本發明屬于生物制藥
技術領域：
，具體涉及一種雙抗原特異性T細胞及其產生方法及包含雙抗原特異性T細胞的靶向三陰性乳腺癌細胞的藥物制劑。
背景技術：
：T淋巴細胞是參與腫瘤細胞免疫治療的主要效應細胞，T細胞的激活依靠“雙信號”細致地調控。第一信號是T淋巴細胞表面的一種特異性受體TCR(Tcellrecepor)分子與腫瘤細胞表面主要組織相容性復合體(MHC)提呈的抗原肽的結合，即T細胞對抗原的識別；第二信號是協同刺激分子與T細胞表面的相應受體或配體相互作用介導的信號。CD28/B7是重要的正性共刺激分子，其主要作用是促進IL-2合成。如T細胞缺乏共刺激信號，會導致T細胞無能。三陰性乳腺癌(TripleNegativeBreastCancer，TNBC)是一種高度侵襲性的腫瘤，其細胞表面不表達雌激素受體(EstrogenReceptor，ER)，孕激素受體(ProgestroneReceptor，PR)和表皮生長因子受體(EpidermalGrowthFactorReceptor，EGFR)。由于缺乏有效的分子靶點，臨床上缺乏針對TNBC的有效治療手段，因此TNBC的總體生存率低于其它類型的乳腺癌患者，且更易發生淋巴結轉移。間皮素(Mesothelin，簡稱Meso)是一種分子量為40kDa的細胞表面糖蛋白，高表達于多種惡性實體腫瘤組織中，已有研究表明Meso在TNBC細胞表面有較高的表達水平，但同時Meso在正常胸膜、心包和腹膜的間皮細胞中也有少量表達。另外，最新研究顯示，在TNBC細胞表面還檢測到高表達的低氧誘導因子-1α(hypoxiainduciblefactor-1α，HIF-1α)。因此，如何能夠有效對TNBC進行識別與殺傷，并避免對正常細胞誤殺是需要克服的問題。技術實現要素：本發明實施例的目的在于克服現有技術的上述不足，提供一種雙抗原特異性T細胞及其制備方法，以解決當前不能有效對TNBC進行識別與殺傷，且容易造成對正常細胞誤殺的技術問題。本發明實施例的另一目的在于提供一種靶向三陰性乳腺癌細胞的藥物制劑，以解決現有生物治療三陰性乳腺癌存在療效不佳，以及對正常細胞造成損傷的技術問題。為了實現上述發明目的，作為本發明的一方面，提供了一種雙抗原特異性T細胞。所述雙抗原特異性T細胞包括間皮素抗原特異性T細胞受體基因和在HIF-1α抗體介導下特異性識別HIF-1α抗原的抗體Fc段特異性T細胞受體基因。相應地，本發明實施例提供了一種雙抗原特異性T細胞的制備方法。所述制備方法包括如下步驟：將T細胞被第一慢病毒和第二慢病毒同時感染；所述第一慢病毒含有間皮素抗原特異性T細胞受體基因，所述第二慢病毒含有所述HIF-1α抗原特異性T細胞受體基因。作為本發明的另一方面，提供了一種靶向三陰性乳腺癌細胞的藥物制劑。所述藥物制劑包括本發明雙抗原特異性T細胞或者由本發明制備方法制備的雙抗原特異性T細胞，還包括HIF-1α抗體。與現有技術相比，本發明雙抗原特異性T細胞由于含有間皮素抗原特異性T細胞受體基因和在HIF-1α抗體介導下特異性識別HIF-1α抗原的抗體Fc段特異性T細胞受體基因，因此，本發明雙抗原特異性T細胞具有兩個特異性結合域，可靶向Meso和HIF-1α抗體介導下特異性識別HIF-1α抗原的雙特異性，保證了本發明實施例雙抗原特異性T細胞對TNBC細胞的特異性識別與殺傷，同時避免了機體正常細胞的誤殺損傷。本發明雙抗原特異性T細胞制備方法通過含有間皮素抗原特異性T細胞受體基因的第一慢病毒和含有抗體Fc段特異性T細胞受體基因的第二慢病毒對T細胞感染，使得感染得到的轉基因T細胞具有靶向Meso和抗體Fc段的兩個特異性結合域，保證了本發明雙抗原特異性T細胞對TNBC細胞的特異性識別與殺傷，同時避免了機體正常細胞的誤殺損傷，而且本發明制備方法對T細胞感染率高。本發明靶向三陰性乳腺癌細胞的藥物制劑由于含有本發明雙抗原特異性T細胞和HIF-1α抗體，在HIF-1α抗體介導下，能夠同時識別到表達在同一TNBC細胞表面的Meso和HIF-1α抗原，從而激活本發明雙抗原特異性T細胞殺死腫瘤細胞，同時能夠有效避免對正常細胞的誤傷。另外，由于HIF-1α抗體能夠介導本發明雙抗原特異性T細胞對TNBC腫瘤細胞表面的HIF-1α抗原特異識別，因此，本發明藥物制劑可通過調節HIF-1α抗體濃度來控制活化所含的雙特異性TCR基因修飾T細胞的治療劑量，進一步提高了藥物制劑治療三陰性乳腺癌的安全性。附圖說明下面將結合附圖及實施例對本發明作進一步說明，附圖中：圖1為本發明實施例人工構建的Meso/scFv--CD8-CD3ζ基因結構圖；圖2為本發明實施例人工構建的CD16-CD28-TCRζ基因結構圖；圖3為本發明實施例入門克隆pENTRTM/D-TOPO-Meso/scFv-CD8-CD3ζ質粒酶切產物的電泳條帶圖；圖4為本發明實施例重組慢病毒表達質粒pLenti6.3/Meso/scFv-CD8-CD3ζ轉化菌落PCR產物的電泳條帶圖；圖5為本發明實施例入門克隆pENTRTM/D-TOPO-CD16-CD28-TCRζ質粒酶切產物的電泳條帶圖；圖6為本發明實施例重組慢病毒表達質粒pLenti6.3/CD16-CD28-TCRζ轉化菌落PCR產物的電泳條帶圖；圖7為本發明實施例T細胞體外殺傷三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞的流式檢測圖；其中，WT-T細胞：陰性對照組T細胞；M/HBi-TCR-T細胞：單純M/HBi-TCR-T細胞；Hif1α-M/HBi-TCR-T細胞：1ug/mlHif1α抗體共孵育的M/HBi-TCR-T細胞；圖8為本發明實施例荷瘤裸鼠腋下移植瘤的生長圖片；其中，圖(1)為陰性對照組；圖(2)為單純化療組；圖(3)為單純M/HBi-TCR-T細胞治療組；圖(4)為M/HBi-TCR-T細胞聯合Hif1α抗體治療組；圖9為本發明實施例M/HBi-TCR-T細胞殺傷示意圖。具體實施方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。由于三陰性乳腺癌(TripleNegativeBreastCancer，TNBC)細胞表面含有有較高表達水平的間皮素(Mesothelin，簡稱Meso)和低氧誘導因子-1α(hypoxiainduciblefactor-1α，HIF-1α)。因此，本發明實施例基于TNBC細胞該特性，構建了一種能夠同時靶向Meso和HIF-1α抗原的雙抗原特異性T細胞及其制備方法和含有本發明實施例雙抗原特異性T細胞的靶向三陰性乳腺癌細胞的藥物制劑。一方面，本發明實施例雙抗原特異性T細胞包括間皮素抗原特異性T細胞受體基因和在HIF-1α抗體介導下特異性識別HIF-1α抗原的抗體Fc段特異性T細胞受體基因。因此，本發明實施例雙抗原特異性T細胞可以表示為Meso/HIF-1αBispecificTCR-T(簡寫為M/HBi-TCR-T)。由于本發明實施例雙抗原特異性T細胞由于含有間皮素抗原特異性T細胞受體基因和抗體Fc段特異性T細胞受體基因，這樣，M/HBi-TCR-T細胞具有兩個特異性結合域，其中第一結合域可靶向Meso抗原，激發T細胞活化的第一信號，第二結合域則靶向腫瘤特異性抗體的Fc片段，在HIF-1α抗體介導下靶向腫瘤HIF-1α抗原，激發T細胞活化的第二信號，單獨識別其中一種腫瘤抗原并不足以激活T細胞，只有識別到表達在同一腫瘤細胞表面的Meso和HIF-1α抗原后才能產生足夠強大的信號激活T細胞殺死腫瘤細胞，同時避免了機體正常細胞的誤殺損傷。其中，在一實施例中，所述間皮素抗原特異性T細胞受體基因設于Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段中。在具體實施例中，所述間皮素抗原特異性T細胞受體基因是由含有Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段的病毒感染至雙抗原特異性T細胞中，其中，Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段可由下文Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段構建方法獲得。在另一實施例中，所述抗體Fc段特異性T細胞受體基因設于CD16–CD28-TCRζ基因片段中。在具體實施例中，所述抗體Fc段特異性T細胞受體基因是由含有CD16–CD28-TCRζ基因片段的病毒感染至雙抗原特異性T細胞中。其中，CD16–CD28-TCRζ基因片段可由下文CD16–CD28-TCRζ基因片段構建方法獲得。由于抗體Fc段特異性T細胞受體基因含有CD16基因，因此，使得本發明實施例雙抗原特異性T細胞能夠靶向腫瘤特異性抗體的Fc片段。由上文所述可知，本發明實施例雙抗原特異性T細胞具有可靶向Meso和HIF-1α抗原的兩個特異性結合域，保證了本發明實施例雙抗原特異性T細胞對TNBC細胞的特異性識別與殺傷，同時避免了機體正常細胞的誤殺損傷。另一方面，在上文所述的本發明實施例雙抗原特異性T細胞的基礎上，本發明實施例還提供了本發明實施例雙抗原特異性T細胞一種制備方法。本發明實施例制備方法包括以下步驟：將T細胞被第一慢病毒和第二慢病毒同時感染。其中，所述第一慢病毒含有上文所述的間皮素抗原特異性T細胞受體基因。在一實施例中，所述第一慢病毒按照如下方法制備獲得：S11：將Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段與入門載體混合，以使所述Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段嵌入所述入門載體，而獲得帶有Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段的入門載體；S12：將所述帶有Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段的入門載體與慢病毒質粒混合重組，以建立間皮素抗原特異性T細胞受體表達質粒；S13：將所述間皮素抗原特異性T細胞受體表達質粒與病毒包裝質粒、共轉染293T細胞，獲得第一慢病毒。步驟S11中，Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段獲得方法包括如下步驟：S111：獲取Meso抗原免疫總cDNA；S112：將所述Meso抗原免疫總cDNA與Meso抗體重鏈可變區VH引物和輕鏈可變區VL引物進行PCR，獲得MesoVH和MesoVL基因片段；S113：將所述MesoVH與MesoVL基因片段采用連接肽連接，獲得Meso抗體scFv基因片段；S114：將所述Meso抗體scFv基因片段與pcDNA載體連接，獲得pcDNA-Meso/scFv質粒；S115：將人CD8分子基因片段和CD3ζ鏈胞內段克隆進所述pcDNA-Meso/scFv質粒，獲得pcDNA3-Meso/scFv-CD8-CD3ζ質粒，酶切后獲得Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段。其中，步驟S112中的Meso抗體重鏈可變區VH引物和輕鏈可變區VL引物可以根據重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL序列按照引物設計原則進行設計，在具體實施例中，重鏈可變區VH的引物為SEQIDNO1和SEQIDNO2，輕鏈可變區VL的引物為SEQIDNO3和SEQIDNO4：SEQIDNO：1：5'-AGGT(G/C)(A/C)A(A/G)CTGCAG(G/C)AGTC(A/T)GG-3'SEQIDNO：2：5'-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCC-3'SEQIDNO：3：5'-GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA-3'SEQIDNO：4：5'-CCCTTTGATTTCCAGCTTGGTGCC-3'。步驟S113中的連接肽可以是采用的連接肽，針對該重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL序列特性，在本實施例中，選用連接肽(Gly4Ser)3，其堿基序列如下SEQIDNO：5：5'-GGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCT-3'步驟S114中的pcDNA載體可以是pcDNA載體系列中常用的載體，在具體實施例中，pcDNA載體為pcDNA3。步驟S115中的人CD8分子基因片段為471-737bpcDNA序列。CD3ζ鏈胞內段為228-563bpcDNA序列，且CD8分子基因片段和CD3ζ鏈胞內段可以直接在Pubmed基因庫進行檢索獲得。另外，在步驟S11中，作為具體實施例，入門載體可以但不僅僅為pENTR/D-TOPO。上述步驟S12中，慢病毒質粒可以是常用的慢病毒載體，如但不僅僅選用pLenti6.3/V5-DEST。上述步驟S13中，病毒包裝質粒可以是常用的病毒包裝質粒，如但不僅僅選用ViraPowerTM包裝質粒。上文雙抗原特異性T細胞制備方法中的所述第二慢病毒含有上文所述的抗體Fc段特異性T細胞受體基因，具體是在HIF-1α抗體介導下特異性識別HIF-1α抗原的抗體Fc段特異性T細胞受體基因。在一實施例中，所述第二慢病毒按照如下方法制備獲得：S21：將CD16–CD28-TCRζ基因片段與入門載體混合，以使所述CD16–CD28-TCRζ基因片段嵌入所述入門載體，而獲得帶有CD16–CD28-TCRζ基因片段的入門載體；以及S22：將所述帶有CD16–CD28-TCRζ基因片段的入門載體與慢病毒質粒混合重組，以建立CD16–CD28-TCRζ慢病毒表達質粒；S23：將所述CD16–CD28-TCRζ慢病毒表達質粒與病毒包裝質粒、共轉染293T細胞，獲得第二慢病毒。步驟S21中，CD16–CD28-TCRζ基因片段獲得方法包括如下步驟：S211：將人CD16分子基因片段與pcDNA載體連接，獲得pcDNA-CD16質粒；S212：將CD28分子胞內結構域克隆進所述pcDNA-CD16質粒，獲得pcDNA-CD16-CD28質粒；S213：將CD28核苷酸336-660bp區域和TCRζ胞內結構域PCR合并成基因片段后克隆進所述pcDNA-CD16-CD28質粒，酶切后獲得CD16-CD28-TCRζ基因片段。步驟S211中的人CD16分子基因片段可以為843bpcDNA序列。CD3ζ鏈胞內段為228-563bpcDNA序列，且人CD16分子基因可以直接在Pubmed基因庫進行檢索獲得。另外，步驟S211中的pcDNA載體可以是pcDNA載體系列中常用的載體，在具體實施例中，pcDNA載體為pcDNA3。另外，在步驟S21中，作為具體實施例，入門載體可以但不僅僅為pENTR/D-TOPO。上述步驟S22中，慢病毒質粒可以是常用的慢病毒載體，如但不僅僅選用pLenti6.3/V5-DEST。上述步驟S23中，病毒包裝質粒可以是常用的病毒包裝質粒，如但不僅僅選用ViraPowerTM包裝質粒。另外，上述雙抗原特異性T細胞制備方法中的第一慢病毒和第二慢病毒同時感染T細胞可以按照正常的慢病毒感染方法進行感染。因此，本發明實施例雙抗原特異性T細胞制備方法通過含有間皮素抗原特異性T細胞受體基因的第一慢病毒和含有抗體Fc段特異性T細胞受體基因的第二慢病毒對T細胞感染，使得感染得到的轉基因T細胞具有靶向Meso和HIF-1α抗體介導下特異性識別HIF-1α抗原的兩個特異性結合域，保證了本發明實施例雙抗原特異性T細胞對TNBC細胞的特異性識別與殺傷，同時避免了機體正常細胞的誤殺損傷，而且本發明制備方法對T細胞感染率高。又一方面，基于上文本發明實施例雙抗原特異性T細胞及其制備方法，本發明實施例還提供了一種靶向三陰性乳腺癌細胞的藥物制劑。所述藥物制劑包括雙抗原特異性T細胞和HIF-1α抗體，其中，所述雙抗原特異性T細胞為上文所述的本發明實施例雙抗原特異性T細胞或由上文本發明制備方法制備的雙抗原特異性T細胞。這樣，該藥物制劑由于含有本發明雙抗原特異性T細胞和HIF-1α抗體，由于如上文所述的，本發明實施例雙抗原特異性T細胞具有可靶向Meso和HIF-1α抗原的兩個雙特異性結合域，因此，在HIF-1α抗體介導下，能夠同時識別到表達在同一TNBC細胞表面的Meso和HIF-1α抗原，從而激活本發明雙抗原特異性T細胞殺死腫瘤細胞，同時能夠有效避免對正常細胞的誤傷。另外，在本發明實施例靶向三陰性乳腺癌細胞的藥物制劑中，由于HIF-1α抗體能夠介導本發明實施例雙抗原特異性T細胞對TNBC腫瘤細胞表面的HIF-1α抗原特異識別，因此，本發明實施例藥物制劑可通過調節HIF-1α抗體濃度來控制活化所含的雙特異性TCR基因修飾T細胞的治療劑量，進一步提高了藥物制劑治療三陰性乳腺癌的安全性，如當停止抗體給藥可以終止本發明實施例雙抗原特異性T細胞的功能，不必清除本發明實施例雙抗原特異性T細胞，確保了治療的有效性和減少毒副作用。如在一實施例中，所述雙抗原特異性T細胞與HIF-1α抗體含量比為(104-106個細胞)：(0.5-5μg)，優選的為105個細胞：1μg。具體地，本發明實施例靶向三陰性乳腺癌細胞的藥物制劑中雙抗原特異性T細胞與HIF-1α抗體殺傷TNBC腫瘤的原理如附圖9所示。其中，附圖9(A)中，M/HBi-TCR-T細胞識別正常細胞表面Meso抗原/MHCI復合物，由于正常細胞表面沒有HIF-1α抗原，因此，無法激活第二信號，對正常細胞不殺傷；圖9(B)中，M/HBi-TCR-T細胞在Hif1α抗體介導下識別正常細胞表面Hif1α抗原，由于正常細胞表面沒有間皮素，因此，無法激活第一信號，對正常細胞不殺傷；圖9(C)中，M/HBi-TCR-T細胞識別三陰性乳腺癌細胞表面的Meso抗原/MHCI復合物，但由于Hif1α抗體缺失，不能識別三陰性乳腺癌細胞表面的Hif1α抗原，對三陰性乳腺癌細胞不殺傷；圖9(D)中，M/HBi-TCR-T細胞識別三陰性乳腺癌細胞表面的Meso抗原/MHCI復合物，在Hif1α抗體介導下通過CD16分子識別三陰性乳腺癌細胞表面的Hif1α抗原，從而激活并殺傷三陰性乳腺癌細胞。其次，上述藥物制劑包括的雙抗原特異性T細胞和HIF-1α抗體的含量或者給藥劑量應該是有效劑量的，具體地，該有效劑量是指治療有效量，是指足以對個體顯示益處或臨床意義的本發明的化合物的量。本領域技術人員將會理解，給藥的實際量或劑量以及給藥時程將取決于被治療的疾病的性質和嚴重性、被治療的受試者的年齡和一般狀況以及給藥方式等。理所當然的是，在上述藥用制劑中還可以包含藥學上可接受的載體。在具體實施例中，該藥學上可接受的載體是指本領域技術人員已知的適合于特定的給藥模式的任何輔料。下面通過具體實施例對本發明做進一步詳細說明。實驗步驟1.表達Meso抗原特異性scFv-CD8-CD3ζ融合受體的慢病毒1.1獲取Meso抗原免疫小鼠總cDNA利用Meso抗原對BALB/C小鼠進行免疫，效價符合要求(1:100000以上)時，處死小鼠，取脾臟，用Trizol法提取小鼠脾臟總RNA。采用iScriptcDNASynthesisKit合成總cDNA，反應體系如下表1：表1試劑體積5×iScriptreactionmix4μliScriptreversetranscriptase1μlNuclease-freewater5μl總RNA10μl總體積20μl反應條件：25℃5min→42℃30min→85℃5min→4℃hold。1.2Meso抗體重鏈可變區VH及輕鏈可變區VL基因的獲取Meso抗體重鏈可變區VH及輕鏈可變區VL引物序列如下表2所示：表2引物名稱引物序列SEQIDNOVH-F5'-AGGT(G/C)(A/C)A(A/G)CTGCAG(G/C)AGTC(A/T)GG-3'1VH-R5'-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCC-3'2VL-F5'-GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA-3'3VL-R5'-CCCTTTGATTTCCAGCTTGGTGCC-3'4Meso抗體重鏈可變區VH及輕鏈可變區VL的PCR反應體系如下表3：表3試劑體積TaqDNA聚合酶0.25μl10×PCRBuffer5μldNTPs(2.5mM)4μlMeso抗原免疫小鼠總cDNA1μlVH-F(20μM)1μlVH-R(20μM)1μlddH2O補充至50μl該PCR反應條件如下：94℃預變性5min，94℃45s，60℃1min，72℃1min，共35個循環，72℃延伸5min。1.2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，回收Meso抗體重鏈可變區VH及輕鏈可變區VL基因PCR產物。1.3Meso抗體scFv片段及質粒的獲取通過多基因片段重疊延伸PCR(OverlapExtensionPCR，OE-PCR)將1.2中得到的MesoVH和MesoVL片段用連接肽(Gly4Ser)3(堿基序列：5'-GGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCT-3')(SEQIDNO：5)連接起來，得到Meso抗體scFv片段，并引入酶切位點HinIII/BamHI。OE-PCR反應條件如下：(1)步驟1：95℃預變性1min，94℃1min，60℃1min，72℃1min，共7個循環，72℃延伸10min；(2)步驟2：95℃預變性5min，94℃45s，62℃1min，72℃1min，共35個循環，72℃延伸5min。1.2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，回收Meso抗體scFv片段，利用T4DNA連接酶將Meso抗體scFv片段與pcDNA3載體連接，獲得pcDNA3-Meso/scFv質粒。1.4Meso抗原特異性scFv-CD8-CD3ζ基因片段的構建在Pubmed基因庫進行檢索，獲取人CD8分子片段(471-737bp)和CD3ζ鏈胞內段(228-563bp)cDNA序列，設計引物，同時添加限制性酶切位點。引物序列如下表4所示：表4以人T細胞總cDNA為模板，分別合成人CD8分子片段和CD3ζ鏈胞內段，1.2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，分別回收基因片段。利用引物CD8-F、CD3ζ-R合成上述兩段PCR產物，BamHI/XhoI酶切后克隆進pcDNA3-Meso/scFv質粒，獲得pcDNA3-Meso/scFv-CD8-CD3ζ質粒，HinIII/XhoI酶切后獲得Meso/scFv--CD8-CD3ζ基因片段，基因結構圖見圖1所示。1.5Meso/scFv-CD8-CD3ζ入門克隆的構建1.5.1Meso/scFv-CD8-CD3ζ入門克隆TOPO連接反應體系如下表5所示：TOPO克隆反應條件：將上述反應體系輕輕搖勻后，在室溫(21-23℃)下孵育5min。孵育結束后將反應體系置于冰上以進一步轉化感受態細胞，進行擴大培養并提取pENTRTM/D-TOPO-Meso/scFv-CD8-CD3ζ質粒。表5Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段0.5μl鹽溶液1μlddH2O3.5μlpENTRTM/D-TOPOvector1μl總體積6μl1.5.2入門克隆pENTRTM/D-TOPO-Meso/scFv-CD8-CD3ζ的酶切鑒定1.5.2.1酶切體系(NotI/AscI雙酶切體系)如表6所示：表6提純的入門克隆pENTRTM/D-TOPO-Meso/scFv-CD8-CD3ζ3.0μlNotI0.5μlAscI0.5μl100×BSA0.2μl10×Buffer2.0μlddH2O15μl總體積21.2μl1.5.2.2酶切條件：37℃水浴鍋中酶解2h；1.5.2.3取2μl酶解產物，用1.2％瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。分析電泳條帶以判斷入門克隆是否正確。若入門克隆pENTRTM/D-TOPO-Meso/scFv-CD8-CD3ζ正確，NotI/AscI雙酶切得到兩條分別為1.6kb和2.5kb的片段。1.6pLenti6.3/Meso/scFv-CD8-CD3ζ慢病毒表達質粒的構建1.6.1LR反應LR反應是入門克隆pENTRTM/D-TOPO-Meso/scFv-CD8-CD3ζ和目的載體pLenti6.3/V5-DESTvector發生的重組反應，重組之后得到慢病毒表達質粒pLenti6.3/V5/Meso/scFv--CD8-CD3ζ。LR反應體系如下表7所示：冰上解凍LRClonaseTMIIPlusEnzymeMix，吸取2μl加至上述LR反應體系中，輕柔混勻后，25℃放置1h。加入1μl蛋白酶K至上述反應體系，37℃孵育10min。表71.6.2LR反應產物的轉化步驟1.6.2.1在冰上將一管E.coli感受態細胞(Invitrogen,Cat.No.C7373-03)解凍；1.6.2.2加入2-3μlLR反應產物至感受態細胞懸液中，輕柔混勻(切勿用移液槍吹打)。冰上孵育30min，42℃水浴中熱擊處理30s，將反應管轉移至冰上繼續孵育2min；1.6.2.3加入225μl室溫下預溫的S.O.C.培養基；1.6.2.4將反應管蓋緊后置于37℃水平搖床中225rpm轉速下孵育1h；1.6.2.5取出100μl轉化產物均勻涂布到預熱的LB平板(含氨芐青霉素)上，37℃培養箱中孵育過夜。1.6.3陽性克隆的篩選與擴增的步驟1.6.3.1用槍頭分別少量蘸取3個克隆后，將槍頭置于10μl無菌水中，反復吹打；1.6.3.2吸取1μl菌液用于PCR，其反應體系如下表8：表8菌液1μlTCR正向引物(20μM)1μlV5反向引物(20μM)1μlBio-radsupermix6.25μlddH2O15.75μl總體積25μlPCR反應條件如下：1.6.3.3三個克隆的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳反應，若在1.6kb處得到清晰的單一條帶，則將鑒定出的陽性克隆挑到含氨芐青霉素的LB培養液中進行擴大培養；1.6.3.4用質粒DNA純化試劑盒(Promega，Cat.No.A7500)從上述過夜培養的菌液中分離純化質粒DNA即為慢病毒表達質粒pLenti6.3/Meso/scFv--CD8-CD3ζ，同時保存菌種；1.7pLenti6.3/Meso/scFv-CD8-CD3ζ慢病毒的制備1.7.1Day1：取5×106個293FT細胞(Invitrogen,Cat.No.R700-07)，離心后棄上清，用10ml37℃預熱的完全培養基(D-MEM+10％FBS+2mML-谷氨酰胺+0.1mM非必須氨基酸+1mM丙酮酸鈉+1％P/S)重懸，接種于10cm培養皿中，37℃，5％CO2培養箱中孵育過夜；1.7.2Day2：棄去培養皿中的培養液，加入5ml含10％FBS的I培養液(Invitrogen,Cat.No.31985-062)；1.7.32000復合物的制備：1.7.3.1將1.5ml無血清的I培養液加入5ml離心管中，加入9μgViraPowerTM包裝質粒混合物和3μg慢病毒表達質粒pLenti6.3/TO/V5/Meso/scFv--CD8-CD3ζ，輕柔混合；1.7.3.2將1.5ml無血清的I培養液加入另一個5ml離心管中，加入36μl2000，輕柔混合后在室溫下孵育5min；1.7.3.3將1.7.3.1和1.7.3.2兩步得到的溶液轉移到一個離心管中，輕柔混合均勻；1.7.3.4室溫下孵育20min，得到2000復合物。1.7.4將得到的2000復合物逐滴緩慢加入到培養皿中，并輕輕地來回晃動培養皿。37℃，5％CO2培養箱中孵育過夜；1.7.5Day3：取出培養皿，棄去培養液，加入10mlDMEM完全培養基。37℃，5％CO2培養箱中孵育48-72h；1.7.6Day5或Day6：將培養皿中的培養液轉移到15ml離心管中，在4℃條件下2000g離心15min；1.7.7吸取上清液，收集pLenti6.3/Meso/scFv--CD8-CD3ζ慢病毒，分裝入1ml凍存管中，置于-80℃長期保存。2.表達CD16-CD28–TCRζ融合受體的慢病毒2.1CD16–CD28-TCRζ基因片段的構建在GenBank數據庫中檢索人CD16(FcfragmentofIgGlowaffinityIIIareceptor，序列，設計如表9所示的引物，以人PBMC細胞總cDNA為模板，PCR獲取CD16分子基因片段(843bp)。1.2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，回收CD16分子基因片段，利用T4DNA連接酶將CD16分子基因片段與pcDNA3載體連接，獲得pcDNA3-CD16質粒。表9引物名稱引物序列SEQIDNOCD16-F5'-AGAGAATTCICTTTGGTGACTTGTCCACTC-3'(EcoRI)10CD16-R5'-AGAACATGCGCTCTTATTACTCCCATGGGA-3'(NspI)11以人T細胞總cDNA為模板，以如下表10中的引物A和引物B合成CD28分子胞內結構域，NspI/XhoI酶切后克隆進pcDNA3-CD16質粒，獲得pcDNA3-CD16-CD28(IC)質粒。以人T細胞總cDNA為模板，以如下表10中的引物C、引物D合成CD28核苷酸336–660區域，以如下表10中的引物E、引物F合成TCRζ胞內結構域。利用如下表10中的引物C、F合成上述兩段PCR合成片段，XhoI/BamHI酶切后克隆進pcDNA3-CD16-CD28(IC)質粒，獲得pcDNA3-CD16-CD28-TCRζ質粒。CD16–CD28-TCRζ融合受體質粒構建所用到的引物序列如下表10所示：表10將上述獲得的pcDNA3-CD16-CD28-TCRζ質粒進行EcoRI//BamHI酶切后獲得CD16-CD28-TCRζ基因片段，基因結構圖見圖2所示。2.2CD16-CD28-TCRζ入門克隆的構建2.2.1CD16-CD28-TCRζ入門克隆TOPO連接反應體系如表11下：表11CD16-CD28-TCRζ基因片段0.5μl鹽溶液1μlddH2O3.5μlpENTRTM/D-TOPOvector1μl總體積6μlTOPO克隆反應條件：將上述反應體系輕輕搖勻后，在室溫(21-23℃)下孵育5min。孵育結束后將反應體系置于冰上以進一步轉化感受態細胞，進行擴大培養并提取pENTRTM/D-TOPO-CD16-CD28-TCRζ質粒；2.2.2入門克隆pENTRTM/D-TOPO-CD16-CD28-TCRζ的酶切鑒定2.2.2.1酶切體系(NotI/AscI雙酶切體系)如表12所示：表12提純的入門克隆pENTRTM/D-TOPO-CD16-CD28-TCRζ3.0μlNotI0.5μlAscI0.5μl100×BSA0.2μl10×Buffer2.0μlddH2O15μl總體積21.2μl2.2.2.2酶切條件：37℃水浴鍋中酶解2h；2.2.2.3取2μl酶解產物，用1.2％瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。分析電泳條帶以判斷入門克隆是否正確。若入門克隆pENTRTM/D-TOPOMeso/-CD16-CD28-TCRζ正確，NotI/AscI雙酶切得到兩條分別為1.4kb和2.5kb的片段。2.3pLenti6.3/CD16-CD28-TCRζ慢病毒表達質粒的構建具體實驗步驟參考步驟1.6，轉化后的細菌進行PCR，產物進行瓊脂糖凝膠電泳反應，若在1.4kb處得到清晰的單一條帶，則將鑒定出的陽性克隆挑到含氨芐青霉素的LB培養液中進行擴大培養。用質粒DNA純化試劑盒(Promega，Cat.No.A7500)從上述過夜培養的菌液中分離純化質粒DNA即為慢病毒表達質粒pLenti6.3/CD16-CD28-TCRζ，同時保存菌種。2.3pLenti6.3/CD16-CD28-TCRζ慢病毒的制備：具體實驗步驟參考步驟1.7。3.Meso/HIF-1α雙特異性TCR-T(M/HBi-TCR-T)細胞的制備及擴增3.1分離基因分型HLA-A2+健康志愿者PBMC細胞3.1.1抽取HLA-A2+的健康志愿者外周血25ml，肝素抗凝，室溫離心(700g，20min)；吸取上層血漿，置于水浴鍋中56℃，30min；然后4℃靜置15min后，離心(900g，30min)，取自體血漿4℃保存備用；3.1.2取上述700g，20min離心后下部細胞成分，加D-PBS至50ml，混勻，緩慢加到裝有20ml人淋巴細胞分離液的50ml離心管中，室溫離心(800g，15min)；3.1.3吸取白膜層細胞，加入到裝有5mlRPMI1640的50ml離心管中；3.1.4RPMI1640洗滌兩次(600g，10min離心)，收集細胞即為PBMC細胞；3.2M/HBi-TCR-T細胞的制備3.2.1用含50ng/mlCD3單抗、1000U/mlIL-2和0.5％自體血漿的Alys-505培養液調整PBMC細胞密度為1×106/ml，轉入六孔板中，2ml/孔，同時每孔添加1000U/ml的IFN-γ，置于飽和濕度、37℃、5.0％CO2培養箱中培養；3.2.2每3天調整細胞密度為1×106/ml，添加含1000U/mlIL-2和0.5％自體血漿的Alys-505培養液；3.2.3第7天，將T細胞分成兩組，一組用于轉染Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因和CD16-CD28-TCRζ基因(M/HBi-TCR-T組)，另一組按正常T淋巴細胞培養步驟進行培養(WT-T組)，兩組細胞均按105/孔的密度轉移至24孔板中，100μl/孔；3.2.4各解凍一管pLenti6.3/Meso/scFv-CD8-CD3ζ慢病毒和pLenti6.3/CD16-CD28-TCRζ慢病毒溶液，各吸取20μl慢病毒溶液加至60μlAlys-505完全培養基中，用移液管將稀釋后的慢病毒溶液加至M/HBi-TCR-T組的24孔板中，輕輕吹打混勻。WT-T組加入100μlAlys-505完全培養基；3.2.5兩組分別加入終濃度為6μg/ml的Polybrene，來回輕輕晃動混合均勻后，置于37℃，5％CO2培養箱中孵育24h；3.2.6第8天，兩組細胞分別取出離心，棄掉含慢病毒的上清液，分別用200μlAlys-505培養液重懸，加入24孔板中。根據細胞生長狀態進行補液；3.2.7第14天，收獲成熟的M/HBi-TCR-T組細胞和對照組WT-T細胞用于后續分析。4.M/HBi-TCR-T細胞體外抗腫瘤活性檢測4.1以M/HBi-TCR-T細胞、1ug/mlHif1α抗體共孵育的M/HBi-TCR-T細胞(Hif1α-M/HBi-TCR-T細胞)、WT-T細胞作為效應細胞，其中T細胞密度均為105/ml，CFSE標記的三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞作為靶細胞，按照20:1的效靶比混合效應細胞和靶細胞，輕輕混勻，置于5％CO2，37℃培養箱中孵育；4.224h后，加入1μg/mlPI染液，混勻，室溫避光孵育15min后，利用流式細胞儀檢測CFSE+PI+細胞(死亡的MDA-MB-231細胞)的百分率。5.M/HBi-TCR-T細胞動物體內抗腫瘤活性檢測取對數生長期的人三陰性乳腺癌細胞系MDA-MB-231細胞，胰酶消化后制成單細胞懸液，將含1×107個癌細胞的懸液0.1ml于裸鼠腋下注射。實驗分組及治療情況見表13所示，每日觀察各組荷瘤裸鼠的飲食、活動等方面的變化，隔日測量裸鼠體重，觀察體重變化情況；隔2天測量腫瘤的最大縱徑(a)及最大橫徑(b)，觀察腫瘤生長的情況，按照公式計算：瘤體積＝1/2×a×b2。第(4)組治療結束后第13天計算各組裸鼠的抑瘤率，抑瘤率＝(1-治療組腫瘤平均體積/陰性對照組腫瘤平均體積)×100％。表13實驗分組及治療情況*FAC化療方案：氟尿嘧啶500mg/M2；阿霉素50mg/M2；環磷酰胺500mg/M2，第一天給藥，21天一個療程。6.實驗結果6.1入門克隆pENTRTM/D-TOPO-Meso/scFv-CD8-CD3ζ的酶切鑒定入門克隆pENTRTM/D-TOPO-Meso/scFv-CD8-CD3ζ質粒經過NotI/AscI雙酶切后得到的產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別在大約1.6kb和2.5kb處有清晰條帶如圖3，與預期片段數和片段大小一致。證明Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因正確插入到載體中。6.3重組慢病毒表達質粒pLenti6.3/Meso/scFv-CD8-CD3ζ轉化菌落PCR產物的電泳結果隨機挑取LB平板上的三個克隆，用設計的TCR正向引物和V5反向引物進行PCR擴增，PCR產物經過瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，在1.6kb處出現清晰的條帶，如圖4所示，說明Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因成功插入到pLenti6.3/TO/V5-DEST表達載體中。6.4入門克隆pENTRTM/D-TOPO-CD16-CD28-TCRζ的酶切鑒定入門克隆pENTRTM/D-TOPO-CD16-CD28-TCRζ質粒經過NotI/AscI雙酶切后得到的產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別在大約1.4kb和2.5kb處有清晰條帶，如圖5所示，與預期片段數和片段大小一致。證明CD16-CD28-TCRζ基因正確插入到載體中。6.5重組慢病毒表達質粒pLenti6.3/CD16-CD28-TCRζ轉化菌落PCR產物的電泳結果隨機挑取LB平板上的三個克隆，用設計的TCR正向引物和V5反向引物進行PCR擴增，PCR產物經過瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，在1.4kb處出現清晰的條帶，如圖6所示，說明CD16-CD28-TCRζ基因成功插入到pLenti6.3/TO/V5-DEST表達載體中。6.6T細胞體外殺傷三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞的流式檢測結果M/HBi-TCR-T細胞、Hif1α-M/HBi-TCR-T細胞和WT-T細胞作為效應細胞，CFSE標記的三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞作為靶細胞，流式細胞術檢測T細胞對MDA-MB-231細胞的殺傷效率，實驗結果如圖7所示。由圖7可知，WT-T細胞對MDA-MB-231細胞的殺傷率約為22.15％，單純M/HBi-TCR-T細胞對MDA-MB-231細胞的殺傷率約為25.71％，而Hif1α-M/HBi-TCR-T細胞對MDA-MB-231細胞的殺傷率高達70.83％，遠遠高于對照組WT-T細胞和單純M/HBi-TCR-T細胞的殺傷率。體外實驗結果說明本發明實施例提供的M/HBi-TCR-T細胞可在Hif1α抗體的控制下實現對三陰性乳腺癌細胞的高特異性、高效的殺傷作用。6.7M/HBi-TCR-T細胞體內抑制三陰性乳腺癌的實驗結果治療結束時120只動物全部存活。觀察發現，陰性對照組裸鼠活動減少，反應遲鈍，體重隨著腫瘤的生長略有下降；單純化療組動物用藥后雖腫瘤生長得到較好控制但消瘦嚴重，進食和活動明顯減少；單純M/HBi-TCR-T細胞治療組腫瘤控制不及單純化療組理想，但裸鼠生活狀態良好，體重未見明顯下降；M/HBi-TCR-T細胞聯合Hif1α抗體治療組裸鼠覓食、飲水、活動等狀況良好，體重也未見明顯下降，且腫瘤生長得到較好控制，抑瘤率達到67.2％。體重情況和腫瘤抑制率統計結果見表14。表14各組裸鼠體重、腫瘤體積及抑瘤率的比較治療結束后第13天，各組裸鼠腋下移植瘤的生長情況見圖8，荷瘤裸鼠體內實驗結果說明：本發明實施例提供的M/HBi-TCR-T細胞與Hif1α抗體聯用可降低毒副作用，同時有效抑制腫瘤的生長。以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包括在本發明的保護范圍之內。當前第1頁1 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