液冷卻至室溫，再次加入10mL磷酸緩沖液攪拌均勻，然后將溶液轉移至4℃冰箱中繼續攪拌過夜使甲基纖維素充分溶解。將0.5g黃原膠（XG）粉末加入到上述甲基纖維素溶液中，在4℃條件下快速攪拌過夜使黃原膠充分溶解，然后在4℃條件下溫和攪拌24小時接著低速離心除去體系中的氣泡即得到黃原膠/甲基纖維素（XG2/MC10）復合溶液。通過此方法制備表1所示的一系列不同濃度的黃原膠/甲基纖維素（XG/MC）復合物溶液，并利用旋轉流變儀（HAAKEMARS）對各復合物溶液的凝膠性能進行表征。所有的流變測試都在樣品的線性粘彈區域內進行，所設置的頻率為10rad/s，應力為5Pa。通過流變測試得到了各種XG/MC復合物溶液的凝膠轉變溫度以及在37℃條件下的凝膠化時間，結果在表1列出。與單獨的MC溶液相比，XG/MC復合物溶液具有更低的凝膠轉變溫度，在37℃條件下具有更短的凝膠化時間，即XG/MC復合物溶液在37℃條件下表現出快速凝膠化性質。表2的彈性模量和損耗模量數據表明在37℃條件下XG/MC復合水凝膠比單獨的XG或MC水凝膠具有更高的彈性模量，即XG/MC復合水凝膠具有更好的力學性能。表1.具有不同黃原膠（XG）和甲基纖維素（MC）濃度的黃原膠/甲基纖維素（XG/MC）復合物溶液的凝膠轉變溫度以及在37℃條件下的凝膠化時間。表2.不同XG/MC復合水凝膠樣品在37℃條件下的凝膠力學性能。測試頻率為10rad/s，應力為5Pa。實施例2.XG/MC復合物溶液的制備。將15mL磷酸緩沖液加入到50mL燒杯中并置于80℃水浴中預熱5分鐘，然后將2.5gMC粉末緩慢加入到80℃磷酸緩沖液中并保持快速攪拌，待MC粉末完全浸潤之后將溶液冷卻至室溫，再次加入10mL磷酸緩沖液，緊接著將0.5gXG粉末加入到上述MC分散液中，室溫攪拌至共混溶液的粘度非常大以后將溶液轉移到4℃冰箱中冷卻，然后在4℃條件下攪拌24小時使XG和MC充分溶解，最后通過低速離心除去體系中的氣泡即得到黃原膠/甲基纖維素（XG2/MC10）復合物溶液。利用此方法也可以制備表1所示的一系列不同濃度的XG/MC復合物溶液。實施例3.利用旋轉流變儀對XG/MC復合物溶液和XG/MC復合水凝膠的可注射性能進行研究。對XG/MC復合物溶液在23℃（室溫條件）和XG/MC復合水凝膠在37℃（人體溫度條件）實施了多步觸變速率掃描用于表征剪切前后的觸變恢復性能，圖1為實驗結果。其中，在室溫條件下的低剪切速率（lowshear）為0.1s-1，保持時間為2分鐘（min），高剪切速率（highshear）為10s-1，保持時間為1min；在體溫條件下的低剪切速率為0.5s-1，保持時間為2min，高剪切速率為500s-1，保持時間為1min。圖1的實驗結果表明XG/MC復合物溶液在室溫條件下具有高粘度性質，在體溫條件下是水凝膠，二者都具有很好的剪切變稀性能和快速恢復性能，證明了XG/MC復合物溶液可以在室溫條件下注射到體內，在體溫條件下可以原位快速形成水凝膠。實施例4.用模擬體液的方法對XG/MC復合水凝膠進行體外降解研究。具體實驗如下：將1mLXG/MC復合物溶液置于試管底部后將試管放入37℃水浴中平衡30min使XG/MC充分凝膠化，然后在試管中加入3mL37℃磷酸緩沖液并每天按時更換緩沖液，待水凝膠在緩沖液中經過特定的時間降解以后將殘余的水凝膠凍干并稱重。水凝膠的質量剩余率（%）=經過特定時間降解的水凝膠質量（干重）/初始的水凝膠質量（干重）×100%。表3是體外降解實驗的結果，數據表明單獨的XG在體外不能降解而MC可以降解，由于XG/MC復合水凝膠中XG的含量較少，XG/MC復合水凝膠的體外降解速率接近于單獨的MC水凝膠降解速率。表3.XG/MC復合水凝膠和MC水凝膠在37℃磷酸緩沖液中浸泡不同時間以后的質量殘余率。樣品XG3/MC0XG3/MC12XG2/MC10XG0/MC12XG0/MC100天1001001001001008天105±1.674±1.781±2.478±1.375±0.616天104±0.267±1.076±0.773±0.370±1.534天104±2.951±1.358±0.556±1.358±2.444天104±2.747±3.057±1.355±2.554±2.2實施例5.負載胰島素的XG/MC復合物溶液制備。首先根據實施例1或實施例2制備XG/MC復合物溶液，然后在4℃條件下將XG/MC復合物溶液與胰島素溶液混合均勻后靜置48小時，通過低速離心除去體系中的氣泡即得到負載胰島素的XG/MC復合物溶液。在復合物溶液中胰島素的濃度為0.4mg/mL~2.0mg/mL。對負載2.0mg/mL胰島素的XG2/MC10復合物溶液進行流變性能測量，結果表明其凝膠轉變溫度為33℃，在37℃條件下的凝膠化時間為65秒，證明了負載蛋白質藥物胰島素后對XG/MC復合物溶液的凝膠性能影響很小。實施例6.負載阿霉素的XG/MC復合物溶液制備。首先根據實施例1或實施例2制備XG/MC復合物溶液，然后在4℃條件下將XG/MC復合物溶液與阿霉素溶液混合均勻后靜置48小時，通過低速離心除去體系中的氣泡即得到負載阿霉素的XG/MC復合物溶液。在復合物溶液中阿霉素的濃度為0.4mg/mL~2.0mg/mL。對負載2.0mg/mL阿霉素的XG2/MC10復合物溶液進行流變性能測量，結果表明其凝膠轉變溫度為32.5℃，在37℃條件下的凝膠化時間為61秒，證明了負載小分子藥物阿霉素后對XG/MC復合物溶液的凝膠性能影響很小。實施例7.對負載不同濃度胰島素的XG2/MC10復合水凝膠進行體外釋放研究。方法如下：于試管底部加入1mL負載不同濃度胰島素的XG2/MC10復合物溶液后，將試管置于37℃水浴中平衡30min使復合物溶液充分凝膠化。在試管中加入10mL37℃磷酸緩沖液，經過特定時間后取出3mL磷酸緩沖液并進行胰島素濃度分析，在試管中再補加3mL新鮮的37℃磷酸緩沖液。胰島素濃度采用PierceTMBCA蛋白分析試劑盒進行測量，胰島素工作曲線通過測量一系列胰島素標準溶液制作。圖2是復合水凝膠體外釋放胰島素的實驗結果，證明了負載胰島素的XG2/MC10復合水凝膠具有很好的緩釋效果并且胰島素的釋放量與水凝膠中的初始胰島素濃度有關。實施例8.對負載不同濃度阿霉素的XG2/MC10復合水凝膠進行體外釋放研究。方法如下：于試管底部加入1mL負載不同濃度阿霉素的XG2/MC10復合物溶液后，將試管置于37℃水浴中平衡30min使復合物溶液充分凝膠化。在試管中加入10mL37℃磷酸緩沖液，經過特定時間后取出3mL磷酸緩沖液并進行阿霉素濃度分析，在試管中再補加3mL新鮮的37℃磷酸緩沖液。阿霉素濃度通過480nm處的吸光度測量，阿霉素工作曲線通過測量一系列阿霉素標準溶液制作。圖3是復合水凝膠體外釋放阿霉素的實驗結果，證明了負載阿霉素的XG2/MC10復合水凝膠具有很好的長期緩釋效果。實施例9.對XG2/MC10復合物溶液的可注射性、在動物體內的凝膠化、生物相容性和生物降解性進行研究。方法如下：在室溫條件下使用帶23G針頭的注射器經皮下將XG2/MC10復合物溶液0.5mL注射到雄性SD大鼠（220g）的背部，對注射后的大鼠正常提供食物和水，經過不同時間飼養后將大鼠處死，手術切開復合物溶液的注射部位進行水凝膠形態和體積觀察并拍照。圖4的結果表明XG2/MC10復合物溶液注射到大鼠體內后形成了固體狀形態的水凝膠；5周后大部分的水凝膠消失，說明水凝膠在體內具有良好的生物降解性。圖4的結果還表明在水凝膠周圍沒有紅腫等炎癥現象出現，表明XG2/MC10復合水凝膠在動物體內具有良好的生物相容性。實施例10.負載胰島素的XG2/MC10復合水凝膠對糖尿病大鼠的治療效果評價。具體實驗如下，雄性SD大鼠（約220g）禁食一夜后在腹腔注射40mg/mL四氧嘧啶溶液（溶解于生理鹽水中）破壞大鼠的胰島β細胞，注射劑量為200mg/kg。注射之后禁食1小時后正常給食，4天之后利用血糖儀（ACCU-CHEKActiveKit,RocheDiagnostics,Mannheim,Germany）篩選出血糖大于300mg/dL的糖尿病大鼠。將糖尿病大鼠隨機分為四組，每組6只，分別進行如下實驗。水凝膠組1：在大鼠背部皮下注射1mLXG2/MC10復合物溶液；水凝膠組2：在大鼠背部皮下注射1mL負載0.4mg/mL胰島素的XG2/MC10復合物溶液；水凝膠組3：在大鼠背部皮下注射1mL負載0.8mg/mL胰島素的XG2/MC10復合物溶液；水凝膠組4：在大鼠背部皮下注射1mL負載1.2mg/mL胰島素的XG2/MC10復合物溶液。注射以后每天定時在尾部采血檢測血糖。表4是各實驗組的糖尿病大鼠注射負載胰島素的XG2/MC10復合物溶液以后的血糖值。與水凝膠組1相比，載胰島素水凝膠組都表現出明顯的降血糖的效果，一次注射可以維持藥效6~7天。表4.患糖尿病雄性SD大鼠注射負載不同濃度胰島素的XG2/MC10復合物溶液以后的血糖變化。