具有抗皮膚癌活性的松樹提取物及其制備方法和其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種具有抗皮膚癌活性的松樹提取物及其制備方法，本發明通過采用優選乙醚提取或超臨界流體萃取的方法，制備得到具有強抗皮膚癌活性的松樹提取物。本發明充分利用松樹資源，通過對松枝、松樹皮或松樹滲出物的化學成分研究和生物活性實驗篩選，去粗存精，制備得到具有強抗皮膚癌活性的松樹提取物，實驗結果表明，本發明提供的松樹提取物活性成分清楚，含量高，抗皮膚癌活性強，具有重要的經濟和社會效益，有望開發成為新的抗皮膚癌藥物。
【專利說明】具有抗皮膚癌活性的松樹提取物及其制備方法和其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種植物提取物，具體涉及一種具有抗皮膚癌活性的松樹提取物及其 制備方法和其應用。
【背景技術】
[0002] 松樹是松科松屬植物統稱，常綠針葉喬木，為常綠針葉林的代表樹，為我國亞熱帶 地區重要的材用和特種經濟樹種。松樹木材堅硬美觀，宜制家具、箱子，又為綠化樹、行道 樹。松樹還有廣泛的藥用價值。松根能祛風除濕,活血止血；主風濕痹痛,風疹瘙癢。松樹 皮用于祛風除濕，斂瘡生肌；主治風濕骨痛，跌打損傷，濕疹，燒燙傷，癰疽久不收口。松科松 屬數種植物中滲出的油樹脂，經蒸餾或提取得到的揮發油，即為松節油，可用于肌肉痛或關 節痛等。以油樹脂為原料，通過不同的加工方式得到的非揮發性的天然樹脂稱為松香，松香 能祛風燥濕，生肌止痛，適用于癰癤瘡瘍，濕疹，外傷出血，燒燙傷。松針對治療腦中風、動脈 硬化、對血壓可雙向調節；對高血脂、糖尿病、青春痘、過敏性鼻炎等有殊的療效。松花粉是 中醫學中的藥食兼用花粉品種，功能收斂止血，燥濕斂瘡；可用于外傷出血，濕疹，黃水瘡， 皮膚糜爛。松子營養豐富，是人們喜食之物。而且還有潤燥養血、祛風之功效，主治肺燥咳 嗽、大便虛秘。松樹中含有大量生物黃酮類物質、前花青素，還富含葉綠素、多種維生素、多 種萜類、不飽和脂肪酸、酶與輔酶、以及微量元素等活性物質。
[0003] 為了綜合利用松樹的資源，減少資源的浪費，很有必要對松樹小枝的化學成分及 活性進行深入的研究，進而擴大松樹的利用范圍，同時也為松樹效應物質基礎的闡明奠定 基礎。
【發明內容】
[0004] 發明目的：本發明的目的是為了充分利用松樹小枝資源，在松樹小枝原有化學成 分及其用途的基礎上，對其化學成分進行深入研究，開發其新的用途，提供一種具有抗皮膚 癌活性的松樹提取物及其制備方法和其作為抗皮膚癌活性中的應用。
[0005] 技術方案：為了實現以上目的，本發明采取的技術方案為：
[0006] -種具有抗皮膚癌活性的松樹提取物，它是通過以下方法制備得到：取松枝、松樹 皮或松樹滲出物，粉粹，加8?10倍量低極性溶劑，回流提取1?3次，合并提取液，蒸去溶 齊?，得包括海松酸、松香酸、濕地松醇、羅漢松二萜活性成分的提取物。.
[0007] 作為優選方案，以上所述的具有抗皮膚癌活性的松樹提取物，所述的低極性溶劑 為石油醚、乙醚、氯仿。最佳優選乙醚。
[0008] 作為優選方案，以上所述的具有抗皮膚癌活性的松樹提取物的制備方法，其包括 以下步驟：取松枝、松樹皮或松樹滲出物，粉粹，加8?10倍量低極性溶劑，回流提取1? 3次，合并提取液，蒸去溶劑，得包括海松酸、松香酸、濕地松醇、羅漢松二萜活性成分的提取 物。·
[0009] 以上所述的具有抗皮膚癌活性的松樹提取物的制備方法，所述的低極性溶劑為石 油醚、乙醚、氯仿。最佳優選乙醚。
[0010] 一種具有抗皮膚癌活性的松樹提取物，它是通過以下方法制備得到：取松枝、松樹 皮或松樹滲出物，粉粹，采用CO2超臨界流體萃取，分離得到松樹提取物；其中CO2超臨界流 體萃取的條件為：萃取壓力40?45MPa，萃取溫度45?50°C，萃取時間60?90min。 toon] 作為優選方案，以上所述的具有抗皮膚癌活性的松樹提取物，它是通過以下方法 制備得到：取松枝、松樹皮或松樹滲出物，粉粹，采用CO2超臨界流體萃取，分離得到松樹提 取物；其中〇)2超臨界流體萃取的條件為：萃取壓力40MPa，萃取溫度50°C，萃取時間60min。 本發明根據松枝中海松酸、松香酸、濕地松醇和羅漢松二萜活性成分的理化性質，通過大量 實驗篩選最佳的提取分離方案，本發明通過優選實驗后采用CO2超臨界流體萃取，然后本發 明以海松酸、松香酸、濕地松醇和羅漢松二萜得率為指標，通過正交實驗，考察不同的CO2超 臨界流體萃取條件，篩選不同的萃取壓力、萃取溫度和萃取時間，得到最佳的CO2超臨界流 體萃取工藝，g卩：萃取壓力為40MPa，萃取溫度為50°C，萃取時間為60min。
[0012] 本發明通過實驗篩選表明，本發明提供的優選實驗制備得到的松樹提取物具有很 好的抗皮膚癌的活性，因此采用本發明優選方法制備得到的松樹提取物可用于制備抗皮膚 癌藥物制劑。
[0013] 作為優選方案，本發明所述的具有抗皮膚癌活性的松樹提取物在制備抗鱗狀細胞 癌和惡性黑色素瘤的藥物制劑中的應用。
[0014] 作為優選方案，本發明所述的具有抗皮膚癌活性的松樹提取物在制備抗鱗狀細胞 癌和惡性黑色素瘤的藥物制劑中的應用，所述的藥物制劑為軟膏劑、糊劑、硬膏劑、乳油劑、 微乳劑、懸乳劑或懸浮劑。
[0015] 本發明提供的具有抗皮膚癌活性的松樹提取物在制成軟膏劑時，把松樹提取物和 適量輔料尿素、甘油、白凡士林、吐溫-80、單硬脂酸甘油酯、苯甲酸鈉、蒸餾水，需要時加入 適量的有機溶劑丙酮、無水乙醇等，混合均勻，即得。
[0016] 本發明提供的具有抗皮膚癌活性的松樹提取物在制成懸浮劑時，把松樹提取物和 適量的潤濕分散劑、增粘劑、防凍劑、消泡劑混合均勻，然后加入水，即得。所述的潤濕分散 劑可為烷基酚甲醛樹脂聚氧乙烯醚、烷基苯磺酸鹽、長鏈脂肪醇聚氧乙烯醚、苯乙基酚聚氧 乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚、脂肪醇硫酸酯鹽中的一種或多種混合物。所述的增粘劑可為聚 乙烯醇、黃原膠、海藻酸鈉、黃原酸膠或羥丙基甲基纖維素。所述的防凍劑可為乙二醇、丙二 醇或甘油，所述的消泡劑為有機娃或聚醚類。
[0017] 本發明提供的具有抗皮膚癌活性的松樹提取物在制成微乳劑時，把松樹提取物和 適量的乳化劑、防凍劑、穩定劑、稀釋溶劑，加水混合均勻，即得。所述的乳化劑可為烷基酚 聚氧乙烯醚甲醛縮合物、烷基聚氧乙烯醚、脂肪酸聚氧乙烯酯、芐基聯苯酚聚氧乙烯醚、壬 基酚聚氧乙烯醚、苯乙基酚聚氧乙烯醚、苯乙烯聚氧乙烯醚硫酸餒鹽、烷基苯磺酸鹽、烷萘 磺酸鹽中的一種或多種混合物。
[0018] 有益效果：本發明提供的松樹提取物具有以下優點：
[0019] 1、本發明通過對松枝進行化學成分和生物活性大量實驗篩選，得到具有抗皮膚癌 活性的松樹提取物有效部位，并通過高效液相-質譜等現代儀器分析，得出松樹提取物有 效部位包括海松酸、松香酸、脫氫松香酸、濕地松醇、羅漢松二萜等活性成分；
[0020] 2、本發明提供的松枝的有效部位，在充分利用松樹植物資源基礎上，變費為寶，開 發出松樹新的藥用資源，所提供的松枝的有效部位中有效成分清楚，為闡明松枝效應物質 基礎奠定了基礎，且其抗皮膚癌活性強，可開發成為新的抗皮膚癌藥物。且本發明提供的松 枝的提取物有效部位可以方便制備成多種藥物劑型，方便使用。
【具體實施方式】
[0021] 根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用于說明本發明，而不應當也不會限 制權利要求書中所詳細描述的本發明。
[0022] 實施例1
[0023] -種具有抗皮膚癌活性的松樹提取物，它是通過以下方法制備得到：取干燥的松 枝，粉粹，加10倍量乙醚，回流提取3次，合并提取液，蒸去溶劑，得包括海松酸、松香酸、濕 地松醇、羅漢松二萜等活性成分的提取物。通過HPLC-MS等儀器分析，所述的提取物中包括 重量百分比分別為18%海松酸、2. 5%松香酸、3. 5%濕地松醇活性成分。提取物加入適量輔 料尿素、甘油、白凡士林、吐溫-80、單硬脂酸甘油酯、苯甲酸鈉、蒸餾水，混合均勻，得到軟膏 劑。
[0024] 實施例2
[0025] -種具有抗皮膚癌活性的松樹提取物，它是通過以下方法制備得到：取干燥的松 樹皮，粉粹，加8倍量乙醚，回流提取2次，合并提取液，蒸去溶劑，得包括海松酸、松香酸、濕 地松醇、羅漢松二萜等活性成分的提取物。通過HPLC-MS等儀器分析，所述的提取物中包括 重量百分比分別為15%海松酸、2. 0%松香酸、3. 0%濕地松醇活性成分。
[0026] 取松樹提取物和適量的潤濕分散劑、增粘劑、防凍劑、消泡劑混合均勻，然后加入 水，即得懸浮劑時。所述的潤濕分散劑可選擇烷基酚甲醛樹脂聚氧乙烯醚、烷基苯磺酸鹽、 長鏈脂肪醇聚氧乙烯醚、苯乙基酚聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚、脂肪醇硫酸酯鹽中的一 種或多種混合物。增粘劑可選擇聚乙烯醇、黃原膠、海藻酸鈉、黃原酸膠或羥丙基甲基纖維 素。所述的防凍劑可選擇乙二醇、丙二醇或甘油，所述的消泡劑可選擇有機硅或聚醚類。
[0027] 實施例3
[0028] -種具有抗皮膚癌活性的松樹提取物，它是通過以下方法制備得到：取松枝，粉 粹，采用CO2超臨界流體萃取，分離得到松樹提取物；其中CO2超臨界流體萃取的條件為：萃 取壓力40MPa，萃取溫度50°C，萃取時間60min。經HPLC-MS分析，所述的提取物中包括重量 百分比分別為20%海松酸、3%松香酸、4. 0%濕地松醇等活性成分。
[0029] 取松樹提取物和適量乳化劑、防凍劑、穩定劑、稀釋溶劑，加水混合均勻，得到微乳 齊U。所述的乳化劑可選擇烷基酚聚氧乙烯醚甲醛縮合物、烷基聚氧乙烯醚、脂肪酸聚氧乙烯 酯、芐基聯苯酚聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、苯乙基酚聚氧乙烯醚、苯乙烯聚氧乙烯醚 硫酸餒鹽、烷基苯磺酸鹽、烷萘磺酸鹽中的一種或多種混合物。
[0030] 實施例4
[0031] 一種具有抗皮膚癌活性的松樹提取物，它是通過以下方法制備得到：取干燥的松 樹滲出物，粉粹，采用CO2超臨界流體萃取，分離得到松樹提取物；其中CO2超臨界流體萃取 的條件為：萃取壓力50MPa，萃取溫度45°C，萃取時間60min。經HPLC-MS分析，所述的提取 物中包括重量百分比分別為18%海松酸、2. 8%松香酸、3. 8%濕地松醇等活性成分。
[0032] 實施例5松樹提取物抗皮膚癌活性的實驗研究
[0033] 1、實驗方法：
[0034] 取SPF級別ICR雄性小鼠分為7組，分別為：空白組（I)、模型組（II)、陽性藥氟尿 嘧啶給藥組（III)、實施1制備得到的松樹提取物低劑量組（IV)、松樹提取物高劑量組（V)、 實施3制備得到的松樹提取物低劑量組（VI)、松樹提取物高劑量組（W)。氟尿嘧啶、松 樹提取物低劑量組和松樹提取物高劑量組分別以丙酮配成lg/mL、lg/mL和4g/mL的溶液。 小鼠背部脫毛后用二甲苯蒽（DMBA)和紫外線照射誘導除空白組之外的4組小鼠形成皮膚 癌，每日進行紫外線（UVC)燈（波長值為265nm)照射，燈管距皮膚的距離為30cm，每次照 射劑量為56mJ/cm2,時間為30min。每周一次局部涂抹0. 5mg/mL的DBM丙酮溶液0.ImL/ cm2。同時分別在小鼠背部涂抹以上各組相應的藥物（0.ImL/只?天），給予一定的治療。 兩個月實驗結束后，切取背部局部病變皮膚組織，行常規HE染色病理檢查和免疫組織化學 染色觀察小鼠背部皮膚變化過程，分析皮膚組織中上皮角蛋白CK10、CK5/6表達強度，通 過SPSS13. 0軟件包采用單因素方差分析方法對其在不同時間位點的表達強度進行統計學 分析。
[0035] 2、實驗結果：
[0036] 病理檢測結果表明，兩個月造模后小鼠背部皮膚明顯增生、破潰，形成火山口狀或 乳頭狀增生，HE染色表現為高分化鱗癌。模型組小鼠皮膚均可見表皮增厚，鱗狀上皮細胞 重度增生，角化質明顯增多，較多色素沉著，真皮層見少量炎細胞浸潤，皮膚附件明顯減少。 陽性藥給藥組和本發明制備得到的松樹提取物低劑量給藥組小鼠皮膚均可見表皮鱗狀上 皮細胞變性壞死脫落，角化質增多，真皮層見中度炎細胞浸潤，皮膚附件明顯減少。松樹提 取物高劑量給藥組小鼠皮膚均可見表皮增厚，鱗狀上皮細胞輕度增生，角化質輕度增多少 量色素沉著，真皮層見少量炎細胞浸潤。與模型組相比較，各給藥組小鼠皮膚病理變化明顯 好轉。上皮角蛋白具體實驗結果如表1所示：
[0037] 表ICK5/6與CKlO在不同組之間的表達強度
[0038]
【權利要求】
1. 一種具有抗皮膚癌活性的松樹提取物，其特征在于，它是通過以下方法制備得到： 取松枝、松樹皮或松樹滲出物，粉粹，加8~10倍量低極性溶劑，回流提取1~3次，合并提取 液，蒸去溶劑，得包括海松酸、松香酸、濕地松醇、羅漢松二萜活性成分的提取物。
2. 根據權利要求1所述的具有抗皮膚癌活性的松樹提取物，其特征在于，所述的低極 性溶劑為石油醚、乙醚、氯仿。
3. 權利要求1所述的具有抗皮膚癌活性的松樹提取物的制備方法，其特征在于包括以 下步驟：取松枝、松樹皮或松樹滲出物，粉粹，加8~10倍量低極性溶劑，回流提取1~3次，合 并提取液，蒸去溶劑，得包括海松酸、松香酸、濕地松醇、羅漢松二萜活性成分的提取物。
4. 一種具有抗皮膚癌活性的松樹提取物，其特征在于，它是通過以下方法制備得到： 取松枝、松樹皮或松樹滲出物，粉粹，采用C02超臨界流體萃取，分離得到松樹提取物；其 中〇)2超臨界流體萃取的條件為：萃取壓力4(T45MPa，萃取溫度45?50° C，萃取時間60 ~90min〇
5. 根據權利要求4所述的具有抗皮膚癌活性的松樹提取物，其特征在于，它是通過以 下方法制備得到：取松枝、松樹皮或松樹滲出物，粉粹，采用C02超臨界流體萃取，分離得到 松樹提取物；其中〇)2超臨界流體萃取的條件為：萃取壓力40 MPa，萃取溫度50° C，萃取 時間60 min。
6. 權利要求1或2所述的具有抗皮膚癌活性的松樹提取物在制備抗皮膚癌藥物制劑中 的應用。
7. 權利要求1或2所述的具有抗皮膚癌活性的松樹提取物在制備抗鱗狀細胞癌和惡性 黑色素瘤的藥物制劑中的應用。
8. 權利要求4或5所述的具有抗皮膚癌活性的松樹提取物在制備抗皮膚癌藥物制劑中 的應用。
9. 權利要求4或5所述的具有抗皮膚癌活性的松樹提取物在制備抗鱗狀細胞癌和惡性 黑色素瘤的藥物制劑中的應用。
10. 根據權利要求8所述的具有抗皮膚癌活性的松樹提取物在制備抗鱗狀細胞癌和惡 性黑色素瘤的藥物制劑中的應用，其特征在于，所述的藥物制劑為軟膏劑、糊劑、硬膏劑、乳 油劑、微乳劑、懸乳劑或懸浮劑。
【文檔編號】A61P35/00GK104398541SQ201410764563
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年12月12日 優先權日:2014年12月12日
【發明者】楊念云, 周紅, 陳秀珍 申請人:南京中醫藥大學