一種復合疫苗佐劑及其應用的制作方法
本發明涉及免疫學技術領域，具體涉及一種復合疫苗佐劑及其在免疫治療及預防領域的用途。
背景技術：
佐劑是非特異性的免疫調節劑，在疫苗中添加佐劑，可起到提高免疫反應強度、改變免疫反應類型、延長免疫反應持續時間等多種作用。特別是對免疫原性較弱的疫苗(如滅活疫苗、亞單位疫苗、重組蛋白疫苗、多肽疫苗等)，合理的應用佐劑可提高疫苗在不同免疫背景人群中接種的陽轉率。此外，添加佐劑還可降低疫苗中抗原的用量，減少疫苗針次，有助于降低疫苗成本及解決疫情爆發時的產能問題。
早期的佐劑研究主要基于經驗，由于缺乏技術及免疫機制研究的支持，佐劑的研發相對滯后于疫苗研發。自鋁佐劑首次應用于人體，有近70年的時間，它是唯一的人用佐劑(o'hagandt等人.expertrevvaccines2013jan；12(1):13-30)。雖然鋁佐劑成本低、安全性好，但該類佐劑主要活化th2類免疫反應，對細胞免疫沒有強化作用，且在許多人用疫苗(尤其是重組蛋白疫苗和多肽疫苗)中沒有明顯的強化免疫反應的效果。因此，隨著越來越多候選疫苗的涌現及疫苗經濟效益的凸顯，對臨床上可用的新型佐劑的需求正在快速增長。
乳劑型佐劑(包括水包油乳劑、油包水乳劑等)是新型佐劑的一個重要分支，動物實驗顯示，乳劑可聯合多種弱抗原使用(重組蛋白、多肽等)，并誘發高滴度的抗原特異性抗體。油相成分、水相成分及乳化劑是乳劑的三大要素，這三個要素的選擇和配比決定了乳劑的安全性、穩定性及免疫刺激活性。油包水乳劑以油相成分為主，乳化后黏度大，在體內擴散較慢，對抗原的緩釋作用強，但局部刺激性和副反應較大，因此限制了其在人體的應用。而水包油乳劑以水相成分為主，人體耐受性較高，且與多數疫苗抗原的相容性較好。由于礦物油等不可代謝的油類成分可造成局部機體損傷，引起注射部位的毒副反應，因此人用佐劑研發時通常選擇可代謝的植物油、動物油等(如花生油、角鯊烯等)。乳劑中常用的乳化劑多為安全性好的非離子型乳化劑。乳化劑的選擇通常依據其親水親油平衡值(hlb值)，一般而言，hlb值越低表示乳化劑親水性越弱，親油性越強，傾向于形成w/o型乳狀液；反之，hlb值越高，說明乳化劑的親水性越強，親油性越弱，傾向于形成o/w型乳狀液。值得注意的是，hlb值只能確定所形成的乳狀液類型，但由于乳化劑結構、分子大小和用量等其他參數的差異，相同hlb值的乳化劑乳化性能也不盡相同。研究發現，不同hlb值的乳化劑混合使用可以形成穩定的界面，防止顆粒凝集(boydj等人.jcolloidinterafeesci,1972,41:359-370)，因此，疫苗佐劑中常使用兩種及以上的乳化劑進行配比。不同的油相成分、水相成分及乳化劑混合后，各種成分的相互作用方式復雜多樣，因此，采用不同配方制備的乳劑，其佐劑活性是難以預測的。
目前已獲批上市的水包油乳劑佐劑有3種，分別是mf59、as03及af03，包含的油相成分均為角鯊烯。其中，mf59獲批最早、應用范圍最廣。mf59的乳化劑為tween-80及span-85，均為人體可降解的表面活性劑，與角鯊烯及緩沖液混合，充分乳化后形成的水包油乳液中包含直徑約160nm的液滴(o'hagandt等人.expertrevvaccines2013jan；12(1):13-30)。以mf59為佐劑的流感疫苗
除了乳劑型佐劑之外，具有免疫刺激活性的分子也是新型佐劑的發展方向之一。特別是pam3cys、polyic、mpl、咪喹莫特(imiquimod)、cpgodn等tlr刺激劑，聯合多種疫苗使用進入了臨床試驗(steinhagenf等人.vaccine2011apr12；29(17):3341-55)。這類佐劑通常活化th1主導的免疫反應。其中polyic是人工合成的雙鏈rna，免疫后可同時活化體液免疫及細胞免疫反應，其已知受體為tlr3和mda-5(yoshidai等人.microbiolimmunol2013may；57(5):329-33)。tlr3在mdc、t細胞等免疫細胞以及成纖維細胞等非免疫細胞均有表達，是目前已知的唯一不依賴myd88的tlr，活化后可引起i型ifn分泌，從而介導dc細胞共刺激分子及mhcii分子表達上調(o'neillla等人.natrevimmunol2007may；7(5):353-64)。mda-5可識別細胞質中的dsrna，polyic與mda-5結合后，下游通過ips-1/fadd/tbk1通路也可刺激i型ifn的釋放。由于polyic具有很強的促細胞免疫反應作用，它在抗病毒及抗腫瘤治療領域均有很好的應用前景，目前已作為惡性膠質瘤、皮膚癌、卵巢癌等腫瘤的治療性疫苗佐劑進入臨床試驗(ammir等人.pharmacolther2015feb；146:120-31)。在我國，以polyic為主要成分的聚肌胞注射液已在臨床上用于治療帶狀皰疹等病毒感染相關疾病。此外，含pika佐劑(主要成分為polyic)的狂犬病疫苗已在新加坡進行了i期臨床試驗，結果顯示該佐劑具有很好的安全性，且含pika佐劑的疫苗免疫活性優于無佐劑的對照疫苗(wijayal等人.vaccine2017jan；35:1175–1183)。
由于目前已知的乳劑型佐劑與tlr刺激劑活化免疫反應的機制存在明顯差異，活化的免疫反應類型也不相同，將二者聯合使用，可望通過協同作用更為全面地活化免疫反應。將安全性好的乳劑與免疫刺激活性強的tlr刺激劑混合使用，亦可望減少后者的用量，將免疫反應的強度控制在一定范圍內，兼顧安全性和有效性。但不同機制的佐劑混合應用，是否具有互補性，其安全性和佐劑活性會發生何種變化，各種佐劑組分以何種比例配制可在確保安全性的前提下最大化免疫刺激活性，這些問題均無法預測，需要實驗驗證。因此，發明人將本發明所述的水包油乳劑與tlr刺激劑，特別是mf59與polyic及各種穩定劑，按一定比例混合后，與不同類型的疫苗聯合免疫，發現兩種類型的佐劑優勢互補，不僅提高了抗原特異性的抗體水平，還有效地活化了特異性的細胞免疫反應，且在動物實驗中表現出了很好的耐受性。因此，采用這種策略獲得的新佐劑具有很好的應用前景，可望同時應用于預防性疫苗及治療性疫苗領域。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種新的安全性及免疫刺激活性好、具有人體應用前景的復合佐劑，以及包含該復合佐劑的免疫組合物，并研究該復合佐劑及免疫組合物在免疫治療及預防領域的用途。
本發明人經研究出人意料地發現，采用恰當的配伍方式將水包油乳劑、tlr刺激劑及穩定劑進行組合，構成的復合佐劑具有良好的安全性及更強的免疫刺激活性，且與hpvvlp疫苗、hpvl2多表位疫苗、hiv嵌合vlp疫苗及滅活狂犬疫苗等不同形式的疫苗聯合應用，均可顯著提高疫苗的免疫原性。本發明基于以上發現，現已完成，在本文實施例中提供數據。
本發明第一方面提供一種佐劑組合物，其包含水包油乳劑、tlr刺激劑及穩定劑。具體的，水包油乳劑占佐劑組合物總體積的50％-95％，tlr刺激劑的濃度為5μg/ml-1000μg/ml、人體可耐受的穩定劑濃度為1μg/ml-10mg/ml。
具體的，本發明第一方面提供的佐劑組合物中，其水包油乳劑成分主要由水相成分、油相成分及乳化劑構成，所述組分按比例混合后經超聲或高壓均質等方式恰當乳化，可形成顆粒均一穩定的乳狀懸液。
優選的，本發明所述的佐劑組合物中，其水包油乳劑包含的水相成分為人體可耐受的緩沖體系，由ph緩沖劑及離子強度調節劑構成，其ph緩沖劑選自但不限于銨鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽、硼酸、磷酸鹽、硫酸鹽、tris、琥珀酸、馬來酸、各種氨基酸等；其離子強度調節劑選自但不限于氯化鈉、氯化鉀、磷酸鈉、磷酸鉀等。特別優選的，本發明所述的佐劑組合物中，其水包油乳劑的水相成分由磷酸鹽緩沖液(pbs)構成。水相成分的ph值控制在人體可耐受的范圍內，優選的，其范圍在ph5.0-8.5，更優選的為ph6.0-8.0，特別優選的為ph6.5-7.5。
優選的，本發明所述的佐劑組合物中，其油相成分為可代謝油，選自但不限于角鯊烯、膽固醇、植物油等；特別優選的，本發明所述的復合佐劑其油相成分為角鯊烯。角鯊烯含量不超過乳劑總體積的10％(v/v)，優選的為乳劑總體積的0.25％-10％(v/v)，或者0.5％-5％(v/v)，或1％-5％(v/v)，或3％-5％(v/v)，或0.5％-1.5％(v/v)，特別優選的，其含量為5％(v/v)。
可選的，本發明所述的水包油乳劑中，還可包含各種脂溶性成分，選自但不限于母育酚(例如α-生育酚及其衍生物)、甾醇類化合物、磷脂(例如卵磷脂、腦磷脂、心磷脂)等。
優選的，本發明所述的佐劑組合物中，所述乳化劑為表面活性劑的組合物，選自但不限于pluronicl121、甘露醇一油酸、聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯(吐溫80/聚山梨酯80/tween-80)、聚氧乙烯失水山梨醇月桂酸酯(吐溫20/tween-20)、山梨醇酐三油酸酯(斯盤85/span-85)、失水山梨糖醇脂肪酸酯(斯盤80/span-80)、三甘醇單月桂基醚(布里杰30/brij30)、聚乙二醇十六烷基醚(布里杰56/brij56)、聚乙二醇辛基苯基醚(tritonx-100)等；更優選的，所述乳化劑為tween-80及span-85的組合物，且所述乳化劑含量占乳劑總體積的0.01％-10％(v/v)；優選的，所述乳化劑的含量占乳劑總體積的0.3％-3％(v/v)；特別優選的，所述乳化劑中tween-80的含量及span-85的含量均為乳劑總體積的0.5％(v/v)。
特別優選的，本發明所述的佐劑組合物中，所述水包油乳劑為mf59佐劑。
制備水包油乳劑的方法是本領域技術人員公知的(例如專利cn101522218b)。具體的，將所述油相成分、水相成分及乳劑混合后，通過多次高壓均質，直至獲得包含所需直徑油滴的均一制劑。本發明所述的水包油乳劑中，包含的油滴具有亞微米級的直徑，其平均直徑小于1μm；優選的，油滴直徑小于500nm；更優選的，小于300nm；特別優選的，其直徑范圍在140-170nm之間，或在100-140nm之間，或在50-100nm之間。
此外，本發明第一方面所述的佐劑組合物，其中tlr刺激劑選自tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9等tlr的天然或人工合成的刺激劑，具體的，所述tlr刺激劑選自但不限于pam2csk4、聚肌苷酸-聚胞苷酸(polyic)、lps衍生物、鞭毛蛋白及其突變體、咪唑喹啉及其衍生物、cpg等；優選的，所述tlr刺激劑為tlr3刺激劑；更優選的，所述tlr刺激劑為聚核苷酸組合物；特別優選的，所述tlr刺激劑為polyic。本發明所述的polyic為異質性的聚核苷酸混合物，其分子量在66,000至1200,000道爾頓之間，優選的所述polyic的分子量在66,000至990,000道爾頓之間，特別優選的，其分子量在66,000至660,000道爾頓之間，在相關實施例中，使用的polyic均具有該分子量。
本發明第一方面所述的佐劑組合物還包含人體可耐受的穩定劑，所述穩定劑具有與tlr刺激劑結合、降低其毒性并延長其半衰期的作用，因此可進一步增強佐劑的免疫刺激活性。
優選的，所述穩定劑包含選自但不限于帶有鈣、鎘、鋰、鎂、鈰、銫、鎘、鈷、氘、鎵、碘、鐵或鋅等陽離子的化合物且所述陽離子化合物呈無機鹽或有機復合物的形式；更優選的，所述穩定劑選自但不限于氯化鈣、碳酸鈣、氟化鈣、磷酸鈣、硫酸鈣或葡萄糖酸鈣等鈣離子化合物；特別優選的，所述穩定劑包含氯化鈣。
可選的，本發明所述穩定劑還包含人體可耐受的抗生素，例如但不限于泰百霉素、蒽環霉素、硫酸丁酰苷菌素、慶大霉素、潮霉素、丁胺卡那霉素、雙去氧卡那霉素、暗霉素、美它酰胺、新霉素、嘌呤霉素、鏈霉素或鏈脲霉素等抗生素；優選的，本發明所述穩定劑包含氨基類抗生素；更優選的，本發明所述穩定劑包含卡那霉素。
特別優選的，本發明第一方面所述的佐劑組合物中，包含的tlr刺激劑及人體可耐受的穩定劑的組合物為pika佐劑，具體的，其成分包含polyic、氯化鈣和卡那霉素。
可選的，本發明所述穩定劑還包含非抗生素類多氨基多羥基化合物，這些多氨基多羥基化合物應具有良好的人體耐受性，與疫苗及佐劑聯合使用時不會增加不良反應；優選的，本發明所述的多氨基多羥基化合物是人體可代謝的化合物或人體可合成的化合物及其前體，例如但不限于水溶性殼聚糖、低聚殼聚糖、n-乙酰葡萄糖胺、糖胺聚糖(粘多糖)等。
特別優選的，本發明第一方面所述的佐劑組合物中，包含的tlr刺激劑及人體可耐受的穩定劑的組合物成分包含polyic、氯化鈣和低聚殼聚糖。
特別優選的，本發明第一方面所述的佐劑組合物中，包含的tlr刺激劑及人體可耐受的穩定劑的組合物成分包含polyic、氯化鈣和n-乙酰葡萄糖胺。
特別優選的，本發明第一方面所述的佐劑組合物中，包含的tlr刺激劑及人體可耐受的穩定劑的組合物成分包含polyic、氯化鈣和透明質酸。
特別優選的，本發明第一方面所述的佐劑組合物中，包含的多氨基多羥基化合物的含量應當可結合大部分的tlr刺激劑polyic，在佐劑組合物中，polyic與多氨基多羥基化合物的質量比介于1:10到10:1之間；優選的，其質量比介于1:4到4:1之間；特別優選的，其質量比介于1:2到2:1之間。
特別優選的，本發明第一方面所述的佐劑組合物中，氯化鈣的濃度介于0.1mmol/l到100mmol/l之間。
本發明第一方面所述的佐劑組合物中，其油相成分與tlr刺激劑具有限定的組成比例，以確保佐劑組合物的安全性及免疫刺激活性。在不同的實施方案中，佐劑組合物中的角鯊烯及polyic的質量比介于1:10至15:之間；優選的，其質量比介于1:5至12:1之間；特別優選的，其質量比介于2:1至5:1之間。優選的，其中polyic的濃度介于5μg/ml至1000μg/ml之間。
在特定實施例中，角鯊烯及polyic的質量比可為0.23:1、0.47:1、2.33:1、4.65:1、5.81:1或11.63:1，不同質量比的佐劑組合物強化體液免疫反應及細胞免疫反應的能力存在一定差異，但均可顯著提高疫苗誘發的免疫反應水平。
本發明另一方面提供一種免疫組合物，其成分由本發明第一方面所述的佐劑組合物及不同形式的抗原組成。其中，所述抗原可選自但不限于來源于細菌、病毒、寄生蟲、真菌、腫瘤、人體自身抗原和/或變態反應原等的抗原，且所述免疫組合物中抗原的數量可為一種或多種。
優選的，所述免疫組合物的抗原來源于病原微生物的抗原，可選自但不限于腺病毒(adeniviridae)、沙粒病毒(arenaviridae)、星狀病毒(astroviridae)、本揚病毒(bunyaviridae)、杯狀病毒(cliciviridae)、黃病毒(flaviviridae)、肝炎病毒(hepeviridae)、單分子負鏈rna病毒(mononegavirales)、巢病毒(nidovirales)、小rna病毒(piconaviridae)、正黏液病毒(orthomyxoviridae)、乳頭瘤病毒(papillomaviridae)、細小病毒(parvoviridae)、多瘤病毒(polyomaviridae)、痘病毒(poxviridae)、呼腸孤病毒(reoviridae)、反轉錄病毒(retroviridae)、披膜病毒(togaviridae)、放線菌(actinobacteria)、衣原體(chlymidae)、硬壁菌(firmicutes)、變形菌(proteobacteria)、螺旋體(spirochaetes)、子囊菌(ascomycota)、擔子菌(basidiomycota)、肉足鞭毛門(phylumsarcomastigophora)、頂覆門(phylumapicomplexa)、纖毛門(phylumciliophora)、扁形動物門(phylumplatyhelminthes)、線蟲門(phylumnematode)和/或節肢動物門(phylumarthropoda)等的抗原。
更優選的，所述免疫組合物的抗原為病毒抗原，可選自但不限于人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus，hpv)、狂犬病毒(rabiesvirus)、乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus)、流感病毒(influenzavirus)、脊髓灰質炎病毒(poliovirus)、人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，hiv)等病毒的不同形式抗原。
特別優選的，所述免疫組合物的抗原為滅活病毒，例如但不限于：滅活狂犬病毒、滅活流感病毒、滅活脊髓灰質炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型腦炎病毒等。
特別優選的，所述免疫組合物的抗原為病毒來源的重組蛋白抗原，例如但不限于：人乳頭瘤病毒(hpv)、乙型肝炎病毒(hbv)、腺相關病毒(aav)、噬菌體等病毒的病毒樣顆粒(vlp)和/或嵌合病毒樣顆粒(cvlp)，包含人乳頭瘤病毒主要外殼蛋白(l1)和/或次要外殼蛋白(l2)中和表位的重組蛋白抗原等。
特別地，如本發明實施方案中所述，聚肌苷酸-聚胞苷酸及穩定劑氯化鈣和卡那霉素(pika)聯合mf59佐劑構成的復合佐劑，與hpvvlp疫苗或滅活狂犬疫苗聯合使用均可有效提高疫苗的免疫活性。
特別地，如本發明實施方案中所述，聚肌苷酸-聚胞苷酸及穩定劑氯化鈣和卡那霉素(pika)聯合mf59佐劑構成的復合佐劑，與hiv/hpv嵌合vlp疫苗聯合使用可有效提高疫苗的免疫活性。
特別地，如本發明實施方案中所述，聚肌苷酸-聚胞苷酸、氯化鈣、低聚殼聚糖或n-乙酰葡萄糖胺聯合mf59佐劑構成的復合佐劑，與hpvvlp疫苗疫苗聯合使用均可有效提高疫苗的免疫活性。
本發明還涉及所述佐劑組合物及免疫組合物的用途，可應用于制備免疫治療及預防等多種用途的制劑，包括但不限于：(1)預防病原微生物感染及感染相關的各種疾病，如流感病毒、狂犬病毒、hiv、hpv等的感染及感染相關疾病；(2)腫瘤的預防及治療、(3)過敏反應等免疫相關疾病的治療。
根據本發明，所述的佐劑組合物及免疫組合物可采用多種劑型，其中乳劑成分可采用單獨分裝或與抗原及tlr刺激劑混合分裝的方式制備；乳劑采用單獨分裝形式時，抗原和/或tlr刺激劑可為溶液形式或凍干形式。
根據本發明，所述的佐劑組合物及免疫組合物可采用人體可接受的形式進行接種，接種部位包括但不限于腸道外注射給藥、肌肉注射、腹腔注射、靜脈注射、皮下注射、經呼吸道吸入、直腸給藥、陰道給藥、經鼻給藥、經口給藥、經眼給藥、局部給藥、透皮或皮內給藥等。
相關術語的說明及解釋
根據本發明，術語“佐劑”是指在臨床上可應用于人體或具有人體應用前景的具有增強免疫反應功能的物質，包括當前已獲得批準的和將來可能獲得批準的各種佐劑，例如但不限于鋁佐劑、mf59及各種形式的佐劑組合物。
根據本發明，術語“乳劑”是指由水相成分、油相成分及乳化劑按適當比例混合，經乳化后形成的非均相液體分散體系。其中水相成分包括但不限于磷酸鹽緩沖液、tris緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、hepes緩沖液等緩沖系統；油相成分為可代謝脂類，包括但不限于植物油、魚油、動物油、合成油及其他脂類成分(例如但不限于角鯊烯、花生油、亞麻油、磷脂等)；乳化劑為具有適宜hlb的表面活性劑，例如但不限于山梨醇酐三油酸酯(span-85)、聚山梨酯80(tween-80)、失水山梨糖醇脂肪酸酯(斯盤80/span-80)、三甘醇單月桂基醚(布里杰30/brij30)、聚乙二醇十六烷基醚(布里杰56/brij56)、聚乙二醇辛基苯基醚(tritonx-100)等。
根據本發明，術語“可代謝油”是指能夠通過機體代謝被轉化的油類物質，所述油可以是任意植物油、動物油或者合成油，它們對接受免疫者是無毒的，可通過代謝被轉化。堅果、種子和谷物是常見的植物油來源；合成油也是本發明的一部分，包括可商品化供應的各種油類。本發明特別提出的油相成分是角鯊烯，為膽固醇生物合成的中間體，也是一種可代謝油。
根據本發明，術語“v/v”是指溶液各組分的體積/體積比，可通過下列換算比將v/v表示的濃度換算成w/v(質量/體積比)表示的濃度：5％(v/v)角鯊烯濃度等同于4.3％(w/v)角鯊烯濃度；0.5％(v/v)tween-80濃度等同于0.53％(w/v)tween-80濃度。
根據本發明，術語“道爾頓”為國際通用原子質量單位，可通過下列比例將道爾頓表示的核酸分子量換算成bp表示的核酸分子量：長度為1bp的核酸分子量等同于660道爾頓。
根據本發明，術語“穩定劑”是指可與佐劑成分結合并起到穩定作用的成分，包括但不限于抗生素(例如但不限于卡那霉素、新霉素、慶大霉素)、多氨基多羥基化合物(例如但不限于殼聚糖、粘多糖等)、無機鹽(例如但不限于氯化鈣、氯化鎂、磷酸鈣)、陽離子的有機復合物(例如但不限于硬脂酸鈣、葡萄糖酸鈣)。
根據本發明，術語“抗原”是指在適當情形下被免疫系統所識別的各種物質，可來源于病原體、人體自身、腫瘤等。
附圖說明
圖1顯示本發明實施例復合佐劑中使用的polyic的相對分子量。
圖2顯示了本發明實施例2中，復合佐劑聯合滅活狂犬疫苗免疫誘發的血清特異性igg水平。結果顯示，不同劑量的復合佐劑組均可顯著提高疫苗誘發的特異性igg水平。***：與無佐劑組相比，p<0.001；#：與單純pika組相比，p<0.05；##：與單純pika組相比，p<0.01；###：與單純pika組相比，p<0.001。
圖3a至圖3b顯示了本發明實施例3中，采用elispot法檢測復合佐劑聯合滅活狂犬疫苗免疫誘發的特異性細胞免疫反應水平，結果顯示，不同劑量的復合佐劑均可顯著提高疫苗誘發細胞免疫反應的水平。*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.001。
圖3a顯示各組分泌ifn-γ的脾細胞數；圖3b顯示各組分泌il-4的脾細胞數。
圖4顯示了本發明實施例4中，復合佐劑聯合hpvvlp疫苗免疫誘發的血清型別特異性中和抗體水平。**：與無佐劑組相比，與p<0.01；***：與無佐劑組相比，與p<0.001；#：與單純pika組相比，與p<0.05；###：與單純pika組相比，與p<0.001；&&&：與單純alum組相比，與p<0.001。
圖5顯示了本發明實施例5中，復合佐劑聯合hpv16l2多表位抗原誘發的血清hpv16型中和抗體水平。***：p<0.001；nd：未檢測到中和抗體。
圖6顯示了本發明實施例6中，復合佐劑聯合hpv16l2多表位抗原誘發的血清hpv16型中和抗體水平。*：與無佐劑組相比，p<0.05；**：與無佐劑組相比，p<0.01；***：與無佐劑組相比，p<0.001；###：與單純polyic組相比，與p<0.001；&&&：與單純mf59組相比，與p<0.001。
具體實施方式
下面將通過非限制性實施例進一步說明本發明，本領域技術人員公知，在不背離本發明精神的情況下，可以對本發明做出許多修改，這樣的修改也落入本發明的范圍。下面的實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍，因為實施方案必然是多樣的。本說明書中使用的用語僅是為了闡述特定的實施方案，而非作為限制，本發明的范圍已界定在所附的權利要求中。
除非特別說明，本說明書中所使用的所有技術和科學用語均和本案所屬技術領域的技術人員所普遍明了的意義相同。下面就本發明的優選方法和材料加以敘述，但是與本說明書中所述方法和材料類似或等效的任何方法和材料均可用以實施或測試本發明。下述實驗方法如無特別說明，均為常規方法或產品說明書所描述的方法，所使用的實驗材料如無特別說明，均可容易地從商業公司獲取。本說明書中所提到的所有公開文獻均被并入于此作為參考，以揭示并說明所述公開文獻中的方法和/或材料。
實施例1：polyic與不同穩定劑組合的穩定性實驗
按照表1所示的組合方式配制polyic與不同穩定劑的組合物，并采用分光光度法測定polyic的含量，4℃保存一段時間后，測定剩余polyic的含量并計算polyic的保存度(剩余polyic含量/初始polyic含量)，結果如下表1所示：
表1：polyic與不同穩定劑的組合
*：計算polyic/穩定劑質量比時，不計氯化鈣的質量。
上述結果表明，采用低聚殼聚糖或n-乙酰葡萄糖胺均可有效穩定polyic，減少降解，配置后的佐劑組合物穩定性可維持12-18個月。
實施例2：復合佐劑聯合滅活狂犬疫苗免疫小鼠誘發抗原特異性igg檢測
取4-6周齡的balb/c小鼠，隨機分組，分別用滅活狂犬疫苗(rv，長春衛爾賽生物藥業有限公司)、mf59(5％(v/v)角鯊烯，0.5％(v/v)tween-80，0.5％span-85(v/v)，溶液為pbs)聯合rv、聚肌苷酸-聚胞苷酸注射液(pika，南國藥業)聯合rv、及mf59/pika聯合rv免疫小鼠，具體分組如表2所示。mf59與疫苗其他成分的體積比為1：1。肌肉注射，rv的免疫劑量為0.02iu，于第0，2周免疫，共2次。第2次免疫后2周尾靜脈采血，分離血清。
表2：復合佐劑聯合rv實驗小鼠分組及免疫劑量
(用于血清igg檢測)
采用滅活狂犬疫苗原液包被酶標板(100ng/孔)，4℃孵育過夜后，使用5％bsa室溫封閉2h。用pbs對小鼠免疫血清進行倍比稀釋，加入封閉后的酶標板中(100μl/孔)，室溫孵育2h。使用pbs-t(在pbs中加入0.05％tween20)洗板3次，加入pbs-t稀釋的hrp-山羊抗小鼠igg二抗(1：5000)，37℃孵育45min。使用pbs-t洗板5次，用opd底物(sigma)顯色，37℃孵育5min后，使用2mh2so4終止反應。使用酶標儀讀取各個孔的od490，讀數大于0.2且大于陰性對照2倍的最高稀釋度即為血清rv特異性igg抗體滴度。結果如圖2所示，聯合使用mf59及pika佐劑的各組血清抗體水平均顯著高于無佐劑組和單獨使用pika佐劑組，且mf59/pika-10免疫組的特異性igg水平最高。表明當polyic/角鯊烯的質量比在0.47:1至4.65:1之間時，由mf59水包油乳劑及以polyic為主要成分的pika佐劑構成的復合佐劑可顯著提高疫苗誘發體液免疫反應的水平(使用spss軟件，one-wayanova分析)，且在本實施例的劑量下，未觀察到佐劑在小鼠體內引起毒性反應。
實施例3：復合佐劑聯合滅活狂犬疫苗免疫小鼠誘發抗原特異性細胞免疫反應檢測
取4-6周齡的balb/c小鼠，隨機分組，每組5只，分別用滅活狂犬疫苗(rv，長春衛爾賽生物藥業有限公司)、mf59(5％角鯊烯，0.5％tween-80，0.5％span-85，緩沖液為pbs)聯合rv、聚肌苷酸-聚胞苷酸注射液(pika，南國藥業)聯合rv、及mf59/pika聯合rv免疫小鼠，具體分組如表3所示。mf59與疫苗其他成分的體積比為1：1。肌肉注射，rv的免疫劑量為0.02iu，于第0，2周免疫，共2次。
表3：復合佐劑聯合rv實驗小鼠分組及免疫劑量
(用于elispot檢測)
第2次免疫后13天取小鼠脾細胞，采用elispot法分別檢測抗原特異性的、分泌ifn-γ和il-4的脾細胞。刺激抗原為滅活的rv疫苗原液，濃度為4μg/ml。結果如圖3a和圖3b所示，mf59/pika-10組分泌ifn-γ和il-4的細胞數顯著高于其他各組，且mf59/pika-5組分泌ifn-γ和il-4的細胞數顯著高于無佐劑組、無抗原組和單獨mf59佐劑組，但低于mf59/pika-10組。表明當polyic/角鯊烯的質量比在2.33:1至4.65:1之間時，由mf59水包油乳劑及以polyic為主要成分的pika佐劑構成的復合佐劑可顯著提高疫苗誘發細胞免疫反應的水平(使用spss軟件，one-wayanova分析)，且在本實施例的劑量下，未觀察到佐劑在小鼠體內引起毒性反應。elispot檢測的方法是公開的，例如專利cn101166559b。
實施例4：復合佐劑聯合hpvvlp疫苗免疫小鼠誘發中和抗體水平的檢測
取4-6周齡的balb/c小鼠，隨機分組，分別用hpv16l1δn5c31vlp(獲自中國醫學科學院基礎醫學研究所許雪梅實驗室)聯合聚肌苷酸-聚胞苷酸注射液(pika，南國藥業)及氫氧化鋁佐劑(alum)或mf59佐劑(5％角鯊烯，0.5％tween-80，0.5％span-85，緩沖液為pbs)免疫小鼠，具體分組及免疫劑量如表4所示。mf59與疫苗其他成分的體積比為1：1。皮下注射，于第0，2周免疫，共2次。第2次免疫后2周尾靜脈采血，分離血清。
表4：復合佐劑聯合hpvvlp疫苗免疫實驗小鼠分組及劑量
使用hpv16假病毒對免疫血清的hpv16中和抗體滴度進行檢測，結果如圖4所示，單獨使用氫氧化鋁佐劑或pika佐劑對hpv16l1vlp誘發的中和抗體水平無明顯增強效果，但使用mf59聯合pika佐劑可顯著提高vlp誘發的中和抗體水平，且與單獨使用氫氧化鋁或單獨使用pika佐劑相比，中和抗體水平亦有明顯提高。表明當polyic/角鯊烯的質量比在0.23:1至11.63:1之間時，由mf59水包油乳劑及以polyic為主要成分的pika佐劑構成的復合佐劑可顯著提高疫苗的免疫活性(使用spss軟件，one-wayanova分析)，且在本實施例的劑量下，未觀察到佐劑在小鼠體內引起毒性反應，具有應用前景。假病毒制備及假病毒中和實驗的方法均是公開的，例如專利cn104418942a。
實施例5：復合佐劑聯合hpv16l2多表位疫苗免疫小鼠誘發中和抗體水平的檢測
取4-6周齡的hfcγri轉基因小鼠(c57bl/6背景)，隨機分組，分別用hpv16l2多表位抗原(含3個拷貝的l2aa.17-36表位及hfcγri靶向結構域)(獲自中國醫學科學院基礎醫學研究所許雪梅實驗室)聯合聚肌苷酸-聚胞苷酸注射液(pika，南國藥業)、mf59佐劑(5％角鯊烯，0.5％tween-80，0.5％span-85)免疫小鼠，具體分組及免疫劑量如表5所示。mf59與疫苗其他成分的體積比為1：1。皮下注射，于第0，2，4，6周免疫，共4次。第4次免疫后2周尾靜脈采血，分離血清。
表5：復合佐劑聯合hpv16l2多表位抗原免疫實驗小鼠分組及劑量
使用hpv16假病毒對免疫血清的hpv16中和抗體滴度進行檢測，結果如圖5所示，使用mf59聯合pika佐劑可顯著提高hpv16l2多表位抗原誘發的中和抗體水平，且與單獨使用mf59或單獨使用pika佐劑相比，中和抗體水平亦有明顯提高。表明當polyic/角鯊烯的質量比為11.63:1時，由mf59水包油乳劑及以polyic為主要成分的pika佐劑構成的復合佐劑可顯著提高疫苗的免疫活性(使用spss軟件，one-wayanova分析)，且在本實施例的劑量下，未觀察到佐劑在小鼠體內引起毒性反應，具有應用前景。假病毒制備及假病毒中和實驗的方法均是公開的，例如專利cn104418942a。
實施例6：含不同穩定劑的復合佐劑聯合hpv16l2多表位疫苗免疫小鼠誘發中和抗體水平的檢測
取4-6周齡的hfcγri轉基因小鼠(c57bl/6背景)，隨機分組，分別用hpv16l2多表位抗原(獲自中國醫學科學院基礎醫學研究所許雪梅實驗室)(含3個拷貝的l2aa.17-36表位及hfcγri靶向結構域)聯合含不同穩定劑的復合佐劑免疫小鼠，具體分組及免疫劑量如表6所示。mf59與疫苗其他成分的體積比為1：1。皮下注射，于第0，2，4，6周免疫，共4次。第4次免疫后2周尾靜脈采血，分離血清。
表6：復合佐劑聯合hpv16l2多表位抗原免疫實驗小鼠分組及劑量
使用hpv16假病毒對免疫血清的hpv16中和抗體滴度進行檢測，結果如圖6所示，使用4種配方的復合佐劑均可顯著提高hpv16l2多表位抗原誘發的中和抗體水平，且與單獨使用mf59或單獨使用polyic佐劑相比，中和抗體水平亦有明顯提高。表明由mf59水包油乳劑、polyic及多氨基多羥基穩定劑構成的復合佐劑可顯著提高疫苗的免疫活性(使用spss軟件，one-wayanova分析)，且在本實施例的劑量下，未觀察到佐劑在小鼠體內引起毒性反應，具有應用前景。假病毒制備及假病毒中和實驗的方法均是公開的，例如專利cn104418942a。
實施例7：復合佐劑聯合hpv/hiv嵌合vlp疫苗免疫小鼠誘發抗hiv中和抗體水平的檢測
取4-6周齡的balb/c小鼠，隨機分組，分別用2種以hpv16vlp為骨架嵌合hiv中和表位(2f5中和抗體表位)的嵌合vlp(獲自中國醫學科學院基礎醫學研究所許雪梅實驗室)聯合復合佐劑免疫小鼠，具體分組及免疫劑量如表7所示。mf59與疫苗其他成分的體積比為1：1。皮下注射，于第0，2，4，8周免疫，共4次。第4次免疫后2周尾靜脈采血，分離血清。
表7：復合佐劑聯合hpv/hiv嵌合vlp免疫實驗小鼠分組及劑量
使用hiv敏感株sf162假病毒對免疫血清的hiv中和抗體進行檢測，結果如表8所示，復合佐劑可顯著提高嵌合vlp疫苗誘發的針對hiv表位的中和抗體。
表8：復合佐劑聯合hpv/hiv嵌合vlp免疫誘發的hiv中和抗體水平檢測
- 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊！