本發明涉及生物醫學領域，特別地，涉及一種包含干細胞分泌因子的組合物及其制備方法，以及用該組合物制備的包含干細胞分泌因子的口腔噴劑。
背景技術：
干細胞(stem cells，SC)是一類具有自我復制能力(self-renewing)的多潛能細胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能細胞。干細胞是一種未充分分化，尚不成熟的細胞，具有再生各種組織器官和人體的潛在功能，醫學界稱之為“萬用細胞”。干細胞可以在機體生命過程中無限期分裂，并在合適的條件或給予恰當的條件后，能分化產生多種不同的細胞類型。
干細胞可分泌許多生物活性分子，如間充質干細胞至少分泌免疫調節因子(HGF、LIF)、趨化因子(RANTES、SDF-1α、fractalkine、MIP-1α、MCP-1、MCP-2)、支持祖細胞的營養因子(IL-6、FGF-2、PDGF-AA、PDGF-BB、EGF)、血管再生因子(VEGF165、FGF-2、PDGF-AA、PDGF-BB、EGF)、抑制疤痕因子(HGF、FGF-2)、抗凋亡因子(VEGF165、FGF-2、HGF)、傷口愈合相關因子(IL-6、IL-8、TGF-β1、MCP-1、VEGF、GM-CSF)、TIMP-1)、各型膠原蛋白(I、II、III、IV型膠原蛋白)以及各種溶菌酶等。
人口腔的舌下粘膜上皮未被角質化，最有利于生物有效分子的全身吸收；其次是齒齦和硬腭，一般來說，人口腔粘膜對生物分子的通透性：舌下粘膜>頰粘膜>牙齦。
人體的呼吸系統主要由鼻、咽、喉、氣管、支氣管、細支氣管、終末細支氣管、呼吸細支氣管、肺泡管及肺泡囊組成。從氣管到肺泡，氣道的管徑越來越小，但數量卻大大增加。呼吸道表面覆蓋假復層纖毛柱狀上皮，纖毛細胞間夾有杯狀細胞，柱狀細胞游離面可見纖毛。
生物有效分子在肺部主要的吸收部位是肺泡。正常成人大約有幾億個肺泡，總表面積約為200m2，與小腸粘膜的微絨毛總面積大致相當。肺泡是半球狀的囊泡，由單層扁平上皮細胞構成，厚度僅0.1-0.5μm，相鄰肺泡之間的薄層結締組織為肺泡隔。肺泡隔內有豐富的毛細血管及膠原纖維和彈性纖維。肺泡壁和毛細血管壁間的厚度僅約1μm，是氣體交換和生物有效分子吸收的良好場所。由于肺泡吸收表面積大、毛細血管網豐富、轉運距離極小，因此肺部給藥吸收迅速。另外，肺部吸收相對胃腸道吸收來說，對生物有效分子的代謝作用小，可避免肝臟的首過效應影響。
技術實現要素：
為解決以上技術問題，本發明提供了一種制備包含干細胞分泌因子的組合物的方法，其包括以下步驟：
S1：從胚性組織中分離出間充質干細胞；
S2：擴增培養所述間充質干細胞，得到包含干細胞分泌因子的培養物；
S3：從所述培養物中去除間充質干細胞得到包含干細胞分泌因子的溶液；
S4：純化所述溶液，并進行真空冷凍干燥得到包含干細胞分泌因子的組合物。
進一步地，所述胚性組織來自臍帶。
進一步地，去除臍帶外膜，得到華通膠組織，剪成1mm3的組織塊。
進一步地，通過用胰酶和膠原酶消化所述組織塊來分離。時間為1-2小時左右。
進一步地，消化后用200目篩網過濾，然后用生理鹽水洗滌，所得細胞加入干細胞培養基于含5％CO2的37℃培養箱培養。
進一步地，待細胞長至80％融合時傳代培養，得到所述間充質干細胞。
進一步地，S2中用干細胞培養基來擴增培養所述間充質干細胞，直至所述間充質干細胞高表達細胞表面標志CD29和CD105。
進一步地，S4中通過離心的方法從所述培養物中去除所述間充質干細胞。
進一步地，S5中通過硫酸銨沉淀去除雜質然后通過透析除鹽，由此純化所述溶液。
本發明還提供了一種通過上述方法制備得到的包含干細胞分泌因子的組合物。
本發明還提供了一種由上述組合物制備得到的包含干細胞分泌因子的口腔噴劑。
本發明的有益效果是：本發明制備的口腔噴劑通過呼吸道由口腔、咽、喉、氣管、支氣管、肺部等部分完成吸收過程。主要經過口腔黏膜及肺部吸收，人口腔的舌下粘膜上皮未被角質化，最有利于生物有效分子的全身吸收；其次是齒齦和硬腭，一般來說，人口腔粘膜對生物分子的通透性：舌下粘膜>頰粘膜>牙齦。口腔粘膜吸收沒有肝臟的首過效應，有效成分直接由頸內豐富的靜脈進入循環系統，迅速發揮作用。起效所需時間短。對生物有效分子的依從性好，吸收過程和吸收效果易于控制；粘膜不易損傷，易于修復；避免胃腸道的消化酶的消化作用；可發揮局部或全身作用。
肺部具有巨大的表面積，毛細血管豐富，能夠快速高效的吸收分子量較大的蛋白多肽類物質，有效吸收率高，肺泡囊壁由單層上皮細胞構成，這些細胞緊靠毛細血管網，氣血屏障較小，蛋白和多肽類通過空氣血液途徑交換的距離短，速度快；肺部酶分布集中而且生物活性低，蛋白質和多肽類物質通過肺部吸收仍可保持生物活性；肺部吸收生物有效分子可以避免胃腸道對生物有效分子的不良影響及能避開肝臟的首關效應，提高生物利用度。
本發明的組合物和口腔噴劑中包含間充質干細胞分泌的細胞因子，間充質干細胞至少分泌免疫調節因子(HGF、LIF)、趨化因子(RANTES、SDF-1α、fractalkine、MIP-1α、MCP-1、MCP-2)、支持祖細胞的營養因子(IL-6、FGF-2、PDGF-AA、PDGF-BB、EGF)、血管再生因子(VEGF165、FGF-2、PDGF-AA、PDGF-BB、EGF)、抑制疤痕因子(HGF、FGF-2)、抗凋亡因子(VEGF165、FGF-2、HGF)、傷口愈合相關因子(IL-6、IL-8、TGF-β1、MCP-1、VEGF、GM-CSF)、TIMP-1)、各型膠原蛋白(I、II、III、IV型膠原蛋白)以及各種溶菌酶等。干細胞分泌的這些生物活性分子可以支持干細胞自身的生物活性功能，同時改善機體整體健康狀態，調節整體或者局部的微環境，修復細胞、改善細胞代謝、激活衰老細胞的功能，促進機體組織再生和器官功能恢復，刺激機體其他成體細胞的抗衰老作用。
具體實施方式
以下結合實例對本發明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發明，并非用于限定本發明的范圍。
1.干細胞口腔噴劑的制備
1)收集健康人體臍帶，對臍帶作進一步清洗，再用無菌手術剪將臍帶切割分為細小組織；
2)剪碎后的細小組織通過加入適當濃度的胰酶、膠原酶等消化臍帶組織塊1-2小時，以分化出細胞。收集分化出的細胞用干細胞培養基進行貼壁培養，獲得臍帶間充質干細胞；
3)間充質干細胞的擴增培養，用干細胞培養基通過常規干細胞培養的方式進行間充質干細胞的培養，根據細胞生長狀況進行換液，補液；
4)觀察細胞生長情況，取細胞檢測細胞表面標志CD29、CD105的表達情況，高表達上述檢測物質時，離心去除細胞，得到含間充質干細胞分泌因子的細胞培養液；
5)取細胞培養液進行硫酸銨沉淀，透析除鹽后，經真空冷凍干燥制成包含干細胞分泌因子的組合物，然后將該組合物制備成口腔噴劑。
2.培養液中一些干細胞分泌因子的含量
照常規方法培養間充質干細胞，觀察間充質干細胞生長情況，當細胞達到80％-90％融合時，取部分上清，用ELISA法定量測定細胞培養上清中IL-6、IL-8、MCP-1、TIMP-1的含量，設3個平行孔，得到的結果如表1所示
表1培養液中一些細胞因子的含量
由表1中可知，培養液中含有一定濃度的干細胞分泌因子，因此，尤其制備的組合物和口腔噴劑中也含有干細胞分泌因子。可用于亞健康人群，需要改善免疫狀態的人群、需要提高機體抗炎能力的人群，有抗衰老需求的人群。
以上所述僅為本發明的較佳實施例，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。