本發明涉及醫學領域，具體的說是涉及一種牙髓干細胞組合物及其應用。
背景技術：
：關節炎是與年齡密切相關的常見的關節疾病，隨著老齡化社會的到來，在老年人口中骨性關節炎的發病率有增加趨勢，骨性關節炎早期病理改變為軟骨的退變及破壞，其發病機制尚不明確，缺乏特異性的治療手段。最終的病理過程是細胞機制合成與降解的平衡收破壞引起的關節組織破壞。膝關節骨性關節炎是累及關節軟骨、軟骨下骨、半月板及滑膜等整個關節組織的復雜的慢性病變，容易引起軟骨代謝的改變，這種改變起始于關節軟骨的結構變化，滑膜的炎癥影響和參與這個過程已被廣泛認可。現有治療方法中，比較新穎的治療措施是采用細胞生物技術進行骨關節炎的治療，其中大部分是運用胚胎干細胞、臍帶間充質干細胞、脂肪間充質干細胞及骨髓間充質干細胞進行脊椎或是關節炎等軟骨病變相關研究。但是，這些細胞療法面臨著倫理及取材困難以及取材時對患者造成痛苦等問題。技術實現要素：有鑒于此，本發明的目的在于一種牙髓干細胞組合物及其應用，使得所述組合物對骨關節炎有顯著的療效，安全性更高。為了實現上述目的，本發明提供如下技術方案：一種牙髓干細胞組合物，包括牙髓干細胞、外周血單個核細胞(PBMC)和葡萄糖注射液。針對現有干細胞取材以及在治療骨關節炎效果方面欠佳的問題，本發明選用牙髓干細胞、PBMC以及葡萄糖注射液組成新型組合物，對骨關節炎具有較為顯著的療效。其中，作為優選，所述牙髓干細胞濃度為5.0×106-8.0×106個/ml，在本發明中的具體實施方式中，可以具體選擇6.0×106個/ml。所述牙髓干細胞的分離培養可按照常規方法進行，如按照文獻GronthosS,MankaniM,BrahimJ,etal.Postnatalhumandentalpulpstemcells(DPSCs)invitroandinvivo[J].ProcNatlAcadSciUSA,2000,97(25):13625-13630.中記載的制備方法進行，本發明提供了如下方法：在保證牙髓未被破壞的情況下，將拔除的健康智齒或其他用于分離干細胞的牙齒立即轉移至預冷高濃度雙抗中(雙抗：鏈霉素及青霉素)，浸泡15min，用D-Hank’s液反復沖洗3次，在無菌操作臺劈開牙齒，取出牙髓組織。用眼剪把牙髓組織剪成0.3-0.5mm3塊狀，加入4mg/ml濃度的Ⅰ型膠原酶，消化至肉眼看到不成塊狀的懸液，過篩，清洗之后接種培養(DMEM/F12+10％FBS)，每3天換液，細胞匯合度75％-85％時進行傳代培養。本發明優選采用的牙髓干細胞為傳代至第3-4代的細胞，收集方法如下：牙髓干細胞傳代到第3-4代，匯合度在85-90％時，用PBS清洗兩遍后，加入2-3mL0.25％胰酶-0.02％EDTA；置于倒置顯微鏡下觀察，80％細胞皺縮變圓時，加入5-8mL含10％FBS的DMEM培養基終止酶解，用移液槍反復吹打細胞，直至細胞全部脫落。把細胞懸液轉移至50mL離心管中，500-700g離心4-5min。離心結束后倒棄上清液，往細胞沉淀中加入20-30mL的生理鹽水重懸細胞，500-700g離心4-5min，棄上清液(該步驟重復一次)。作為優選，所述外周血單個核細胞的濃度為5.0×105-8.0×105個/ml；在本發明具體實施方式中，可具體選擇6.0×105個/ml。本發明所述PBMC可按照常規方法提取，具體地本發明按照如下方法進行：靜脈采集4ml抗凝血液，600g離心5min，棄除血漿，向紅細胞層加入3ml生理鹽水稀釋，緩慢混勻，取1支15ml離心管，先加入5mlFicoll溶液，再緩慢加入稀釋的血液，使稀釋的血液懸在Ficoll溶液上方。600g離心20min,吸取中間白膜細胞層，清洗3遍，待用。作為優選，所述葡萄糖注射液為10％葡萄糖注射液。以本發明所述組合物為試驗對象，將單個核細胞及10％葡萄糖為陽性對照，各組對兔骨關節炎模型進行注射治療，結果顯示，在9周的時間內，本發明處理組下的軟骨厚度增厚速度較快，與陽性對照組呈現顯著性差異，表明本發明所述組合物對骨關節炎具有顯著的療效。同時，采用軟骨病理學Mankin評分對比各組的修復性，結果顯示本發明各實驗組安全性最高。基于此技術效果，本發明提出了所述組合物在制備治療骨關節炎中產品中的應用。由以上技術方案可知，本發明組合物選擇牙髓干細胞、外周血單個核細胞和葡萄糖注射液作為治療骨關節炎的成分，組合物組成簡單，牙髓干細胞和PBMC為自體細胞，沒有倫理爭論問題，取材不受限制，并且整體對骨關節炎的效果優于單純的牙髓干細胞和單個核細胞，具有廣闊的應用前景。附圖說明圖1所示為牙髓干細胞的直徑分布圖；圖2所示為牙髓干細胞染色鏡檢圖。具體實施方式本發明實施例公開了一種牙髓干細胞組合物及其應用，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明內。本發明產品和應用已通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
發明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。在本發明具體實施方式中，本發明選用普通級瞬木反射正常的健康大白兔為實驗對象，雌雄隨機選取50只(購于廣東省實驗動物中心)，兔齡4-5個月，分為陰性組，模型組、陽性對照組1、陽性對照組2及本發明實驗組，每組各10只，適應性喂養1周后進行實驗。牙髓干細胞的提取通過拔除大白兔磨牙按照本發明提供的方法進行分離培養，然后進行傳代。外周血單個核細胞通過采集大白兔靜脈血按照本發明提供的方法進行提取。以下就本發明所提供的一種牙髓干細胞組合物及其應用做進一步說明。實施例1：牙髓干細胞的分離培養和傳代1、分離和傳代大白兔在局麻的狀態下拔出一顆磨牙，在保證牙髓未被破壞的情況下，立即轉移至預冷高濃度雙抗中(雙抗：鏈霉素及青霉素)，浸泡15min，用D-Hank’s液反復沖洗3次，在無菌操作臺劈開牙齒，取出牙髓組織。用眼剪把牙髓組織剪成0.3-0.5mm3塊狀，加入4mg/ml濃度的Ⅰ型膠原酶，消化至肉眼看到不成塊狀的懸液，過篩，清洗之后接種培養(DMEM/F12+10％FBS)，每3天換液，細胞匯合度75％-85％時進行傳代培養。牙髓干細胞傳代到第3代，匯合度在85-90％時，用PBS清洗兩遍后，加入2-3mL0.25％胰酶-0.02％EDTA；置于倒置顯微鏡下觀察，80％細胞皺縮變圓時，加入5-8mL含10％FBS的DMEM培養基終止酶解，用移液槍反復吹打細胞，直至細胞全部脫落。把細胞懸液轉移至50mL離心管中，500-700g離心4-5min。離心結束后倒棄上清液，往細胞沉淀中加入20-30mL的生理鹽水重懸細胞，500-700g離心4-5min，棄上清液(該步驟重復一次)。2、牙髓干細胞檢測牙髓干細胞收集前24h抽取培養液上清檢測細菌、真菌、內毒素和支原體，結果均呈陰性，表明牙髓干細胞微生物量達標；牙髓干細胞收集時對其直徑和活力進行檢測和觀察，結果見圖1和圖2，由圖1和圖2可見，牙髓干細胞在P3代時，細胞大小均勻、形態均為梭型，融合至85％時呈現漩渦狀。消化收集時，細胞98％拒染(死細胞被染成藍色，活細胞拒染)，細胞直徑在14-18um之間，符合牙髓干細胞體積大小分布，說明了牙髓干細胞并沒有出現體積變大等異常現象，活力較好。牙髓干細胞表面抗原流式檢測結果顯示，牙髓干細胞高表達CD146和CD90，表達率均為100％；低表達CD34和CD45，表達率分別為0.4％、0.2％，符合間充質干細胞表面抗原特征，說明了牙髓干細胞并沒有出現分化的現象，仍維持著干細胞的特點。實施例2：外周血單個核細胞的提取大白兔腿部靜脈采集4ml抗凝血液，600g離心5min，棄除血漿，向紅細胞層加入3ml生理鹽水稀釋，緩慢混勻，取1支15ml離心管，先加入5mlFicoll溶液，再緩慢加入稀釋的血液，使稀釋的血液懸在Ficoll溶液上方。600g離心20min,吸取中間白膜細胞層，清洗3遍，待用。實施例3：本發明所述牙髓干細胞組合物6.0×106個/ml牙髓干細胞，6.0×105個/ml外周血單個核細胞，10％葡萄糖注射液；實施例4：本發明所述牙髓干細胞組合物8.0×106個/ml牙髓干細胞，5.0×105個/ml外周血單個核細胞，10％葡萄糖注射液；實施例5：本發明所述牙髓干細胞組合物5.0×106個/ml牙髓干細胞，8.0×105個/ml外周血單個核細胞，10％葡萄糖注射液；實施例6：骨關節炎治療效果對比按照文獻《實驗兔膝骨關節炎模型的建立及鑒定曾俊華》(馬篤軍，彭力平，何升華，余闐，陳達.中國臨床研究.2016(05)∶679-682.)制作兔骨關節炎模型，造模時間為4-5周。陰性組兔不造模注射10％葡萄糖溶液，模型組兔造模并注射10％葡萄糖，陽性對照組1兔造模注射牙髓干細胞及10％葡萄糖，陽性對照組2兔造模注射單個核細胞及10％葡萄糖，實驗組1-3兔造模注射本發明實施例3-5組合物，各組細胞濃度相同，均以經皮穿刺為關節區局部多點注射，每周注射一次，連續注射三周。為了評價骨關節炎形態學是否改變，在首次注射后的第1周、第3周、第6周、第9周進行一次MRI掃描，對比軟骨厚度的變化情況，結果見表1。表1MRI評價軟骨厚度(x±S，n＝3，mm)注：**表示實驗組1,2,3分別與模型組，陽性組對照組有極顯著性差異，P<0.01；由表1可以看出，陰性組的軟骨厚度在第9周內并沒有出現大的變化，軟骨厚度維持在一個穩定的水平，且厚度并沒有出現差異性減少。而模型組，其存在一定的自我修復機制，軟骨厚度在第9周內有所增加，但其厚度增厚速度慢，并不能起到明顯的改善作用。陽性對照的軟骨厚度經過9周的修復后，其軟骨厚度與模型組相比有較好的改善，但是尚未達到顯著性差異，而本發明各實驗組的軟骨厚度與陽性對照組相比均具有顯著性差異，表明本發明牙髓干細胞組合物可用于治療骨關節炎，且治療效果較好。同時，對各組進行修復情況評分，以軟骨病理學Mankin評分標準進行評述，結果見表2。表2軟骨病理學Mankin評分比較(x±S)組別只數第1周第3周第6周第9周陰性組101.40±0.121.50±0.181.43±0.241.47±0.21模型組105.31±0.575.23±0.325.16±0.184.90±0.28陽性對照組1105.30±0.325.12±0.184.99±0.224.20±0.17陽性對照組2105.31±0.345.20±0.285.07±0.214.62±0.24實驗組1105.30±0.254.06±0.37**3.23±0.26**2.76±0.27**實驗組2105.31±0.384.51±0.20**3.78±0.14**3.01±0.32**實驗組3105.30±0.424.14±0.19**3.45±0.09**2.98±0.04**注：**表示實驗組1,2,3分別與模型組，陽性組對照組有極顯著性差異，P<0.01；由表2可知，陰性組的軟骨病理學Mankin評分在9周內并沒有出現大的變化，軟骨組織維持在一個穩定的水平，并沒有出現病理性變化。而模型組，其存在一定的自我修復機制，軟骨病理學Mankin分值在9周內有所下降，但其改善速度慢，并不能起到明顯的改善作用。陽性對照組軟骨厚度經過9周的修復后，其軟骨病理學Mankin分值與模型組相比更小，但是尚未達到顯著性差異；而本發明各實驗組分值雖然與陰性組相比仍具有一定差異，但是相比陽性對照組分值更小且達到顯著性差異，起到明顯的改善作用。以上所述只是用于理解本發明的方法及其核心思想，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，可以對本發明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發明權利的保護范圍。當前第1頁1 2 3