具有組織誘導性功能的多通道神經修復導管及模具的制作方法
【專利摘要】一種具有組織誘導性功能的多通道神經修復導管及模具，制取殼聚糖包被紅景天苷的微球和復合型紅景天苷緩釋微球，計算藥物累計釋放量，將不同含量的復合型紅景天苷緩釋微球與I型膠原蛋白混合，得紅景天苷緩釋微球/I型膠原蛋白；利用模具制備多孔徑柱狀神經導管芯層，高壓靜電紡絲技術制備納米纖維神經導管殼層，嵌套芯層和殼層，得具有組織誘導性功能的多通道神經修復導管。該導管的殼層具有良好的與組織液交換的作用，具備引導神經生長功能；芯層具有引導神經纖維定向生長，促進干細胞向雪旺施細胞定向分化，加速神經纖維生長和功能恢復；有效修復外周神經缺損，具有良好的降解性和生物相容性，符合組織工程支架材料的要求。
【專利說明】具有組織誘導性功能的多通道神經修復導管及模具
【技術領域】
[0001]本發明屬于醫學【技術領域】，涉及一種神經修復導管，特別涉及一種具有組織誘導性功能的多通道神經修復導管；本發明還涉及一種該多通道神經修復導管制備過程中使用的模具。
【背景技術】
[0002]外周神經損傷是臨床最常見的創傷之一。隨著現代建筑業、交通運輸業的發展以及重大自然災害和局部戰爭的頻發，外周神經損傷的發生率呈逐年上升趨勢。外周神經損傷常常造成神經支配區域退行性病變和功能障礙，長期影響患者的身心健康和生活質量，已成為世界醫學面臨的挑戰之一。
[0003]利用組織工程學方法通過天然或合成的生物材料，構建不同的神經導管并用于外周神經損傷修復，是目前醫學、生物學研究的熱點。傳統的第1代組織工程化神經導管無論是天然材料還是人工材料，主要作用只是對神經纖維再生發揮引導功能，存在的主要問題有:1)不同的材料其生物相容性存在差異；2)材料降解性能不同，影響神經的再生；3)易形成疤痕結構，嚴重影響再生神經的生物學功能；4)合成的高分子材料缺乏細胞識別位點。這些不足嚴重制約了其在臨床的應用。
[0004]鑒于第1代神經導管的缺陷與不足，人們將研究視野轉向對材料(天然和合成材料)的改性及化學修飾等研究領域，通過改變材料的結構、修飾材料的分子基團和進行不同交聯劑的適度交聯等方法，開發了第2代神經導管修復支架材料，特別是靜電紡絲技術、高分子材料以及光敏感材料等的開發和研究，為神經損傷修復支架材料的構建提供了廣闊空間和前景。但是這類材料面臨的最大問題是材料缺乏組織誘導性(組織誘導性是指可直接誘導有生命的組織再生長的新型生物材料，通過構建組織誘導性生物材料達到既能支撐細胞形成組織的支架，又能誘導細胞形成組織)功能，不能完全模擬適合細胞和宿主適宜的組織微環境，在神經再生和修復方面距理想的材料還相差甚遠。
[0005]組織誘導性神經修復材料所面臨的問題主要是通過復合神經相關生長因子、基因載體或通過緩釋方法構建的材料雖然具有組織誘導性功能，但是復合的活性因子存在性能不穩定、易失活以及突釋等缺點，不能實現真正意義上的主動修復功能之目標。
[0006]紅景天苷單體是傳統中藥紅景天的主要有效成分,具有抗疲勞、抗衰老、耐缺氧和對神經細胞具有明顯的保護作用，紅景天在臨床已得到廣泛使用。紅景天苷不僅能促進骨髓間充質干細胞分泌神經生長因子、腦源性神經生長因子和神經營養因子3，而且還能誘導MSCs向神經元樣細胞和施旺樣細胞定向分化。通過構建復合紅景天苷的神經導管，使其實現具有組織誘導性功能，有效解決外周神經損傷修復和功能恢復。
【發明內容】
[0007]本發明的目的是提供一種具有組織誘導性功能的多通道神經修復導管，具有組織誘導性，用于外周神經缺損修復，可有效提高外周神經損傷修復及其功能恢復，降低致殘率。
[0008]本發明的另一個目的是提供一種上述多通道神經修復導管制備過程中用于制備神經導管芯層的模具。
[0009]為實現上述目的，本發明所采用的技術方案是:一種具有組織誘導性功能的多通道神經修復導管及模具，該按神經修復導管以下步驟制得:
步驟1:按質量比1: 5、1: 10或1: 50，分別取紅景天苷和殼聚糖，均勻混合，用三聚磷酸鹽方法制備殼聚糖包被紅景天苷的微球；該微球經1%京尼平37°C交聯lh，真空冷凍干燥；
步驟2:將聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物溶于氯仿中，得到飽和溶液，加入步驟1制備的微球，攪拌，除去氯仿，離心，蒸餾水分散，得到復合型紅景天苷緩釋微球，室溫干燥；
步驟3:將復合型紅景天苷緩釋微球置于小錐形瓶中，加入pH值為7.2的磷酸緩沖液，密閉置于溫度為36?37°C、振蕩速度為80?100次/min的恒溫振蕩箱中，在30min、lh、2h、4h、8h、12h、24h和72h，分別取樣，以后隔日至28天取樣，高效液相色譜測定不同取樣時間紅景天苷的藥物濃度，并依照紅景天苷標準曲線計算各取樣時間點的藥物累計釋放量；步驟4:根據復合型紅景天苷緩釋微球的藥物累計釋放量，將不同含量的復合型紅景天苷緩釋微球與I型膠原蛋白以質量比1: 25、1: 50或1: 100混合，獲得紅景天苷緩釋微球/1型膠原蛋白；
取包括右模本體、左模本體、縫合線上固定架、縫合線下固定架、頂端固定帽和底端固定帽的模具；右模本體和左模本體均為半圓筒形；縫合線上固定架的結構和縫合線下固定架的結構相同，均包括一根連接軸，沿該連接軸的徑向設有多個板狀的葉片；頂端固定帽的結構和底端固定帽的結構相同，均包括桶形的固定帽本體，該固定帽本體的側壁上設有通孔，固定帽本體的端面上設有多個穿線孔，一個固定帽上的通孔為進料孔，另一個固定帽上的通孔為排氣孔；
扣合右模本體和左模本體，形成管狀模腔；取數量與穿線孔數量相同的手術縫合線，一根手術縫合線依次穿過頂端固定帽上的一個穿線孔、該管狀模腔的管腔和底端固定帽上的一個穿線孔，多根手術縫合線互不相交，通過頂端固定帽和底端固定帽固定該管狀模腔，頂端固定帽的內孔、管狀模腔的管腔和底端固定帽的內孔形成一個與進料孔和排氣孔相通的腔體；從兩端拉緊手術縫合線，并用縫合線上固定架和縫合線下固定架從兩端分別固定伸出頂端固定帽和底端固定帽的手術縫合線；將紅景天苷緩釋微球/1型膠原蛋白通過進料孔注入腔體內，腔體內的空氣從排氣孔排出；注射完成后，封閉進料孔和排氣孔，置于_20°C的溫度下預冷凍2小時后，在_80°C的環境中冷凍24小時，然后，打開進料孔和排氣孔，置-40°C的溫度下真空冷凍24小時，將手術縫合線從固定架上松開，取下兩個固定帽，分離右模本體和左模本體，取出材料，將該材料1%京尼平37°C交聯lh，抽取材料中的手術縫合線，將去掉手術縫合線的材料截成段，置于_40°C的溫度下真空冷凍24h，得到多孔徑柱狀神經導管芯層，常溫條件下備用；
步驟5:按質量比1: 1，將I型膠原蛋白和聚己內酯混合，溶解于10mL六氟異丙醇內，得到質量百分比濃度為10%的溶液，采用高壓靜電紡絲技術制備納米纖維神經導管殼層，真空室溫干燥48?72 h，除去殘余六氟異丙醇，常溫儲存；
步驟6:將步驟4制得的多孔徑柱狀神經導管芯層嵌套于步驟5制得的納米纖維導管殼層內，1%京尼平37°c交聯lh，然后0.01M NaOH中和8?10 min，高純水洗，照射滅菌，制得具有組織誘導性功能的多通道神經修復導管。
[0010]本發明具有組織誘導性功能的多通道神經修復導管是一種復合紅景天苷藥物的膠原納米纖維神經導管支架材料，具有如下優點:
1)紅景天苷/殼聚糖微球的制備工藝達到設計要求，實現了藥物的緩釋作用；
2)導管殼層具有良好的吸水性、透氣性和孔隙率，實現支架材料具有良好的與組織液交換的作用；導管材料具有一定的力學強度確保導管不易塌陷，具備引導神經生長的功倉泛;
3)復合紅景天苷微球的導管芯層多孔道結構具有引導神經纖維定向生長，且通過紅景天苷藥物緩釋的作用促進干細胞向雪旺施細胞定向分化，加速神經纖維生長和功能恢復；
4)具有良好的降解性和生物相容性，符合組織工程支架材料的要求；
5)能有效修復外周神經缺損。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]圖1是本發明多通道神經修復導管制備過程中用于制備導管芯層的模具的結構示意圖
圖2是在圖1所示模具上穿入手術縫合線的示意圖圖。
[0012]圖3是圖1所示模具的使用狀態圖。
[0013]圖4是本發明實施例1制得的復合型紅景天苷緩釋微球的緩釋曲線圖。
[0014]圖5是本發明實施例1制得的導管芯層中含有的紅景天苷微球的緩釋曲線圖。
[0015]圖6是本發明多通道神經修復導管制備過程中制得的導管芯層縱斷面掃描電鏡圖。
[0016]圖7是本發明多通道神經修復導管制備過程中制得的導管芯層橫斷面掃描電鏡圖。
[0017]圖8是本發明多通道神經修復導管制備過程中制得的導管芯層材料與細胞復合的掃描電鏡圖。
[0018]圖9是本發明多通道神經修復導管中導管殼層交聯后的掃描電鏡圖。
[0019]圖10是本發明多通道神經修復導管中導管殼層表面接觸角圖。
[0020]圖11是本發明多通道神經修復導管中導管殼層交聯前后的紅外光譜圖。
[0021]圖1?3中:1.縫合線上固定架，2.穿線孔，3.頂端固定帽，4.進料孔，5.右模體上手柄，6.右模本體，7.右模體下手柄，8.底端固定帽、9.縫合線下固定架，10.左模體上手柄、11.左模本體，12.左模體下手柄，13.排氣孔，14.手術縫合線。
【具體實施方式】
[0022]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明進行詳細說明。
[0023]本發明提供了一種具有組織誘導性功能的多通道神經修復導管，以復合紅景天苷藥物的膠原納米纖維作為神經導管支架材料，具有組織誘導性，用于外周神經缺損修復，可有效提高外周神經損傷修復及其功能恢復，降低致殘率。該神經修復導管具體按以下步驟制得: 步驟1:按質量比1: 5、1: 10或1: 50，分別取紅景天苷和殼聚糖，均勻混合，利用三聚磷酸鹽方法制備殼聚糖包被紅景天苷的微球；該微球經1%京尼平37°C交聯lh，真空冷凍干燥后備用；
步驟2:將聚乳酸-聚輕基乙酸共聚物[Poly (DL-lactide-co glycolide), PLGA]溶于10mL氯仿中，得到飽和溶液，加入步驟1制備的微球10mg,磁力攪拌機按50?60轉/min攪拌2h后,置通風柜揮發除去氯仿,高速離心(15000rpm,溫度4°C )10min,加適量蒸懼水分散得到復合型紅景天苷緩釋微球，室溫干燥備用；
步驟3:運用光鏡、激光粒度測定儀和掃描電鏡分別評價復合型紅景天苷緩釋微球的形態、粒徑特性及表征；
光鏡下觀察復合型紅景天苷緩釋微球的形態，并測量一個視野中該微球直徑范圍；通過激光粒度測定儀測量其圓度、平均粒徑、粒徑范圍并計算平均直徑及膨脹率；計算微球的包封率和載藥量；掃描電鏡對微球進行表征；
步驟4:采用體外緩釋方法評價復合型紅景天苷緩釋微球的緩釋效果；
將lOOmg復合型紅景天苷緩釋微球置于小錐形瓶中，加入10 mL pH值為7.2的磷酸緩沖液，加塞密閉后置于溫度為36?37°C、振蕩速度為80?100次/min的恒溫振蕩箱中，在30min、lh、2h、4h、8h、12h、24h和72h，分別取樣，以后隔日至28天取樣，高效液相色譜測定不同取樣時間紅景天苷的藥物濃度，并依照紅景天苷標準曲線計算各取樣時間點的藥物累計釋放量；
步驟5:根據復合型紅景天苷緩釋微球的藥物累計釋放量，將不同含量的復合型紅景天苷緩釋微球與I型膠原蛋白以質量比1: 25、1: 50或1: 100混合(S卩lmg紅景天苷微球與25mg、50mg和100mg膠原蛋白(干重)混合)，具體方法是25mg、50mg和100mg I型膠原蛋白分別溶解于10mL 0.1%醋酸溶液中磁力攪拌過夜使其完全溶解,再加入lmg紅景天苷微球攪拌2小時，獲得紅景天苷緩釋微球/1型膠原蛋白；
取如圖1所示的模具，該模具包括右模本體6、左模本體11、縫合線上固定架1、縫合線下固定架9、頂端固定帽3和底端固定帽8 ;右模本體6的結構與左模本體11的結構相同，右模本體6和左模本體11均為半圓筒形，右模本體6的外側壁上并排設有右模體上手柄5和右模體下手柄7，左模本體11的外側壁上并排設有左模體上手柄10和左模體下手柄12 ；縫合線上固定架1的結構和縫合線下固定架9的結構相同，縫合線上固定架1包括一根連接軸，沿該連接軸的徑向設有多個板狀的葉片；頂端固定帽3的結構和底端固定帽8的結構相同，均包括桶形的固定帽本體，該固定帽本體的側壁上設有通孔，固定帽本體的端面上設有十二個穿線孔2，頂端固定帽3的固定帽本體側壁上的通孔為進料孔4，底端固定帽8的固定帽本體側壁上的通孔為排氣孔13。
[0024]使用該模具時:扣合右模本體6和左模本體11，形成管狀模腔，該管狀模腔的管腔直徑2.0?2.1 mm ;取12根手術縫合線14 (直徑0.2?0.3mm), 一根手術縫合線14依次穿過頂端固定帽3上的一個穿線孔2、該管狀模腔的管腔和底端固定帽8上的一個穿線孔2，且12根手術縫合線14互不相交，如圖2 ;用頂端固定帽3和底端固定帽8固定該管狀模腔，頂端固定帽3的內孔、管狀模腔的管腔和底端固定帽8的內孔形成一個腔體，該腔體與進料孔4和排氣孔13相通；從兩端拉緊手術縫合線14，12根手術縫合線14平行設置，用縫合線上固定架1和縫合線下固定架9從兩端分別固定伸出頂端固定帽3和底端固定帽8的手術縫合線14，如圖3 ;用5mL注射器將紅景天苷緩釋微球/1型膠原蛋白通過進料孔4注入腔體內，該腔體中的空氣通過排氣孔13排出；紅景天苷緩釋微球/1型膠原蛋白注射完成后，封閉進料孔4和排氣孔13，置于-20°C的溫度下預冷凍2小時后，在_80°C的環境中冷凍24小時，然后，打開進料孔4和排氣孔13，置-40°C的溫度下真空冷凍24小時，將手術縫合線14從縫合線上固定架1和縫合線下固定架9上松開，取下頂端固定帽3和底端固定帽8，分離右模本體6和左模本體11，取出材料，將該材料1%京尼平37°C交聯lh，抽取材料中的手術縫合線14，將去掉手術縫合線14的材料截成長度1.3mm的段，置于_40°C的溫度下真空冷凍24h后取出，得到多孔徑柱狀神經導管芯層，該導管芯層的直徑2.0?2.1 _、長度1.3mm,多孔孔徑為0.2?0.3mm,常溫條件下備用；
右模體上手柄5、右模體下手柄7、左模體上手柄10和左模體下手柄12的為了操作時易于安裝和拆卸模具。
[0025]步驟6:用高壓靜電紡絲技術制備納米纖維神經導管殼層:
按質量比1: 1，將I型膠原蛋白(干重)和聚己內酯混合，溶解于10mL六氟異丙醇內，得到質量百分比濃度為10%的溶液，采用高壓靜電紡絲技術制備納米纖維神經導管殼層，制備過程中米用的技術參數:電壓15?16 kV、距離12?15cm、推進速度1.5?2 mL/h ;制得的納米纖維神經導管殼層的長度200?220mm、內徑2.0?2.2 mm、外徑2.7?3.0 mm、厚度0.7?0.8 mm;真空室溫干燥48?72 h，除去殘余六氟異丙醇，常溫儲存備用；該納米纖維神經導管殼層呈純白色。
[0026]步驟7:將步驟4制得的多孔徑柱狀神經導管芯層嵌套于步驟5制得的納米纖維導管殼層內，1%京尼平37°C交聯lh，然后0.01M NaOH中和8?10 min，高純水洗5次，每次5?10min，40?50 1:真空冷凍干燥后分裝，6°Co (15?20KGY)照射滅菌，制得具有組織誘導性功能的多通道神經修復導管。
[0027]通過下列性能指標評價本發明具有組織誘導性功能的多通道神經修復導管制備過程中，取得的各種材料的性能:1)通過體外緩釋方法并結合高效液相色譜技術，獲得紅景天苷/殼聚糖微球包封率、載藥量和藥物緩釋量分別為56.14%,23.67%和40?46% ;激光粒度測定儀測得紅景天苷/殼聚糖微球平均粒徑為80?100 μ m ;平均粒徑和紅景天苷藥物緩釋量；2)利用電子天枰以稱重法分別檢測導管殼層的性能，其吸水率35.09?44.26%、透氣性87.64?90.68%、孔隙率72?78%，說明導管殼層具有良好的吸水性、透氣性和孔隙率，實現支架材料具有良好的與組織液交換的作用；用萬能力學材料機測試導管殼層的最大載荷40?42 N、斷裂載荷28.2?33.1 N、彈性模量1.42?1.66 N--mm 2 ;導管殼層具有一定的力學強度確保導管不易塌陷，具備引導神經生長的功能；采用AVATAR360型傅里葉變換紅外光譜儀檢測導管殼層交聯前后的紅外光譜圖；3)采用掃描電鏡觀察導管芯層的結構，復合紅景天苷微球的導管芯層多孔道結構具有引導神經纖維定向生長，且通過紅景天苷藥物緩釋的作用促進干細胞向雪旺施細胞定向分化，加速神經纖維生長和功能恢復；4)稱重法體外評價導管殼層的降解率為30.2?45.1%，將導管殼層生物與大鼠間充質干細胞復合培養和材料包埋于大鼠皮下組織，利用組織學方法評價了材料的生物相容性，證明材料與細胞和組織無免疫反應、無排斥反應，具有良好的組織相容性；5)通過復制大鼠坐骨神經缺損模型，評價神經導管的修復效果，即復制大鼠坐骨神經15mm缺損模型，采用顯微外科手術方法用本發明神經導管橋連神經斷端。分別于術后30?90天，利用運動足跡法、腓腸肌稱重法、神經傳導電生理發、組織染色方法、特殊染色方法和免疫組織化學方法，分別觀察并評價材料對外周神經損傷的修復效果。動物實驗結果表明，用神經導管橋連大鼠坐骨神經缺損15mm斷端60天后，60?70%的運動功能得到恢復，60天后其90%的運動功能得到恢復，肌肉萎縮程度從75?80%降至15?20% ;導管殼層近90?95%降解，斷端神經完全連接。結果顯示:該神經導管殼層能有效恢復大鼠的運動和神經傳導功能，促進損傷神經纖維再生，達到了修復外周神經缺損之目的。
[0028]對于材料的結構:
1)采用掃描電鏡、原子力顯微鏡和紅外光譜儀技術評價納米纖維神經導管殼層交聯前后表征；接觸角儀檢測材料的吸水性；質量法和體積變化測定法分別測定材料的含水率和膨脹率；液體交換法測定材料殼層的孔隙率；力學材料機評價干濕環境條件下導管支架材料楊氏模量的變化特征；
2)將導管殼層置于DMEM培養基中，在37°CC02培養箱進行培養，在培養ld、3d、7d、14d、21d和28d后，分別利用稱重法評價交聯前后納米纖維神經導管殼層的降解性能；試驗表明，神經導管支架材料具有良好的降解性能，適合組織工程支架材料的要求。
[0029]3)將導管芯層置于 0.01M PBS 溶液中，37°C搖床，于 30min、lh、2h、4h、8h、12h、24h、72h，并以后隔日至28天分別取樣，利用HPLC檢測并分析導管材料中紅景天苷藥物緩釋效果。
[0030]動物學實驗
選用清潔級Wistar大鼠63只，體重220?250g，雌雄不拘，隨機分為3組，即對照組(無導管連接)、實驗組(采用本發明神經導管)和自體神經移植組，每組21只，其中實驗組、對照組和自體神經移植組分別設置相同數目的大鼠復制缺損模型用無復合MSCs的導管連接作為相應對照。按每千克體重注射30mg的用量給三組中的大鼠腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，無菌環境下分離坐骨神經，坐骨神經缺損長度為15_，外科顯微鏡下按照不同分組要求進行缺損神經連接術。術后清潔級環境下飼養，分別于1周、2周、4周、8周、12周、16周和24周時，通過運動足跡法、腓腸肌稱重法、神經傳導電生理方法、組織染色方法、特殊染色方法和免疫組織化學方法，分別觀察并綜合評價材料對外周神經損傷的修復效果。
[0031]1)運動功能評價
術后每月用運動足跡分析方法評分大鼠的運動功能，采用Bain方法評價神經功能指數；實驗組大鼠的運動功能明顯高于對照組0°〈0.01);局部熱刺激和針刺激方法評價移植導管部位的疼痛反應并積分，評價結果顯示，實驗組大鼠的疼痛積分明顯高于缺損組0°〈0.01)；
2)再生神經傳導功能
分別于術后第1周、4周、8周、12周和24周暴露神經導管連接部位，運用Keypoint4C型肌電描記術檢測再生神經傳導的潛伏期、波幅、傳導速度和肌肉動作電位，對照組和實驗組大鼠的神經傳導速度分別為28.212.43和88.411.68m/s，兩者差異具有統計學意義0°〈0.01);采用ELISA方法檢測術后第1周、4周、8周、12周、24周大鼠血清中腫瘤壞死因子(TNF-α )、白介素-10、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛的含量；同時取心臟、肝臟和腎臟用10 %福爾馬林固定、常規包蠟切片、HE染色，觀察其組織結構；結果顯示，該發明材料對動物無毒副作用，具有生物安全性。
[0032]3)新生神經纖維評價
術后16周，分離橋接的坐骨神經，4% fast blue溶液5--L注射于遠心端距縫合處5mm的神經內，生理鹽水沖洗防止非特異性染色。6d后分析再生神經中運動神經纖維的數目、大小及分布，實驗組大鼠的神經纖維的數目和單位面積數明顯多于對照組；采用解剖顯微鏡分離腓腸肌，檢測腓腸肌的比重率〔比重率=(實驗組腓腸肌重量/對照組腓腸肌重量)X 100%〕，實驗組腓腸肌的比重率顯著高于對照組；
4)組織學分析
全長再生神經(縱切)和中段(橫切)取材，常規石蠟包被，HE染色，光學顯微鏡下觀察分析宿主組織/材料的生物相容性、炎性反應程度和宿主/材料界面形成的組織結構特征，結果顯示，宿主/材料界面無炎性細胞，并隨著時間延長神經修復導管逐步被降解吸收；免疫組織化學方法檢測再生神經(縱切和橫切)中NF-200和S-100 β的表達，實驗組NF-200和S-ΙΟΟβ呈明顯陽性表達。
[0033]5)再生神經纖維特征評價
利用半薄切片甲苯胺藍染色觀察術后不同時間神經纖維的數目/密度、髓鞘厚度、軸突面積和神經纖維的周長，分析并統計不同實驗組再生神經纖維的變化特征；結果顯示:實驗組神經纖維的數目/密度、髓鞘厚度、軸突面積和神經纖維的周長與自體神經移植組比較無統計學差異0°>0.01);冰凍切片(15 μ m厚)熒光顯微鏡下觀察BrdU標記MSCs的分布和數量，該結果顯示，移植的干細胞參與了損傷神經的再生和修復。
[0034]通過上述動物實驗證實:本發明多通道神經修復導管具有引導神經再生的功能，同時也具有通過緩釋紅景天苷加速神經再生和功能恢復的作用，實現了具有組織誘導性神經修復的組織工程支架材料，以期用于臨床。
[0035]本發明神經修復導管的原材料為天然膠原蛋白，來源豐富，膠原蛋白提取工藝成熟、規范、流程簡單；電紡技術成熟、易行，所用材料無毒、易降解且具有良好的生物相容性。紅景天苷/殼聚糖微球的制備工藝達到設計要求，實現了藥物的緩釋效果。
[0036]實施例1
按質量比1: 5，分別取紅景天苷和殼聚糖，均勻混合，利用三聚磷酸鹽方法制備殼聚糖包被紅景天苷的微球；該微球經1%京尼平37°C交聯lh，真空冷凍干燥后備用；將聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物溶于氯仿中，得到飽和溶液，加入10 mg制備的微球，磁力攪拌機50轉/min攪拌2h,通風柜中揮發除去氯仿，溫度4°C、15000rpm離心lOmin,加適量蒸懼水分散得到復合型紅景天苷緩釋微球，室溫干燥備用；運用光鏡、激光粒度測定儀和掃描電鏡分別評價復合型紅景天苷緩釋微球的形態、粒徑特性及表征；采用體外緩釋方法評價復合型紅景天苷緩釋微球的緩釋效果；即將lOOmg復合型紅景天苷緩釋微球置于小錐形瓶中，力口入10 mL pH值為7.2的磷酸緩沖液，加塞密閉后置于溫度為36°C、振蕩速度為100次/min的恒溫振蕩箱中，在30min、lh、2h、4h、8h、12h、24h和72h，分別取樣，以后隔日至28天取樣，高效液相色譜測定不同取樣時間紅景天苷的藥物濃度；同時將紅景天苷標準品按照濃度1、10、100和1000 μ g/mL配制后，通過紫外分光光度儀繪制紅景天苷標準曲線。根據高效液相色譜測定不同時間紅景天苷的藥物濃度，計算各取樣時間點的藥物累計釋放量；該復合型紅景天苷緩釋微球的緩釋曲線圖，如圖4所示；圖中顯示，該紅景天苷緩釋微球具有藥物緩釋效果。根據復合型紅景天苷緩釋微球的藥物累計釋放量，將不同含量的復合型紅景天苷緩釋微球與I型膠原蛋白以質量比1: 25、1: 50或1: 100混合(即lmg紅景天苷微球與25mg、50mg和lOOmg膠原蛋白(干重)混合)，具體方法是25mg、50mg和lOOmg I型膠原蛋白分別溶解于10mL 0.1%醋酸溶液中磁力攪拌過夜是其完全溶解,再加入lmg紅景天苷微球攪拌2小時，獲得紅景天苷緩釋微球/1型膠原蛋白。利用自行設計的特制專用模具如圖1-3所示，具體操作過程是:12根縫合線(直徑0.2?0.3mm)分別垂直穿過上下固定帽頂端(上下孔對齊且線與線平行排列)，線束置模具左右本體吻合形成的管道中，上下固定帽固定模具本體，拉緊上下固定帽頂端線并固定于固定架；利用5mL注射器通過模具頂端進料孔(4 )將紅景天苷緩釋微球/1型膠原蛋白注入模具中，推進原料的同時通過排氣孔(13)排出管腔中空氣；原料注射完成后透明膠封閉進料孔和排氣孔，_20°C預冷凍2小時后，_80°C冰箱冷凍24小時，除去進料孔和排氣孔的透明膠，置_40°C真空冷凍24小時，松解模具兩端縫合線取出材料，1%京尼平37°C交聯lh，抽取材料中的手術縫合線，截斷成
1.3_長度，置-40°C真空冷凍24h后取出，松解縫合線固定架，取下固定帽，解開模本體；成型膠原材料1%京尼平37°C交聯lh，抽取材料中的手術縫合線，制得多孔徑柱狀神經導管芯層，該導管芯層中含有的紅景天苷微球的緩釋曲線圖，如圖5所示，從圖中可看出緩釋早期紅景天苷釋放減少，隨著時間延長紅景天苷釋放量明顯增加，達到了藥物緩釋效果；該導管芯層的縱斷面掃描電鏡圖，如圖6所示；該導管芯層的橫斷面掃描電鏡圖，如圖7所示；該導管芯層的橫斷面掃描電鏡圖，如圖8所示，圖6?圖8顯示，該導管芯層的直徑2.0?
2.1 mm、長度20?40mm,為多孔道結構的膠原蛋白，孔道直徑0.2?0.3mm ;紅景天苷/殼聚糖微球均勻分布于導管芯層材料中。該導管芯層含紅景天苷微球/膠原以及空白微球/膠原，于40°C真空冷凍干燥后，常溫條件下備用；按質量比1: 1，將I型膠原蛋白(干重)和聚己內酯混合，溶解于10mL六氟異丙醇內，得到質量百分比濃度為10%的溶液，采用高壓靜電紡絲技術制備納米纖維神經導管殼層，制備過程中采用的技術參數:電壓15kV、距離12cm、推進速度1.5mL/h ;制得的納米纖維神經導管殼層的長度200?220mm、內徑2.0?2.2 mm、外徑3.0 mm、厚度1.0?0.8 mm ;真空室溫干燥48 h,除去殘余六氟異丙醇，常溫儲存備用；該納米纖維神經導管殼層呈純白色。將制得的多孔徑柱狀神經導管芯層嵌套于制得的納米纖維導管殼層內，1%京尼平37°C交聯lh，然后0.01M NaOH中和8 min，高純水洗5次，每次5min，40°C真空冷凍干燥后分裝，60Co (15?20KGY)照射滅菌，制得具有組織誘導性功能的多通道神經修復導管。交聯后納米纖維神經導管殼層的顏色呈現深藍色，其掃描電鏡圖(2000X)，如圖7所示，從圖中可以看出，電紡的膠原為納米纖維，交錯排列且具有一定孔隙。該納米纖維神經導管殼層的接觸角實驗圖，如圖8所示，從圖中可看出，交聯前材料的吸水性差，交聯后材料的接觸角為0°，具有強的吸水性；納米纖維神經導管殼層交聯前后的紅外光譜圖，見圖9，圖中顯示，交聯前后材料的表征發生改變。
[0037]實施例2
按質量比1: 10，分別取紅景天苷和殼聚糖，均勻混合，利用三聚磷酸鹽方法制備殼聚糖包被紅景天苷的微球；該微球經1%京尼平37°c交聯lh，真空冷凍干燥后備用；將聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物溶于氯仿中，得到飽和溶液，加入10mg制備的微球，磁力攪拌機按60轉/min攪拌2h后，通風柜中除去氯仿，溫度4°C、15000rpm離心lOmin,加適量蒸懼水分散得到復合型紅景天苷緩釋微球，室溫干燥備用；運用光鏡、激光粒度測定儀和掃描電鏡分別評價復合型紅景天苷緩釋微球的形態、粒徑特性及表征；采用體外緩釋方法評價復合型紅景天苷緩釋微球的緩釋效果；即將lOOmg復合型紅景天苷緩釋微球置于小錐形瓶中，加入10 mL pH值為7.2的磷酸緩沖液，加塞密閉后置于溫度為36.5°C、振蕩速度為90次/min的恒溫振蕩箱中，在30min、lh、2h、4h、8h、12h、24h和72h，分別取樣，以后隔日至28天取樣，高效液相色譜測定不同取樣時間紅景天苷的藥物濃度，并依照紅景天苷標準曲線計算各取樣時間點的藥物累計釋放量；根據復合型紅景天苷緩釋微球的藥物累計釋放量，將不同含量的復合型紅景天苷緩釋微球與I型膠原蛋白以質量比1: 25、1: 50或1: 100混合(SPlmg紅景天苷微球與25mg、50mg和lOOmg膠原蛋白(干重)混合)，具體方法是:25mg、50mg和lOOmg I型膠原蛋白分別溶解于10mL 0.1%醋酸溶液中磁力攪拌過夜是其完全溶解，再加入lmg紅景天苷微球攪拌2小時，獲得紅景天苷緩釋微球/1型膠原蛋白溶液。12根縫合線(直徑0.2?0.3mm)分別垂直穿過上下固定帽頂端(上下孔對齊且線與線平行排列)，線束置模具左右本體吻合形成的管道中，上下固定帽固定模具本體，拉緊上下固定帽頂端線并固定于固定架；利用5mL注射器通過模具頂端進料孔(4)將紅景天苷緩釋微球/1型膠原蛋白注入模具中，推進原料的同時通過排氣孔(13)排出管腔中空氣；原料注射完成后透明膠封閉進料孔和排氣孔，_20°C預冷凍2小時后，-80°C冰箱冷凍24小時，除去進料孔和排氣孔的透明膠，置_40°C真空冷凍24小時，松解模具兩端縫合線取出材料，1%京尼平37°C交聯lh，抽取材料中的手術縫合線，截斷成1.3_長度，置-40°C真空冷凍24h后取出，松解縫合線固定架，取下固定帽，解開模本體；成型膠原材料1%京尼平37°C交聯lh，抽取材料中的手術縫合線，制得多孔徑柱狀神經導管芯層，該導管芯層的直徑2.0?2.1 _、長度20?40mm，其中的孔徑為0.2?0.3mm，該導管芯層含紅景天苷微球/膠原以及空白微球/膠原，于50°C真空冷凍干燥后，常溫條件下備用；按質量比1: 1，將I型膠原蛋白(干重)和聚己內酯混合，溶解于10mL六氟異丙醇內，得到質量百分比濃度為10%的溶液，采用高壓靜電紡絲技術制備納米纖維神經導管殼層，制備過程中采用的技術參數:電壓16 kV、距離15cm、推進速度2 mL/h ;制得的納米纖維神經導管殼層的長度200?220mm、內徑2.0?2.2mm、外徑2.7?3.0 mm、厚度0.7?0.8 mm ;真空室溫干燥72 h,除去殘余六氟異丙醇,常溫儲存備用；該納米纖維神經導管殼層呈純白色。將多孔徑柱狀神經導管芯層嵌套于納米纖維導管殼層內，1%京尼平37°C交聯lh，然后0.01M NaOH中和10 min，高純水洗5次，每次10min，50 1:真空冷凍干燥后分裝，6°Co (15?20KGY)照射滅菌，制得具有組織誘導性功能的多通道神經修復導管。
[0038]實施例3
按質量比1: 50，分別取紅景天苷和殼聚糖，均勻混合，利用三聚磷酸鹽方法制備殼聚糖包被紅景天苷的微球；該微球經1%京尼平37°C交聯lh，真空冷凍干燥后備用；將聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物溶于氯仿中，得到飽和溶液，加入10mg微球，磁力攪拌機按55轉/min攪拌2h后,通風柜中揮發除去氯仿,溫度4°C、15000rpm高速離心lOmin,加適量蒸懼水分散得到復合型紅景天苷緩釋微球，室溫干燥備用；運用光鏡、激光粒度測定儀和掃描電鏡分別評價復合型紅景天苷緩釋微球的形態、粒徑特性及表征；采用體外緩釋方法評價復合型紅景天苷緩釋微球的緩釋效果；即將lOOmg復合型紅景天苷緩釋微球置于小錐形瓶中，加入10 mL pH值為7.2的磷酸緩沖液，加塞密閉后置于溫度為37°C、振蕩速度為80次/min的恒溫振蕩箱中，在30min、lh、2h、4h、8h、12h、24h和72h，分別取樣，以后隔日至28天取樣，高效液相色譜測定不同取樣時間紅景天苷的藥物濃度，并依照紅景天苷標準曲線計算各取樣時間點的藥物累計釋放量；根據復合型紅景天苷緩釋微球的藥物累計釋放量，將不同含量的復合型紅景天苷緩釋微球與I型膠原蛋白以質量比1: 25、1: 50或1: 100混合(gplmg紅景天苷微球與25mg、50mg和lOOmg膠原蛋白(干重)混合),利用本發明的專用模具制得多孔徑柱狀神經導管芯層，該導管芯層的直徑2.0?2.1 mm、長度20?40mm，其中的孔徑為0.2?0.3mm,該導管芯層含紅景天苷微球/膠原以及空白微球/膠原，于40?50°C真空冷凍干燥后，常溫條件下備用；按質量比1: 1，將I型膠原蛋白(干重)和聚己內酯混合，溶解于10mL六氟異丙醇內，得到質量百分比濃度為10%的溶液，采用高壓靜電紡絲技術制備納米纖維神經導管殼層，制備過程中采用的技術參數:電壓15.5 kV、距離14cm、推進速度1.8mL/h ;制得的納米纖維神經導管殼層的長度200?220mm、內徑2.0?2.2 mm、夕卜徑2.7?3.0 mm、厚度0.7?0.8 mm ;真空室溫干燥60h,除去殘余六氟異丙醇,常溫儲存備用；該納米纖維神經導管殼層呈純白色。將多孔徑柱狀神經導管芯層嵌套于納米纖維導管殼層內，1%京尼平37°C交聯lh，然后0.01M NaOH中和9 min，高純水洗5次，每次8min，45°C真空冷凍干燥后分裝，6°Co (15?20KGY)照射滅菌，制得具有組織誘導性功能的多通道神經修復導管。
【權利要求】
1.一種具有組織誘導性功能的多通道神經修復導管，其特征在于，該神經修復導管按以下步驟制得: 步驟1:按質量比1: 5、1: 10或1: 50，分別取紅景天苷和殼聚糖，均勻混合，用三聚磷酸鹽方法制備殼聚糖包被紅景天苷的微球；該微球經1%京尼平37°C交聯lh，真空冷凍干燥； 步驟2:將聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物溶于氯仿中，得到飽和溶液，加入步驟1制備的微球，攪拌，除去氯仿，離心，蒸餾水分散，得到復合型紅景天苷緩釋微球，室溫干燥； 步驟3:將復合型紅景天苷緩釋微球置于小錐形瓶中，加入pH值為7.2的磷酸緩沖液，密閉置于溫度為36?37°C、振蕩速度為80?100次/min的恒溫振蕩箱中，在30min、lh、2h、4h、8h、12h、24h和72h，分別取樣，以后隔日至28天取樣，高效液相色譜測定不同取樣時間紅景天苷的藥物濃度，并依照紅景天苷標準曲線計算各取樣時間點的藥物累計釋放量；步驟4:根據復合型紅景天苷緩釋微球的藥物累計釋放量，將不同含量的復合型紅景天苷緩釋微球與I型膠原蛋白以質量比1: 25、1: 50或1: 100混合，獲得紅景天苷緩釋微球/1型膠原蛋白； 取包括右模本體(6)、左模本體(11)、縫合線上固定架(1)、縫合線下固定架(9)、頂端固定帽(3)和底端固定帽(8)的模具；右模本體(6)和左模本體(11)均為半圓筒形；縫合線上固定架(1)的結構和縫合線下固定架(9)的結構相同，包括一根連接軸，沿該連接軸的徑向設有多個板狀的葉片；頂端固定帽(3)的結構和底端固定帽(8)的結構相同，均包括桶形的固定帽本體，該固定帽本體的側壁上設有通孔，固定帽本體的端面上設有多個穿線孔(2)，一個固定帽上的通孔為進料孔(4)，另一個固定帽上的通孔為排氣孔(13); 扣合右模本體(6 )和左模本體(11)，形成管狀模腔；取數量與穿線孔(2 )數量相同的手術縫合線(14)，一根手術縫合線(14)依次穿過頂端固定帽(3)上的一個穿線孔(2)、該管狀模腔的管腔和底端固定帽(8)上的一個穿線孔(2)，多根手術縫合線(14)互不相交，通過頂端固定帽(3)和底端固定帽(8)固定該管狀模腔，頂端固定帽(3)的內孔、管狀模腔的管腔和底端固定帽(8)的內孔形成一個與進料孔(4)和排氣孔(13)相通的腔體；從兩端拉緊手術縫合線(14)，并用縫合線上固定架(1)和縫合線下固定架(9)從兩端分別固定伸出頂端固定帽(3)和底端固定帽(8)的手術縫合線(14);將紅景天苷緩釋微球/1型膠原蛋白通過進料孔(4)注入腔體內，腔體內的空氣從排氣孔(13)排出；注射完成后，封閉進料孔(4)和排氣孔(13)，置于-20°C的溫度下預冷凍2小時后，在-80°C的環境中冷凍24小時，然后，打開進料孔(4)和排氣孔(13)，置-40°C的溫度下真空冷凍24小時，將手術縫合線(14)從固定架上松開，取下兩個固定帽，分離右模本體(6)和左模本體(11)，取出材料，將該材料1%京尼平37°C交聯lh，抽取材料中的手術縫合線(14)，將去掉手術縫合線(14)的材料截成段，置于-40°C的溫度下真空冷凍24h，得到多孔徑柱狀神經導管芯層，常溫條件下備用；步驟5:按質量比1: 1，將I型膠原蛋白和聚己內酯混合，溶解于10mL六氟異丙醇內，得到質量百分比濃度為10%的溶液，采用高壓靜電紡絲技術制備納米纖維神經導管殼層，真空室溫干燥48?72 h，除去殘余六氟異丙醇，常溫儲存； 步驟6:將步驟4制得的多孔徑柱狀神經導管芯層嵌套于步驟5制得的納米纖維導管殼層內，1%京尼平37°C交聯lh，然后0.01M NaOH中和8?10 min，高純水洗，照射滅菌，制得具有組織誘導性功能的多通道神經修復導管。
2.如權利要求1所述的具有組織誘導性功能的多通道神經修復導管，其特征在于，所述步驟2中在4°C溫度下、15000rpm離心lOmin。
3.如權利要求1所述的具有組織誘導性功能的多通道神經修復導管，其特征在于，在步驟2制得復合型紅景天苷緩釋微球后，用光鏡、激光粒度測定儀和掃描電鏡分別評價復合型紅景天苷緩釋微球的形態、粒徑特性及表征；光鏡下觀察復合型紅景天苷緩釋微球的形態，并測量一個視野中該微球直徑范圍；通過激光粒度測定儀測量其圓度、平均粒徑、粒徑范圍并計算平均直徑及膨脹率；計算微球的包封率和載藥量；掃描電鏡對微球進行表征。
4.如權利要求1所述的具有組織誘導性功能的多通道神經修復導管，其特征在于，所述步驟3中，將25mg、50mg和lOOmg I型膠原蛋白分別溶解于10mL 0.1%醋酸溶液中磁力攪拌過夜使其完全溶解，再加入lmg紅景天苷微球攪拌2小時，獲得紅景天苷緩釋微球/1型膠原蛋白。
5.如權利要求1所述的具有組織誘導性功能的多通道神經修復導管，其特征在于，所述步驟5制備納米纖維神經導管殼層的過程中采用的電壓15?16 kV、距離12?15cm、推進速度1.5?2 mL/h。
6.如權利要求1所述的具有組織誘導性功能的多通道神經修復導管，其特征在于，所述步驟6中，高純水5次，每次5?lOmin，40?50 1:真空冷凍干燥后分裝，6°Co (15?20KGY)照射滅菌。
7.—種權利要求1所述具有組織誘導性功能的多通道神經修復導管中所用多孔徑柱狀神經導管芯層制備過程中使用的模具，其特征在于，該模具包括右模本體(6)、左模本體(11)、縫合線上固定架(1)、縫合線下固定架(9)、頂端固定帽(3)和底端固定帽(8);右模本體(6)和左模本體(11)均為；縫合線上固定架(1)的結構和縫合線下固定架(9)的結構相同，包括一根連接軸，沿該連接軸的徑向設有多個板狀的葉片；頂端固定帽(3)的結構和底端固定帽(8)的結構相同，均包括桶形的固定帽本體，該固定帽本體的側壁上設有通孔，固定帽本體的端面上設有十二個穿線孔(2)，一個固定帽上的通孔為進料孔(4)，另一個固定帽上的通孔為排氣孔(13); 使用時:扣合右模本體(6)和左模本體(11)，形成管狀模腔；取12根手術縫合線14，一根手術縫合線(14)依次穿過頂端固定帽(3)上的一個穿線孔(2)、該管狀模腔的管腔和底端固定帽(8)上的一個穿線孔(2)，12根手術縫合線(14)互不相交，通過頂端固定帽(3)和底端固定帽(8)固定該管狀模腔，頂端固定帽(3)的內孔、管狀模腔的管腔和底端固定帽(8)的內孔形成一個與進料孔(4)和排氣孔(13)相通的腔體；從兩端拉緊手術縫合線(14)，并用縫合線上固定架(1)和縫合線下固定架(9)從兩端分別固定伸出頂端固定帽(3)和底端固定帽(8)的手術縫合線(14);將紅景天苷緩釋微球/1型膠原蛋白通過進料孔(4)注入腔體內，腔體內的空氣從排氣孔(13)排出；注射完成后，封閉進料孔(4)和排氣孔(13)。
【文檔編號】A61L29/04GK104399131SQ201410561695
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年10月21日 優先權日:2014年10月21日
【發明者】趙紅斌, 甄平, 董菊子, 李曉云, 孫宏斌, 李 根, 王九娜, 唐俊杰, 趙玲 申請人:趙紅斌