本發明涉及凝結芽孢桿菌在制備預防或治療孤獨癥制劑中的應用，具體是用凝結芽孢桿菌預防或治療孤獨癥，減少孤獨癥癥狀。
背景技術：
：孤獨癥，又稱自閉癥，是一種發育障礙類疾病，主要表現為三大類核心癥狀，即：社會交往障礙、交流障礙、興趣狹窄和刻板重復的行為方式，約3/4該癥患兒存在精神發育遲滯。其病程可持續一生，難以逆轉，且患病率逐年升高，已給家庭和社會造成巨大的經濟和社會負擔。據世衛組織統計，中國大陸的孤獨癥兒童數量約為60-180萬人，有學者則認為實際數量可能達到260-800萬人。孤獨癥已經成為兒童精神類致殘的重要疾病，隨著發病率的升高，正在并將持續給家庭和社會帶來巨大的社會和經濟負擔。孤獨癥目前的治療措施主要包括行為干預和藥物干預，臨床多采用訓練行為干預與心理認知治療，同時使用藥物對伴隨的精神癥狀進行對癥治療。然而，藥物(如利培酮、阿立哌唑等)干預往往會帶來各種各樣的不良反應，影響患者治療依從性和長期維持治療。孤獨癥患者自制力偏弱，對不良反應敏感，因此藥物療效和安全性對患者治療依從性和長期維持治療尤為重要。因此，尋找能夠既安全又有效的預防或治療孤獨癥、減少孤獨癥癥狀的藥物是臨床迫切需要的。本發明人經過研究發現，凝結芽孢桿菌能夠有效預防或治療孤獨癥，安全沒有任何毒副作用，效果優于雙歧桿菌，且未見相關研究報道，特申請此發明專利。技術實現要素：本發明的目的是提供一種能預防或治療孤獨癥的制劑，該制劑由凝結芽孢桿菌制成。本發明的制劑的制備優選是通過下述步驟實施的，但不局限于此制備工藝，公知的能實現的制備工藝均可以：采取可能含凝結芽孢桿菌的樣品，然后將樣品置于滅菌瓶內，研究時從中取一定量的樣品加入18mL滅菌的稀釋液中，充分混勻，在無菌操作臺內，進行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7梯度稀釋，取10-5、10-6、10-7三個稀釋梯度，分別涂布于凝結芽孢桿菌選擇性單菌落分離固體培養基上，置于培養箱，37℃下培養48小時，選擇長勢良好的單菌落分別接種于液體擴增培養基中，置于培養箱內，37℃下擴增培養48小時。將所得培養液離心(12000rpm)分離出菌體后，將菌體冷凍真空干燥，調制出干燥菌粉，然后根據《伯杰細菌鑒定手冊》、相關細菌鑒定文獻或16SrRNA序列對比分析進行凝結芽孢桿菌鑒定和毒性試驗，將無毒性的凝結芽孢桿菌干燥菌粉按需要比例添加輔料制成片劑、膠囊、散劑、粉劑或液體制劑等各種劑型，也可加入其他活菌或低聚果糖等低聚糖起到協同作用。凝結芽孢桿菌選擇性單菌落分離固體培養基優選但不局限于：純化水1000mL，蛋白胨10g，牛肉浸取物10g，檸檬酸二銨2g，乙酸鈉5g，酵母粉5g，葡萄糖5g，磷酸二氫鉀2g，吐溫801.0ml，碳酸鈣20g，硫酸鎂0.58g，硫酸錳0.25g，瓊脂15g，調pH6.2-6.5，115℃高壓滅菌20min。凝結芽孢桿菌液體擴增培養基優選但不局限于：純化水1000mL，蛋白胨10g，牛肉浸取物3g，氯化鈉5g，葡萄糖5g，調pH7，115℃高壓滅菌20min。為進一步具體說明本發明，發明人利用上述方法通過凝結芽孢桿菌選擇性單菌落分離固體培養基分離鑒定出了無毒性的凝結芽孢桿菌，本發明所述凝結芽孢桿菌并不局限于為說明本發明所述的菌，只要無毒性的凝結芽孢桿菌均是本發明所述，均在本發明的保護范圍內。本發明所述凝結芽孢桿菌優選但不限于凝結芽孢桿菌TBC169保藏編號CGMCC1207或凝結芽孢桿菌保藏編號CGMCC1.2407。本發明實施說明中優選使用的凝結芽孢桿菌的細菌學性質：1、為說明本發明，本發明利用上述方法分離的凝結芽孢桿菌為凝結芽孢桿菌TBC169保藏編號CGMCC1207。2、菌落形態顯微鏡觀察：桿狀，革蘭氏染色陽性。平板形態：菌落呈白色、圓形、邊緣整齊、大小2-3mm。3、生理生化鑒定明膠液化：－；過氧化氫酶：+；VP試驗：+；苯丙氨酸脫氨酶試驗－。4、糖酵解實驗鑒定葡萄糖：+；麥芽糖：+；蔗糖：+；木糖：－；果糖：+；鼠李糖：－；乳糖：+；菊粉：+；半乳糖：+；糊精：+。5、分離的菌進行16SrRNA基因測序，測得序列用BLAST與GenBank和RDP數據庫中的基因序列進行相似性分析，確定分離的菌為凝結芽孢桿菌。本發明所述的凝結芽孢桿菌指活的生物個體。本發明是以有效劑量按上述方法分離的凝結芽孢桿菌作為主要活性成份，按照一定的制劑工藝，加入常規的賦形劑、調味劑、崩解劑、防腐劑、潤滑劑、濕潤劑、黏合劑、溶劑、增稠劑、增溶劑等輔料，制成任何一種適合于使用的劑型，如片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、液體制劑、粉劑等劑型。本發明所述凝結芽孢桿菌作為主要藥物活性成份制成活菌制劑。本發明所指有效劑量是指按上述方法分離的凝結芽孢桿菌根據上面所述單獨或組合作為主要藥物活性成份制成的固體活菌制劑包含的總活菌數不能低于1×106CFU/g，一般在1×107CFU/g以上，最高可達到1×1012CFU/g或1×1012CFU/g以上。本發明所指有效劑量是指按上述方法分離的凝結芽孢桿菌根據上面所述單獨或組合作為主要藥物活性成份制成的液體活菌制劑包含的總活菌數不能低于1×106CFU/mL，一般在1×107CFU/mL以上，最高可達到1×1012CFU/mL或1×1012CFU/mL以上。本發明所述制劑包括凝結芽孢桿菌單獨應用或與其他藥物聯合應用，尤其包括凝結芽孢桿菌單獨應用或與雙歧桿菌聯合應用。本發明所述雙歧桿菌指活的生物個體。本發明所述雙歧桿菌聯合應用的制劑中，固體制劑包含的雙歧桿菌總活菌數不低于1×106CFU/g，一般在1×107CFU/g以上，最高可達到1×1012CFU/g或1×1012CFU/g以上；或液體制劑包含的雙歧桿菌總活菌數不低于1×106CFU/mL，一般在1×107CFU/mL以上，最高可達到1×1012CFU/mL或1×1012CFU/mL以上。由于本發明首次公開了凝結芽孢桿菌作為主要活性成份制成制劑在預防或治療孤獨癥中的應用，因此含上述凝結芽孢桿菌的制劑在預防或治療孤獨癥制劑中的應用均屬于本發明的保護范圍。本發明所述的凝結芽孢桿菌在制成任何一種劑型時，均具有預防或治療孤獨癥的作用。如果其組份中含有凝結芽孢桿菌成份制備成制劑，在其包裝或說明書等標識上或者在其他任何宣傳品上只要注明或提示具有預防或治療孤獨癥的作用，則落入本發明的保護范圍之內。本發明所述的凝結芽孢桿菌可以制成藥品、保健食品、食品或飲品等。具體實施方式制備例說明：上述已經對凝結芽孢桿菌制劑的制備進行說明，這里通過凝結芽孢桿菌TBC169保藏編號CGMCC1207或凝結芽孢桿菌保藏編號CGMCC1.2407(凝結芽孢桿菌保藏編號CGMCC1.2407購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心)為例進行具體說明，其他凝結芽孢桿菌菌種制劑的制備方法本領域技術人員通過本實施例很容易掌握，其他劑型的制備方法本領域技術人員通過本實施很容易掌握，在此不再一一敘述說明。制備方法并不局限于本發明實施例所述，公知的能夠達到制備目的的方法均可以，實施例的制備說明只是對本發明的說明，并不是對本發明保護范圍的限制。制備實施例1凝結芽孢桿菌粉劑的制備1菌粉的制備和菌種的鑒定采取人的糞便、土壤、草垛底物等樣品，然后將樣品置于滅菌瓶內，從中取2克樣品加入18mL滅菌的稀釋液中，充分混勻，在無菌操作臺內，進行10-1、10-2、10-3、10-4，10-5，10-6，10-7梯度稀釋，取10-5，10-6，10-7三個稀釋梯度，涂布于凝結芽孢桿菌選擇性單菌落分離固體培養基上，置于培養箱，37℃下培養48小時，選擇長勢良好的單菌落接種到凝結芽孢桿菌液體擴增培養基中，37℃下擴增培養48小時。將所得培養液離心(12000rpm)分離出菌體后，將菌體冷凍真空干燥，調制出干燥菌粉，活菌數均為1×109CFU/g以上，然后進行菌種鑒定，經生理生化和16SrRNA序列對比分析鑒定為凝結芽孢桿菌，為凝結芽孢桿菌TBC169保藏編號CGMCC1207。凝結芽孢桿菌保藏編號CGMCC1.2407菌粉制備，將凝結芽孢桿菌保藏編號CGMCC1.2407接種到凝結芽孢桿菌液體擴增培養基中，37℃下擴增培養48小時。將所得培養液離心(12000rpm)分離出菌體后，將菌體冷凍真空干燥，調制出干燥菌粉，活菌數均為1×109CFU/g以上。2毒性試驗2.1動物及分組取30只SPF級別小鼠，6-8周齡，體重14-18g，隨機分凝結芽孢桿菌CGMCC1207組、凝結芽孢桿菌CGMCC1.2407組和未給藥組，每組10只。2.2制備菌液將上述不同的凝結芽孢桿菌菌粉分別用純化水調制為含菌數均為1×109CFU/mL的菌液。2.3方法各凝結芽孢桿菌組和未給藥組均給予相同的基礎飼料，且飼養條件均一致，各凝結芽孢桿菌組每天灌服凝結芽孢桿菌菌液0.5mL，未給藥組每天灌服純化水0.5mL，飼喂14天，觀察體重及毒性反應。2.4結果各組小鼠均未出現異常情況，未發生振顫、痙攣、運動失調、姿態異常，無眼球突出，排尿正常，皮膚、呼吸正常，無死亡情況，未見中毒反應。3制備成粉劑等劑型根據上述步驟和方法分離鑒定后，經實驗檢驗無毒性，就可將凝結芽孢桿菌菌種制成菌粉，然后按照需要添加相關輔料制成各種劑型，優選據凝結芽孢桿菌菌粉的活菌數，按比例添加淀粉制成粉劑，使活菌數不低于1×107CFU/g，然后裝袋。應用效果實施例說明：本發明以凝結芽孢桿菌TBC169保藏編號CGMCC1207或凝結芽孢桿菌保藏編號CGMCC1.2407為代表說明凝結芽孢桿菌的應用效果。本發明中使用的雙歧桿菌來自于市場銷售產品，公眾能夠購買到的雙歧桿菌活菌均可。應用效果實施例1：凝結芽孢桿菌在治療孤獨癥中的應用1模型組制備：1.1實驗動物選用成年Wistar大鼠(購自維通利華實驗動物中心)：成年SPF級Wistar雌性大鼠(體質量200-250g)30只，雄性大鼠(體質量300-350g)30只。雌、雄大鼠合籠后產下的子代雄性大鼠(出生后35d，體質量80-100g)50只。1.2制備方式參照Schneider等的方法，將雌、雄大鼠合籠過夜，次日早晨對雌鼠進行陰道涂片檢查，發現陰栓者記為妊娠第1天，并將孕母鼠單獨飼養。孕母鼠按模型組:對照組＝4:1的數量進行隨機分組，并在第12.5天時，模型組孕鼠按600mg/kg劑量腹腔一次性注射丙戊酸鈉(VPA)，對照組孕鼠腹腔注射等量的生理鹽水。模型組孕鼠產下的幼鼠即為孤獨癥模型組，而對照組孕鼠產下的幼鼠即為對照組。幼鼠出生后第1天記為P1。建立大鼠孤獨癥模型。1.3模型組制備結果造模成功。2藥物治療實驗：2.1實驗方法隨機選取35日齡(P35)孤獨癥仔鼠40只、對照組仔鼠10只。其中對照組仔鼠為正常對照組(n＝10)，將孤獨癥組仔鼠隨機分為凝結芽孢桿菌CGMCC1207組、凝結芽孢桿菌CGMCC1.2407組、雙歧桿菌組、模型對照組4組(n＝10)。各治療組和對照組均給予相同的基礎飼料，且飼養條件均一致，各凝結芽孢桿菌組和雙歧桿菌組使用含菌數為1×106CFU/mL(用0.9％生理鹽水調制菌粉)的菌液灌服0.5mL，模型對照組和對照組組每天灌服0.9％生理鹽水0.5mL，連續2周。觀察凝結芽孢桿菌對孤獨癥大鼠行為學的影響，并與雙歧桿菌進行比較。2.2行為學評估對實驗鼠進行行為學評估，包括社會交往行為檢測(社會行為潛伏期、持續時間、次數)、重復行為檢測(理毛累計時間)和學習記憶測試(Moirrs水迷宮測試)。選取與檢測小鼠出生時間相同、體質量差別小于15g、分籠飼養的雄鼠作為陌生鼠輔助進行社會交往行為檢測。數據使用SPSS21.0進行統計學分析。3結果3.1社會交往行為評估與對照組相比較，孤獨癥模型大鼠社交行為次數減少(P＜0.01)，社交潛伏期增加(P＜0.01)，社交行為持續時間減少(P＜0.01)，差別有統計學意義。與孤獨癥模型大鼠相比，凝結芽孢桿菌CGMCC1207和CGMCC1.2407治療后，大鼠社交行為次數增加(P＜0.05)，社交行為出現持續時間增加(P＜0.05)，社交潛伏期降低(P＜0.05)，差異具有統計學意義。與雙歧桿菌治療組大鼠相比，凝結芽孢桿菌CGMCC1207和CGMCC1.2407組大鼠社交行為次數增加(P﹤0.05)，社會行為潛伏期降低(P＜0.05)，社會行為持續時間增加(P＜0.05)，差異具有統計學意義。凝結芽孢桿菌CGMCC1207組和CGMCC1.2407組之間，大鼠社交行為次數、社交行為出現持續時間、社交潛伏期無統計學差異(P＞0.05)。凝結芽孢桿菌對孤獨癥大鼠的社交行為有顯著改善作用，并顯著高于雙歧桿菌治療組。見表1。表1不同組別大鼠社會交往行為變化統計分析組別例數行為出現次數(次)行為潛伏期(s)行為出現持續時間(s)正常對照組1028.03±3.4717.93±2.2388.68±7.98模型對照組1018.77±2.1632.18±3.4470.62±6.23雙歧桿菌組1021.39±2.5025.85±3.3673.46±4.02凝結芽孢桿菌CGMCC1207組1026.55±2.3120.21±2.6682.66±3.38凝結芽孢桿菌CGMCC1.2407組1026.83±2.7919.87±2.5682.13±4.053.2重復行為評估與對照組相比較，孤獨癥模型大鼠理毛累積時間增加(P＜0.01)，差異有統計學意義；與孤獨癥模型大鼠相比，凝結芽孢桿菌CGMCC1207和CGMCC1.2407治療后，大鼠理毛累積時間縮短(P＜0.05)，差異有統計學意義；與雙歧桿菌組大鼠相比，凝結芽孢桿菌CGMCC1207和CGMCC1.2407組大鼠理毛累積時間均縮短(P＜0.05)，差異有統計學意義；凝結芽孢桿菌CGMCC1207組和CGMCC1.2407組之間，大鼠理毛累積時間無統計學差異(P＞0.05)。凝結芽孢桿菌能顯著減少孤獨癥大鼠的重復行為，其效果顯著高于雙歧桿菌。見表2。表2不同組別大鼠重復行為變化統計分析組別例數理毛累計時間(s)正常對照組1067.83±11.20模型對照組10196.36±24.63雙歧桿菌組10159.30±19.31凝結芽孢桿菌CGMCC1207組10126.98±19.76凝結芽孢桿菌CGMCC1.2407組10127.82±21.683.3學習記憶能力評估與對照組相比較，孤獨癥模型大鼠學習記憶能力差(P＜0.01)，差異有統計學意義；與孤獨癥模型大鼠相比，凝結芽孢桿菌CGMCC1207和CGMCC1.2407治療后，大鼠學習記憶能力提高(P＜0.05)，差異有統計學意義；與雙歧桿菌組大鼠相比，凝結芽孢桿菌CGMCC1207和CGMCC1.2407組大鼠學習記憶能力提高(P＜0.05)，差異有統計學意義；凝結芽孢桿菌CGMCC1207組和CGMCC1.2407之間，大鼠學習記憶能力無統計學差異(P＞0.05)。凝結芽孢桿菌能顯著提高孤獨癥大鼠的學習記憶能力，其效果顯著高于雙歧桿菌。見表3。表3不同組別大鼠學習記憶能力統計分析組別例數學習記憶能力(s)正常對照組1022.60±9.62模型對照組1043.35±15.55雙歧桿菌組1037.12±13.97凝結芽孢桿菌CGMCC1207組1024.71±12.53凝結芽孢桿菌CGMCC1.2407組1024.99±11.734討論孤獨癥模型組和正常對照組相比大鼠的社交行為顯著減少，重復行為顯著增加，學習記憶能力差，而經凝結芽孢桿菌治療后，社交行為次數增加(P＜0.05)，社交潛伏期降低(P＜0.05)，理毛行為累積時間減少(P＜0.05)，學習記憶能力提高(P＜0.05)，且療效顯著好于雙歧桿菌治療組。表明凝結芽孢桿菌干預能顯著減少孤獨癥大鼠的孤獨癥癥狀。凝結芽孢桿菌制劑能夠有效預防或治療孤獨癥，明顯減少孤獨癥狀，且無任何毒副作用，應用依從性好，是預防或治療孤獨癥的新方法、新突破。本發明在實施過程中所使用的微生物菌種已于2004年8月23日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所郵編100101)保藏。分類命名：凝結芽孢桿菌bacilluscoagulans,保藏編號1207。凝結芽孢桿菌TBC169保藏編號CGMCC1207由本發明申請單位自行分離獲得，已在商業渠道銷售，并且已經授權專利保護(專利號200410098660.4)，按照專利審查指南的規定，公眾能夠從商業渠道買到或已經授權，不用保藏，即不用提供保藏證明，因此，本發明未提供凝結芽孢桿菌TBC169保藏編號CGMCC1207保藏證明。凝結芽孢桿菌CGMCC1.2407購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。當前第1頁1 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