神經生長因子在制備治療脊髓損傷藥物中的應用的制作方法

神經生長因子在制備治療脊髓損傷藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種神經生長因子(NGF)在制備治療脊髓損傷的應用。NGF在制備治療脊髓損傷藥物中的應用，藥物的形式可以是粉針劑、水劑、脂質體。NGF可以抑制內質網應激，減少內質網引起的脊髓神經元凋亡，從而對脊髓損傷產生治療作用。
【專利說明】神經生長因子在制備治療脊髓損傷藥物中的應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種NGF的應用，尤其涉及NGF在制備治療脊髓損傷藥物中的應用，包 括各種因素導致的脊髓原發性損傷和繼發性損傷的治療。

【背景技術】
[0002] 脊髓損傷（Spinal Cord Injury，SCI)是一種嚴重的神經系統創傷，通常可導致嚴 重的神經功能障礙和殘疾，不僅影響患者個人生理及心理，而且對家庭及社會造成沉重的 負擔。世界上脊髓損傷癱瘓病人有上千萬，我國亦逾百萬，據統計美國每年新增1萬多傷病 員，我國僅北京地區脊髓損傷發生率約800人/年。已成為高發傷病之一。
[0003] 脊髓損傷可以分為原發性損傷和繼發性損傷。脊髓損傷發生后，其損傷臨近部位 的組織受損破壞，發生出血、壞死，為原發性損傷；隨后損傷區及臨近部分發生缺血、再灌注 損傷，脂質過氧化產生氧自由基損害，細胞內鈣離子超載，炎癥介質產生，興奮性神經遞質 損害，細胞凋亡等一系列病理生理過程，稱為繼發性損傷。繼發性損傷是一種細胞和分子水 平主動調節的過程，具有可逆性。繼發性損傷可加重原發性損傷，造成脊髓功能障礙，致使 機體全癱或部分癱瘓。如果能阻斷此連鎖反應中的某一環節，則可能明顯減輕繼發性損傷， 促進脊髓功能的恢復。而對原發性脊髓損傷的主要依靠外科手術，到目前為止尚無有效治 療發現，故對繼發性損傷進行藥物控制治療，有可能成為減輕脊髓損傷的有效途徑。
[0004] 研宄表明，脊髓損傷繼發性與神經細胞凋亡有關，細胞凋亡又稱細胞程序性死亡， 是指細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，自己結束其生命的過程。其受控于 一系列基因順序表達而發現的主動的耗能的自殺性死亡，是維持機體細胞種類和數量動態 平衡的重要機制，與多種疾病的發生發展密切相關。目前已知的三條主要信號轉導途徑來 控制細胞凋亡：1、線粒體通路；2、死亡受體通路；3、內質網通路。內質網通路機制是近年來 發現的一條新的凋亡途徑，且很多動物實驗已被初步證明內質網通路參與了脊髓損傷的繼 發性病理機制。內質網是真核細胞中重要的細胞器，參與蛋白質合成、折疊和寡聚化，還參 與脂類代謝、類固醇代謝的合成以及Ca 2+調節等。內質網非常敏感，葡萄糖營養素的缺乏、 蛋白質糖基化的抑制、二硫鍵形成的障礙、蛋白質運轉異常、Ca 2+耗竭等刺激均可導致內質 網功能失調，即內質網應激。內質網應激時內質網內蛋白質不能正確折疊而被大量滯留， 導致未折疊蛋白反應，激發內質網和高爾基體、細胞核之間的信號轉導，抑制蛋白質合成并 啟動內質網相關基因轉錄，一定程度的內質網應激可增強內質網的應激能力，促進內質網 功能恢復。但是內質網應激持續存在或過強時將誘導內質網相關性蛋白細胞凋亡，造成組 織損傷。脊髓損傷時，發生的缺血缺氧、酸中毒、ATP耗竭、媽超載以及大量自由基生成等均 可誘導內質網應激，從而使其在脊髓損傷發生發展中具有重要意義。
[0005] 未折疊蛋白應答是一種對抗內質網應激的自身保護機制，有利于細胞內環境的穩 定。其由一個內質網分子伴侶GRP78和3個內質網應激感受蛋白所介導，分別是IRE-1、 ATF6、PERK。無內質網應激時IRE-1、ATF6、I3ERK分別與分子伴侶GRP78結合，處于無活性 狀態。一旦內質網應激，GRP78從3種跨U旲蛋白上解尚，轉而去結合未折萱蛋白。解尚后的 感受蛋白被活化并啟動為折疊蛋白應答，降低未折疊或錯誤折疊蛋白在內質網內的積累， 通過IRE-1、ATF6、PERK三條信號途徑，恢復內質網的正常功能，是一個促生存相應。長時間 或過量的應激，會損傷內質網，這三條通路同時也能誘導內質網應激介導的細胞凋亡信號 通路，去除無功能細胞，其并非直接誘導凋亡，而是通過激活下游凋亡信號分子：Ca SpaSel2 和GADD153/CH0P是內質網應激特異性的轉錄因子，在死亡受體和線粒體通路中不被活化。
[0006] 目前對于脊髓損傷治療，在臨床尚無特殊用藥，治療不是很理想。損傷早期多用糖 皮質激素（地塞米松、甲基強的松龍等）來減輕炎癥反應。甲基強的松龍是目前應用最為 廣泛且公認最有效的治療脊髓損傷的藥物。大劑量應用甲基強的松龍可通過多種機制阻止 脊髓損傷繼發性損傷的發生，但是其在臨床應用中會導致病人出現過敏、休克，導致或加重 潰瘍、糖尿病等相關并發癥，為治療脊髓損傷增加了一定的風險，也引起了臨床醫生的擔憂 和警惕。故研發一種副作用少且有療效的脊髓損傷治療藥物已經成為目前研宄的熱點和難 點。
[0007] 近來研宄表明，脊髓損傷后給予外源性生長因子可以促進神經功能的恢復。神經 營養因子還可與其他中和軸突生長抑制因子，共同起到促進軸突生長和補充的作用。
[0008] 自1953年意大利科學家Levi-montalcini發現NGF，至今已有60年歷史。神經 生長因子（NGF)是神經營養因子中最早被發現且是目前研宄最為透徹的。現在研宄最多的 NGF是從小鼠頒下腺中分離的分子量為140 000的糖蛋白。它包含α、β、γ三個亞單位， 活性區是β亞單位，由兩個118個氨基酸組成的單鏈通過非共價鍵結合而成的二聚體，與 人體NGF的結構具有高度的同源性，生物效應也無明顯的種間特異性。NGF是具有神經元 營養和促突起生長雙重生物學功能的一種神經細胞生長調節因子，它對中樞及周圍神經 元的發育、分化、生長、再生和功能特性的表達均具有重要的調控作用。作為神經營養因子 最重要的當然是它的神經營養作用，在胚胎發育的一定時期內，NGF為效應神經元生存所必 須。體外實驗證實，如果培養液中不加 NGF，神經細胞即不能長出軸突，也不能存活。NGF及 其受體也廣泛分布于中樞神經系統，由海馬和腦皮質產生的NGF可通過膽堿能神經逆行運 輸至前腦基底核，維持膽堿能神經元的存活和功能。在胚胎發育早期，中樞NGF的含量決定 膽堿能神經的密度。在無膽堿能神經支配的小腦區和下丘腦，NGF含量也較高，表明除膽堿 能神經外，NGF對其他類神經元也有營養作用。同時NGF還具有神經保護作用當NGF的效 應神經元受到損傷時，例如切斷軸突、藥物損害，甚至缺血、缺氧等，神經元將發生一系列的 病理改變，包括死亡，實驗研宄證實NGF通過：（1)抑制毒性氨基酸的釋放；（2)抑制鈣離子 超載；（3)抑制超氧自由基的釋放；（4)抑制細胞凋亡等機制而明顯減輕或防止這些繼發性 病理損害的發生來保護神經元細胞。NGF的第三個作用是促神經生長作用，實驗證明，在切 斷軸突后給予NGF將減少某些神經元的變性與死亡，無疑這將有助于提高軸突再生的可能 性。同時它還影響軸突再生開始的時間和參與再生的神經元數目以及再生神經的質量和速 度。這些信息提示我們NGF在脊髓損傷的神經保護和修復能有非常明顯的作用。除此之外， NGF在神經系統以外，也發揮一定效應。NGF可以影響免疫細胞的活性，進而調節免疫系統 功能。NGF還可以抑制某些腫瘤的有絲分裂，促其向良性分化。它甚至還能促進創口組織的 修復反應，促進創口愈合。如果能在脊髓損傷中亦有這些作用，可大大降低脊髓損傷后其他 并發癥的發生幾率，且能加快病人的術后恢復。


【發明內容】

[0009] 本發明的主要目的在于提供一種NGF的應用，NGF應用于制備治療和預防各種原 因造成的原發性脊髓損傷或繼發性脊髓損傷。
[0010] 本發明的另一個目的在于提供一種NGF的應用，NGF對各種原因造成的原發性脊 髓損傷或繼發性脊髓損傷有明顯的治療和預防作用。
[0011] 為實現以上目的，一種NGF的應用，我們分別通過動物實驗和體外細胞實驗來證 明NGF確實通過抑制內質網應激來減少脊髓神經元細胞的凋亡從而對各種原因造成的原 發性脊髓損傷或繼發性脊髓損傷有明顯的治療和預防作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1各組脊髓損傷后運動功能評分。
[0013] 圖2各組脊髓損傷HE染色。
[0014] 圖3各組脊髓損傷免疫組化圖。
[0015] 圖4各組脊髓損傷神經保護相關蛋白的表達。

【具體實施方式】
[0016] 以下描述用于揭露本發明以使本領域技術人員能夠實現本發明。以下描述中的優 選實施例只作為舉例，本領域技術人員可以想到其他顯而易見的變型。在以下描述中界定 的本發明的基本原理可以應用于其他實施方案、變形方案、改進方案、等同方案以及沒有背 離本發明的精神和范圍的其他技術方案。
[0017] 實施例INGF對實驗性擠壓致脊髓損傷大鼠的治療作用
[0018] 動物模型和分組：SD大鼠30只，體重220-250g，雌性。用以下方法制作脊髓損傷 大鼠模型：10%水合氯醛3.5ml/kg腹腔麻醉。俯臥固定大鼠四肢，作背部后正中切口。切 開皮膚以及皮下組織，顯露并咬除T9錐板和棘突。用15g動脈夾壓迫脊髓2min，麻醉清醒 后雙下肢呈現弛緩性癱瘓。術后7日給予注射用頭孢唑林50mg/kg腹腔注射每日2次，并 每日給予大鼠人工排泄大小便2次。將動物隨機分為3組（每組10只大鼠），假手術組： 只接受T9椎板切除手術，下肢行動正常；對照組：脊髓損傷后，不注射NGF溶液，只給予相 同劑量的生理鹽水；NGF治療組：在脊髓損傷30Min后注射用0. 9% NaCl稀釋的NGF20 μ g/ kg，之后保持20 μ g/kg/day的量，直到脊髓損傷有明顯恢復。
[0019] 檢測指標和結果：
[0020] BBB評分：根據BBB評分標準，分別于術后1，3, 7,14天進行評定，并遵循雙盲法觀 察原則，通過計分來評價動物雙后肢功能狀況。通過BBB評分，結果發現皮下注射NGF治療 組后肢恢復情況比對照組明顯好轉。各組損傷大鼠 BBB評分結果見表1及圖1。HE染色： 分別于術后7天和14天處死大鼠取材，石蠟包埋，切片（5 μ m)，通過蘇木精-伊紅染色，于 鏡下觀察發現給予NGF后，大鼠脊髓組神經細胞凋亡明顯少于對照組，見附圖2。免疫組化 學染色：分別于術后7天和14天處死大鼠取材，石蠟包埋，切片（5 μ m)，經DAB顯色，發現給 予NGF后，大鼠脊髓損傷處神經元和神經膠質細胞GRP78, CHOP和Caspase-12蛋白表達明 顯少于對照組，見附圖3。Western blot:于術后7天處死大鼠取材，用化學發光試劑盒曝 光、顯影、定影，發現與對照組相比，NGF治療組GRP78, CHOP和Caspase-12表達明顯減少， 見附圖4 ;而神經保護因子GAP-43表達明顯增加，見附圖4。
[0021] 表1各組脊髓損傷大鼠不同時間點BBB評分比較（X土s)
[0022]

【權利要求】
1. 一種NGF的應用，其特征在于，NGF在制備治療脊髓損傷藥物中的應用，包括各種因 素導致的脊髓原發性損傷和繼發性損傷的治療。
【文檔編號】A61K38/18GK104436166SQ201410589321
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年10月22日 優先權日:2014年10月22日
【發明者】張宏宇, 肖健, 鄔芬贊, 張超, 李校堃 申請人:溫州醫科大學