一種成人T細胞白血病的特異性靶向多肽及其應用的制作方法

本發明涉及一種成人t細胞白血病的特異性靶向多肽及其應用，屬于生物醫藥技術領域。

背景技術：

成人t細胞白血病（atl，adultt-cellleukemia）是一種惡性的淋巴系統增殖性疾病。

近三十年的研究表明，atl與人類t淋巴細胞白血病1型病毒（htlv-1，humant-cellleukemiavirustype1）的感染密切相關，具體來說，htlv-1編碼的病毒蛋白在促進病毒感染復制，進而誘發成人t細胞白血病的過程中扮演極為重要的作用。

由于迄今為止，尚無有效的預防及治療atl的手段，科學家們開始探索直接以htlv-1病毒蛋白作為靶點的新型治療方法。

htlv-1病毒基因組，除了正向編碼結構基因gag、pol、env，以及調控蛋白tax、rex、p12、p13和p30以外，htlv-1的反義鏈編碼hbz蛋白。hbz蛋白包含3個功能結構域：n末端激活結構域（addomain），c末端堿性亮氨酸拉鏈結構域（bzipdomain），以及位于中間的中央結構域（cddomain）。

研究證明，hbz的致癌功能通過其c末端堿性亮氨酸拉鏈結構域參與調節多條細胞信號傳導途徑得以實現。因此，是否可以通過封閉hbz蛋白的bzip功能結構域來靶向治療，這是本領域科學家們首先希望能夠解決的問題，其次，如果可以通過封閉hbz蛋白的bzip功能結構域來靶向治療，那么什么樣的靶向藥物可以封閉hbz蛋白的bzip功能結構域，可以有效地治療atl，這些都是本領域科學家們亟待研究的問題，這些問題的研究成果將為我們研發治療atl的抗病毒藥物提供一個全新的思路與策略。

技術實現要素：

鑒于相關技術的上述問題和/或其他問題，本發明一方面提供了一種成人t細胞白血病的特異性靶向多肽，其中，所述特異性靶向多肽的序列的通式為：x-y-z-acp-r8；在所述通式中，y所代表的是如seqidno.1所示序列，acp所代表的是如seqidno.2所示序列，r8所代表的是seqidno.3所示序列；在所述通式中，x所代表的序列為如seqidno.4所示序列，z所代表的序列為seqidno.5所示序列；或者，x所代表的序列為如seqidno.4所示序列，z所代表的序列為空；或者，x與z所代表的序列同時為空。

本發明另一方面提供了一種編碼如權利要求1所述的特異性靶向多肽的基因。

本發明再一方面提供了上述的特異性靶向多肽在制備治療成人t細胞白血病的靶向藥物方面的用途。

本發明還一方面提供了一種治療成人t細胞白血病的靶向藥物，其中，所述靶向藥物包含如權利要求1所述的特異性靶向多肽。

本發明首次以htlv-1關鍵病毒蛋白hbz作為靶點篩選出來治療成人t細胞白血病的特異性靶向多肽，其可以用于制備治療成人t細胞白血病的靶向藥物。以本發明的特異性靶向多肽為基礎的靶向藥物和靶向治療手段，與傳統的抗腫瘤藥物的治療手段相比，細胞毒副作用較小，為今后研究抗htlv-1和atl藥物提供了一個全新的思路和策略。

附圖說明

圖1為驗證實施例1-3的特異性靶向多肽抑制hbz蛋白對ap-1信號通路的調控作用的熒光素酶報告基因檢測結果；

圖2為驗證實施例1-3的特異性靶向多肽抑制白血病細胞的惡性增殖的mtt細胞活力檢測結果；

圖3為驗證實施例1的特異性靶向多肽促進白血病細胞凋亡的流式細胞術檢測結果。

具體實施方式

以下通過實施例對本發明作進一步的說明，但本發明并不限于這些具體實施方式。

下面實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。

關于本發明的成人t細胞白血病的特異性靶向多肽的序列設計理念以及技術難題簡述如下：

首先，鑒于htlv-1編碼的病毒蛋白hbz，其n端具有與c-fos相似的亮氨酸拉鏈結構域，其致癌功能也正是通過其n端所具有的亮氨酸拉鏈結構域與c-jun等亮氨酸拉鏈相關蛋白的相互結合和相互作用得以實現，因此，發明人希望能夠設計一種可以人工合成的、且能夠阻遏hbz蛋白與c-jun相關蛋白結合（有效封閉hbz蛋白的bzip功能結構域）的靶向多肽，為治療atl提供新的有效的技術和手段。

其次，c-jun與c-fos形成了復合物對于細胞生命活動具有非常重要的作用，因此，待設計的靶向多肽在阻遏hbz蛋白與c-jun相關蛋白結合的同時，不能干擾fos-jun蛋白復合物的形成。待設計的靶向多肽，一方面要能夠與c-jun等相關蛋白競爭，有效封閉hbz蛋白的bzip功能結構域，另一方面，其結構不能與c-jun蛋白過于相似，導致干擾fos-jun蛋白復合物的形成。因此，由于hbz與fos的亮氨酸拉鏈結構域具有較高的相似性，這給設計靶向多肽帶來了很大的技術困難。

發明人綜合考察了hbz蛋白、c-fos蛋白以及c-jun蛋白的bzip功能結構域中的靜電分布，以及hbz蛋白與c-jun蛋白之間、c-fos蛋白與c-jun蛋白之間的靜電互作關系，同時對fos-jun蛋白復合物進行了x射線單晶衍射分析和對卷曲螺旋肽的測算分析，設計了大量的符合設計原則的多肽序列（以下簡稱hbap（hbzbzipassociatepeptide）序列）。進一步地，在這些復合設計原則的hbap序列基礎之上，發明人有考慮到靶向多肽的靶向性和藥物輸送性能，在每個多肽序列的n端添加了8個精氨酸（簡稱r8）的細胞穿膜肽，以增加靶向多肽的蛋白轉導活性，并可以作為有潛力的藥物輸送載體。更進一步地，為了避免多肽之間發生相互作用，維持蛋白的構象及其生物學活性，在hbap序列和r8序列之間添加了一個可彎曲的間隔序列acp。

發明人再通過試驗來驗證所設計的hbap-acp-r8序列是否能夠有效地與hbz蛋白結合，阻遏hbz蛋白與c-jun蛋白的相互作用，同時不會影響fos-jun蛋白復合物的形成。

經過大量的設計和驗證試驗，發明人獲得了本發明的成人t細胞白血病的特異性靶向多肽，一方面其對hbz蛋白的bzip功能結構域的親和性明顯高于c-jun蛋白與hbz蛋白之間的親和性，能夠有效封閉hbz蛋白的bzip功能結構域，阻遏hbz蛋白與c-jun相關蛋白結合，另一方面，其對hbz蛋白的bzip功能結構域的親和性明顯高于其對c-fos蛋白的bzip功能結構域的結合能力，或者說其對c-fos蛋白的bzip功能結構域的結合能力弱于c-jun蛋白對c-fos蛋白的bzip功能結構域的結合能力，因此不會影響fos-jun蛋白復合物的形成。

本發明的成人t細胞白血病的特異性靶向多肽，其序列的通式為：x-y-z-acp-r8；在該通式中，y所代表的是如seqidno.1所示序列（leriarleekvktlkaqnselastan），acp所代表的是如seqidno.2所示序列（vqaaidying），r8所代表的是seqidno.3所示序列（rrrrrrrr）；在該通式中，x所代表的序列為如seqidno.4所示序列（rkrk），z所代表的序列為seqidno.5所示序列（mlreqvaqlk）；或者，x所代表的序列為如seqidno.4所示序列（rkrk），z所代表的序列為空；或者，x與z所代表的序列同時為空。

在上述的通式x-y-z-acp-r8中，左側一端為c末端，右側一端為n末端。

實施例1

實施例1的特異性靶向多肽的序列通式中，x代表的是seqidno.4所示序列，y代表的是seqidno.1所示序列，z代表的是seqidno.5所示序列，acp所代表的是如seqidno.2所示序列，r8所代表的是seqidno.3所示序列；即，實施例1的特異性靶向多肽的序列如下：

rkrkleriarleekvktlkaqnselastanmlreqvaqlkvqaaidyingrrrrrrrr（如seqidno.6所示序列）。

實施例2

實施例2的特異性靶向多肽的序列通式中，x代表的是seqidno.4所示序列，y代表的是seqidno.1所示序列，z代表的是空，acp所代表的是如seqidno.2所示序列，r8所代表的是seqidno.3所示序列；即，該特異性靶向多肽的序列如下：

rkrkleriarleekvktlkaqnselastanvqaaidyingrrrrrrrr（如seqidno.7所示序列）。

實施例3

實施例3的特異性靶向多肽的序列通式中，x代表的是空，y代表的是seqidno.1所示序列，z代表的是空，acp所代表的是如seqidno.2所示序列，r8所代表的是seqidno.3所示序列；即，該特異性靶向多肽的序列如下：

leriarleekvktlkaqnselastanvqaaidyingrrrrrrrr（如seqidno.8所示序列）。

上述實施例1、2和3的特異性靶向多肽均可以采用人工合成的方式來制備（例如，發明人委托百奇生物科技（蘇州）有限公司合成上述實施例1、2和3的特異性靶向多肽）。

在本發明的一個具體實施方案中，提供了編碼上述特異性靶向多肽的基因。本領域技術人員在獲知上述特異性靶向多肽的氨基酸序列之后，可以根據經驗獲得對應的編碼基因的核苷酸序列。

特異性靶向多肽抑制hbz蛋白與c-jun蛋白之間的相互作用

將表達hbz蛋白的載體pcdna3-mychis-hbz和表達c-jun蛋白的載體pcmv-ha-c-jun共轉染至293ft細胞，6小時后分別加入上述實施例1-3的特異性靶向多肽，處理48小時后，裂解細胞并提取細胞的總蛋白，再采用免疫共沉淀技術（co-ip）來分析蛋白的結合情況。

co-ip的處理過程簡述如下：20μlproteing預處理1mg總蛋白樣品30min后，收集上清蛋白，加入flag抗體，4℃旋轉混勻1h，再加入20μlproteing，4℃旋轉混勻1h。結合有抗體及目的蛋白的proteing經過緩沖液洗滌5次后，煮沸變性，westernblot檢測目的蛋白的表達水平。

檢測結果表明：hbz蛋白能與c-jun蛋白結合，然而經過實施例1-3的特異性靶向多肽處理后，顯著抑制了hbz與c-jun蛋白復合物的形成。

特異性靶向多肽抑制hbz蛋白對ap-1信號通路的調控作用

為了進一步研究本發明的特異性靶向多肽對hbz蛋白所調控的ap-1信號通路的作用，我們采用了雙熒光素酶報告基因技術。我們將hbz蛋白和c-jun蛋白的表達質粒分別轉染到對應組別的jurkat細胞中。轉染6h后分別加入實施例1-3的特異性靶向多肽進行處理。48h后收集細胞，運用報告基因檢測儀檢測熒光值。

結果如圖1所示，hbz蛋白可顯著抑制由c-jun激活的ap-1信號通路。然而，加入了實施例1-3的特異性靶向多肽后，hbz蛋白對ap-1信號通路的抑制作用明顯被抵消，該結果進一步證明，實施例1-3的特異性靶向多肽能通過與hbz蛋白結合，從而干擾hbz與其他亮氨酸拉鏈蛋白的結合，進而影響下游信號通路。

特異性靶向多肽抑制白血病細胞惡性增殖

[33]我們運用mtt技術分析實施例1和實施例3的特異性靶向多肽通過對hbz蛋白功能的抑制是否能影響白血病細胞的惡性增殖。

參見圖2，mtt檢測細胞活力的實驗結果。從圖2的結果可以看出，感染有htlv-1病毒的atl-t和tl-om1細胞在監測的96h內細胞生長旺盛，但實施例1和3的特異性靶向多肽的加入可以顯著的抑制白血病細胞atl-t和atl-2的惡性增值，且該抑制作用呈現出劑量依賴效應。該結果證明實施例1和3的特異性靶向多肽可以通過與hbz蛋白的互作影響hbz蛋白下游的調控信號通路，最終抑制白血病細胞的生長。

特異性靶向多肽促進白血病細胞凋亡

為了進一步檢測本發明的特異性靶向多肽是否影響腫瘤細胞凋亡，我們對經實施例1的特異性靶向多肽處理后的細胞進行annexinv/7-aad（磷脂結合蛋白v/7-氨基放線菌素d）染色，并用流式細胞術檢測。檢測結果參見圖3，實施例1的特異性靶向多肽可誘導25.83%的atl-t細胞發生凋亡。實施例1的特異性靶向多肽作用atl-2細胞24h后，腫瘤細胞atl-2的細胞凋亡率增加（死細胞變多）。

從圖3的結果可以看出，本發明的特異性靶向多肽可以通過抑制其蛋白結合能力，顯著抑制白血病細胞惡性增值，并促進細胞凋亡。

綜上所述，上述多方面的效果驗證試驗證明了本發明的特異性靶向多肽能夠有效封閉hbz蛋白的bzip功能結構域，阻遏hbz蛋白與c-jun等亮氨酸拉鏈蛋白的結合，進而影響hbz蛋白下游的調控信號通路，最終抑制白血病細胞的惡性增值，并促進白血病細胞凋亡。

因此，本發明的特異性靶向多肽可以用于制備治療成人t細胞白血病的靶向藥物。本領域技術人員可以在獲知上述特異性靶向多肽之后，以本發明的特異性靶向多肽為藥物活性成分或者藥物活性成分之一，或者再結合其他常規輔料，從而獲得治療成人t細胞白血病的靶向藥物。

本發明的發明人首次以htlv-1關鍵病毒蛋白hbz作為靶點篩選出來治療成人t細胞白血病的特異性靶向多肽，其可以用于制備治療成人t細胞白血病的靶向藥物。以本發明的特異性靶向多肽為基礎的靶向藥物和靶向治療手段，與傳統的抗腫瘤藥物的治療手段相比，細胞毒副作用較小，為今后研究抗htlv-1和atl藥物提供了一個全新的思路和策略。

應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為一個整體，各實施方式中的技術方案也可以經適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。

上文所列出的一系列的詳細說明僅僅是針對本發明的可行性實施方式的具體說明，它們并非用以限制本發明的保護范圍，凡未脫離本發明技藝精神所作的等效實施方式或變更均應包含在本發明的保護范圍之內。

sequencelisting

<110>浙江師范大學

<120>一種成人t細胞白血病的特異性靶向多肽及其應用

<130>2017-zjnu-1

<160>8

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>26

<212>prt

<213>人工合成

<400>1

leugluargilealaargleugluglulysvallysthrleulysala

151015

glnasnsergluleualaserthralaasn

2025

<210>2

<211>10

<212>prt

<213>人工合成

<400>2

valglnalaalaileasptyrileasngly

1510

<210>3

<211>8

<212>prt

<213>人工合成

<400>3

argargargargargargargarg

15

<210>4

<211>4

<212>prt

<213>人工合成

<400>4

arglysarglys

1

<210>5

<211>10

<212>prt

<213>人工合成

<400>5

metleuarggluglnvalalaglnleulys

1510

<210>6

<211>58

<212>prt

<213>人工合成

<400>6

arglysarglysleugluargilealaargleugluglulysvallys

151015

thrleulysalaglnasnsergluleualaserthralaasnmetleu

202530

arggluglnvalalaglnleulysvalglnalaalaileasptyrile

354045

asnglyargargargargargargargarg

5055

<210>7

<211>48

<212>prt

<213>人工合成

<400>7

arglysarglysleugluargilealaargleugluglulysvallys

151015

thrleulysalaglnasnsergluleualaserthralaasnvalgln

202530

alaalaileasptyrileasnglyargargargargargargargarg

354045

<210>8

<211>44

<212>prt

<213>人工合成

<400>8

leugluargilealaargleugluglulysvallysthrleulysala

151015

glnasnsergluleualaserthralaasnvalglnalaalaileasp

202530

tyrileasnglyargargargargargargargarg

3540