T細胞表位肽p46及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種結核分枝桿菌特異性CD8+T細胞表位肽及其應用。所述表位肽的氨基酸序列為TVINASRFK，該表位肽與HLA-A*1101分子親和力高，能活化CD8+T細胞、誘導其增殖和分泌IFN-γ。本發明表位肽的確定，為結核病疫苗、診斷試劑和治療藥物的研發提供了理論基礎和新的解決方案，對結核病的防治具有重大意義。
【專利說明】結核分枝桿菌特異性CD8+T細胞表位肽P46及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于免疫學【技術領域】，特別涉及結核分枝桿菌特異性CD8+T細胞表位肽及 其應用。
【背景技術】
[0002] 結核病是由結核分枝桿菌感染后誘發、全球感染率最高的傳染病，病死率僅次于 艾滋病。僅2012年，全球新發結核病患者達860萬，死亡130萬。結核病疫情的新特點在 于：耐藥結核病例出現并呈蔓延之勢；結核與艾滋病共感染情況愈演愈烈。針對這兩類患 者，目前并無有效的防治措施。中國是世界上結核病負擔最重的國家之一，研發適合中國人 群的結核病疫苗和治療藥物已時不我待。
[0003] 結核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis,MTB)是胞內寄生菌，對其有效控 制主要依賴于細胞免疫，尤其是T細胞免疫。人體內T細胞主要分為CD4+T(Th)細胞和 CD8+T(CTL)細胞兩大亞群，大量研究已經證明，這兩種T細胞亞群對于控制結核菌感染都具 有重要作用，其中⑶8+CTL更是清除結核菌的主力軍。
[0004]T細胞無法識別完整的結核菌和蛋白抗原，而是識別經過抗原遞呈細胞攝取和加 工后釋放出的結核表位肽。表位肽是抗原中引起免疫應答的核心部份，也稱為抗原決定簇， 它與抗原遞呈細胞表面的HLA分子結合形成肽-HLA復合物并被遞送和表達在抗原遞呈細 胞表面，進而活化T細胞，誘發T細胞免疫反應。CD4+T細胞識別HLAII類分子遞呈的表位 肽，而CD8+T細胞識別HLAI類分子遞呈的表位肽。T細胞對表位肽的識別及其活化要求表 位肽與抗原遞呈細胞表面HLA分子穩定結合，而肽與HLA分子的親和力是形成肽-HLA復合 物的關鍵，因此制備誘發T細胞免疫的治療藥物和疫苗，首要步驟是篩選出高親和力的肽， 進而鑒定出具有免疫活性的表位肽。
[0005] 表位肽可以完全通過人工合成獲得，研發周期短；由于剔除了表位肽以外病原體 其他有害成分，安全性良好；還可以將多個表位肽串聯使用，加強免疫效果和減少免疫逃 逸。目前已知的結核菌CTL表位肽主要是在歐美人群中鑒定，多為HLA-A*0201限制性， 而對于結核病流行最嚴重的非洲和東南亞人群，并沒有合適的表位肽可使用。在中國， HLA-A*1101是人群中基因頻率最高的HLA分子，鑒定HLA-A*1101限制性CTL表位對于研發 適合中國人群的表位肽疫苗具有非常重要的意義。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供結核分枝桿菌特異性CD8+T細胞表位肽。
[0007] 本發明的另一目的在于提供該結核分枝桿菌特異性CD8+T細胞表位肽在制備結核 病疫苗、診斷試劑和治療藥物中的應用。
[0008] 本發明所采取的技術方案是：
[0009] 本發明提供了與HLA-A*1101分子親和力高，能活化⑶8+T細胞、誘導其增殖和 分泌IFN-y的結核分枝桿菌特異性CD8+T細胞表位肽，所述表位肽的氨基酸序列為： TVINASRFK(SEQIDN0.46)WP:Thr-Val-Ile-Asn-Ala-Ser-Arg-Phe-Lys)。
[0010] 本發明結合生物信息學預測方法和紫外誘導肽置換實驗，利用結核分枝桿菌自 身的抗原篩選出具有抗結核活性的表位肽，高效準確地檢測出表位肽TVINASRFK(SEQID NO. 46)與HLA-A*1101分子之間的親和力。這是新的、未被報道過的HLA-A*1101限制性結 核分枝桿菌表位肽，被結核病人CD8+T細胞廣泛識別。由于HLA-A*1101基因型是中國人中 最廣泛攜帶的基因型，目前并未發現結核分枝桿菌特異的HLA-A*1101限制性CTL表位肽， 本發明表位肽的確定，為結核病疫苗、診斷試劑和治療藥物的研發提供了理論基礎和新的 解決方案，對結核病的防治具有重大意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011] 圖1為候選表位肽與HLA-A*1101分子親和力示意圖。
[0012] 圖2為22條高親和力的表位肽誘導結核患者T細胞活化并分泌IFN-Y的示意圖。
[0013] 圖3為ELISP0T檢測P46誘導結核患者T細胞分泌IFN-Y的示意圖。
[0014] 圖4為P46的質譜分析圖。
[0015] 圖5為CFSE標記的淋巴細胞增殖實驗檢測P46誘導結核患者⑶8+T細胞增殖的 結果示意圖。
【具體實施方式】
[0016] 本發明根據抗原的一級結構，采用免疫信息學手段，運用CBS數據庫中的 NetMHCcons表位預測軟件對結核分枝桿菌抗原蛋白的HLA-A*1101限制性CTL表位肽進行 了預測分析，然后采用紫外誘導肽置換實驗檢驗候選肽與HLA-A*1101分子結合的親和力 和穩定性，篩選獲得表位肽，通過體外實驗鑒定，CTL表位肽P46可誘導⑶8+T細胞產生強烈 的細胞免疫應答，分泌高水平IFN-Y，并誘導⑶8+T細胞發生顯著增殖。
[0017] 下面結合具體實施例進一步闡述本
【發明內容】
。
[0018] 應用生物信息學方法，預測HLA-A*1101限制性表位肽：
[0019] 根據文獻報道，選取94個有較強免疫原性的結核分枝桿菌抗原蛋白（如表1所 示），從GeneBank獲得各個抗原蛋白的氨基酸序列。
[0020] 表1候選結核分枝桿菌抗原蛋白
[0021]
【權利要求】
1. 結核分枝桿菌特異性CD8+T細胞表位肽，所述表位肽的氨基酸序列為：TVINASRFK (SEQ ID NO. 46)。
2. 權利要求1所述的結核分枝桿菌特異性CD8+T細胞表位肽P46在制備結核病診斷試 劑及治療結核病藥物中的應用。
3. 權利要求1所述的結核分枝桿菌特異性CD8+T細胞表位肽P46在制備結核病預防性 疫苗中的應用。
【文檔編號】A61K39/04GK104387448SQ201410596540
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月29日 優先權日:2014年10月29日
【發明者】馬驪, 劉蘇東, 羅微 申請人:南方醫科大學