一種口腔微生態制劑及其制備方法與流程

本發明屬于微生態技術領域技術領域，更具體地，涉及一種口腔微生態制劑及其制備方法。

背景技術：

抗生素的濫用導致了大量耐藥菌株的出現，乳酸菌是一類具有抗菌活性的物質，在人體的天然免疫中起著重要的作用。乳酸菌具有廣譜抗菌、抗真菌的作用，并對多種口腔細菌有抑制作用，且抗菌肽較難產生耐藥性。

齲齒和牙周炎是比較典型的由牙菌斑細菌引起的口腔疾病，主要是由變異鏈球菌(streptococcusmutans)和牙齦卟啉單胞菌(porphyromonasgingivali)引起的。關于乳酸菌對口腔疾病的研究目前尚處于初級階段，篩選或改良出對口腔疾病治療效果較好的菌株是所面臨的重大問題，要求益生菌菌株主要通過產細菌素和過氧化氫達到最終的抑菌目的。

乳酸菌細菌素是指乳酸菌在代謝過程中由核糖體合成的一類具有抑菌活性的多肽或前體多肽。它們通常不僅抑制與其親緣關系相近的乳酸菌，對非乳酸菌的g⁺菌也具有一定的抑制作用。

微生物代謝產物有細菌素和胞外多糖等，主要用于飼料行業的使用，對其深加工的技術研究還不夠多，通過將代謝產物結合活菌做成制劑達到治療護理效果最佳，以期許能夠將乳酸菌的優勢能夠發揮到最佳。現在市面上的很多活菌飲料和牙膏等產品其活菌含量不高，甚至不能在牙膏中生存乳酸菌，這大大限制了乳酸菌的開發利用，通過優化將制劑中的活菌數增加，并且適合在極端環境中生存。因此，研究和開發開菲爾微生態制劑可賦予微生態制劑新的保健功能，具有極大的發展潛力。

技術實現要素：

本發明的目的是針對現有口腔微生態制劑中活菌數不高以及微生物代謝產物不能加以利用的缺點，提供一種口腔微生態制劑。該口腔微生態制劑可替代抗生素，有效減少抗生素的使用，增強人體免疫能力，降低口腔疾病的發病率，用于維持口腔疾病正常微生態的環境。

本發明另一個目的是提供上述口腔微生態制劑的制備方法。

本發明上述目的通過以下技術方案予以實現：

一種口腔微生態制劑，所述口腔微生態制劑是先將菌株分別接種于mrs培養基培養后，經真空冷凍干燥得到相應的單菌菌粉，再將所述單菌菌粉混合成混合菌粉，并與抗菌肽粗品、胞外多糖粗品、奶粉、甜味劑和輔料混合制備而成；

所述菌株為植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)kf-18、乳酸乳球菌(lactococcuslactis)kf-20、乳酸乳球菌(lactococcuslactis)kf-22和腸膜明串球菌(leuconostocmesenteroides)kf-15；

所述植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)kf-18于2016年11月21日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為gdmcc60118；

所述乳酸乳球菌(lactococcuslactis)kf-20于2016年11月21日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為gdmcc60116。

所述乳酸乳球菌(lactococcuslactis)kf-22于2017年1月5日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為gdmcc60139。

所述腸膜明串球菌(leuconostocmesenteroides)kf-15于2017年1月5日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為gdmcc60138。

優選地，所述mrs培養基的配方為：蛋白胨10.0g、牛肉粉5.0g、酵母4.0g、葡萄糖20.0g、吐溫-801.0ml、磷酸氫二鉀2.0g、乙酸鈉5.0g、檸檬酸三銨2.0g、硫酸鎂0.2g、硫酸錳0.05g、瓊脂粉15.0g和蒸餾水1000ml；所述菌株相對于mrs培養基的接種量為1～10％。

優選地，所述混合菌粉是由植物乳桿菌kf-18、乳酸乳球菌kf-20、乳酸乳球菌kf-22、腸膜明串球菌kf-15的單菌菌粉按(1～3)：(1～3)：1：1的質量比混合；所述混合菌粉為15.4～19.48％，奶粉為61.6～77.92％，抗菌肽粗品1～8％，胞外多糖粗品1～9％，甜味劑0.5～3％，輔料0.1～3％。

植物乳桿菌kf-18、乳酸乳球菌kf-20、乳酸乳球菌kf-22和腸膜明串球菌kf-15單菌菌粉的制備包括如下步驟：

s1.將植物乳桿菌kf-18、乳酸乳球菌kf-20、乳酸乳球菌kf-22和腸膜明串球菌kf-15菌株分別進行傳代兩次進行培養活化；

s2.將植物乳桿菌kf-18、乳酸乳球菌kf-20、乳酸乳球菌kf-22和腸膜明串球菌kf-15菌株以1～10％的接種量分別用mrs培養基培養之后，加入牛奶溶液保護劑，然后經-36～-40℃，24～30h真空冷凍干燥得到相應的單菌菌粉。

所述抗菌肽粗品的制備包括如下步驟：

s11.將植物乳桿菌kf-18按1～8％的接種量接種到mrs培養基中，在35～37℃靜置培養18～24h；

s12.再將步驟s11培養的植物乳桿菌kf-18以3～5％的接種量接種到10～15％的牛奶溶液中培養18～24h得到發酵液a；

s13.將發酵液a以3500～4500rpm的轉速，4～10℃的條件下離心20～30min，取上清液b，將上清液b過1～3k的膜包，在-36～-40℃經真空冷凍干燥24～30h得到抗菌肽粗品。

所述胞外多糖粗品的制備包括如下步驟：

s21.將乳酸乳球菌kf-22按3～5％的接種量接種到mrs培養基中，35～37℃靜置培養18～24h；

s22.再將步驟s21培養的乳酸乳球菌kf-22以3～5％的接種量接種到10～15％的牛奶溶液中培養18～24h得到發酵液c；

s23.將發酵液c經煮沸10～15min，冷卻后以3500～4500rpm轉速，4～10℃的條件下離心20～30min得到上清液d；

s24.將三氯乙酸水溶液加入上清液d中，在3500～4500rpm轉速，4～10℃的條件下離心20～30min得到上清液e；然后在上清液e中加入無水乙醇靜置20～24h，再以3500～4500rpm轉速，4～10℃的條件下離心20～30min收集沉淀物；

s25.沉淀物用超純水溶解后過1～3k的的膜包，在-36～-40℃經真空冷凍干燥24～30h制得胞外多糖粗品。

優選地，步驟s24中所述三氯乙酸水溶液的濃度為50～80％，所述三氯乙酸水溶液的體積為上清液d體積的7～10％，所述無水乙醇與上清液e的體積比為(4～5)：1，步驟s25中所述超純水與步驟s22中所述發酵液c的體積相同。

優選地，所述的甜味劑為赤蘚糖醇、木糖醇或山梨醇。

優選地，所述的輔料為羧甲基纖維素鈉和硬脂酸鎂，所述羧甲基纖維素鈉和硬脂酸鎂的質量比為(1～6)：1。

上述口腔微生態制劑的制備方法，包括如下具體步驟：

s31.將植物乳桿菌kf-18、乳酸乳球菌kf-20、乳酸乳球菌kf-22、腸膜明串球菌kf-15分別優化活菌數培養后，在-36～-40℃經真空冷凍干燥24～30h得到相應的單菌菌粉，并將單菌菌粉混合；

s32.將植物乳桿菌kf-18菌株發酵產物分離純化得到抗菌肽粗品；

s33.將乳酸乳球菌kf-22發酵產物分離純化得到胞外多糖粗品；

s34.將混合的單菌菌粉、抗菌肽粗品、胞外多糖粗品、奶粉、甜味劑和輔料混合打成粉狀，用10～40目過篩后壓制成片劑，即為口腔微生態制劑。

本發明開菲爾粒是天然共生菌群，含有乳酸菌(lacticacidbacteria，lab)、醋酸菌和酵母菌，其發酵產物開菲爾被認為是高加索地區人們長壽的重要原因之一，具有抗菌和抗癌等多種功效。本發明采用高產過氧化氫的抗菌肽以及胞外多糖的乳酸菌菌株活菌及其代謝產物分離提純、甜味劑進行科學配伍，抗菌肽可以有效抑制口腔中變異鏈球菌和牙齦卟啉桿菌，同時胞外多糖可以增加產品的抗氧化能力以及抑制變異鏈球菌的生物膜生長，并且乳酸菌活菌本身作為益生菌可以粘附口腔黏膜上皮細胞，對病原菌的入侵起到阻隔作用，通過植物乳桿菌的代謝耗氧制造厭氧環境，以及胞外多糖對口腔益生菌的促生長和對病原菌的抑制作用，從而維持正常的口腔菌群平衡，對病原菌的入侵形成立體屏障，起到保護口腔微生態平衡的作用。

乳酸菌胞外多糖(exopolysaccharides，labeps)是乳酸菌在生長代謝過程中分泌到細胞壁外常滲于培養基的一類糖類化合物，具有很多的生理功能，如抗腫瘤活性、免疫調節、益生、抗氧化、抗菌和降膽固醇等其他功能，而關于抗氧化的研究逐漸增多。labeps抗氧化主要是通過是在體外實驗中對清除自由基、抑制脂質過氧化作用、抑制亞油酸氧化等指標檢測。

與其它多糖相比，labeps具有以下幾點優勢：(1)與植物多糖相比，雖然labeps的產量一般較低，但只要充分了解labeps的形成機制，進行有效的生物調控，就可以建立克隆體系，實現大量表達eps，從而簡便提取工藝，降低生產成本；(2)lab是公認的綠色安全(gras)的食品級微生物，其代謝產生的eps在安全性上更為可靠；(3)食品級的產eps乳酸菌菌株可直接以活菌的形式進入人體，除了eps的生物活性外，菌株自身還可以發揮多種生理功能，促進人體健康；(4)labeps的溶解性較好，可以經膳食進入人體，通過食物的形式發揮功效，更容易被消費者所接受。

另外，本發明的特征之一是選用赤鮮糖醇、木糖醇或山梨醇作為甜味劑適于需蔗糖口感的食品，不被酶所降解，只能透過腎(易被小腸吸收)從血液中排至尿中排出，不參與糖代謝和血糖變化，故也適宜于糖尿病患者食用。在結腸中不被腸道菌群發酵，可避免腸胃不適，且不會造成齲齒。

與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：

1.本發明口腔微生態制劑可替代抗生素，有效減少抗生素的使用，增強人體免疫能力，降低口腔疾病的發病率，用于維持口腔疾病正常微生態的環境。這是由于采用乳酸菌活菌及其代謝產物分離提純，與甜味劑進行科學配伍，抗菌肽可以有效抑制口腔中變異鏈球菌和牙齦卟啉桿菌，同時胞外多糖可以增加產品的抗氧化能力以及抑制變異鏈球菌的生物膜生長，并且乳酸菌活菌本身作為益生菌可以粘附口腔黏膜上皮細胞，對病原菌的入侵起到阻隔作用，通過植物乳桿菌的代謝耗氧制造厭氧環境和胞外多糖對口腔益生菌的促進生長作用，對病原菌的抑制和對益生菌的促進從而維持正常的口腔菌群平衡，對病原菌的入侵形成立體屏障，起到保護口腔微生態平衡的作用。

2.本發明用赤蘚糖醇、木糖醇等糖醇作為甜味劑可適于需蔗糖口感的食品，且不會造成齲齒。這是由于糖醇不易被酶降解，只能透過腎被小腸吸收，從血液中排至尿中排出，不參與糖代謝和血糖變化，故也適宜于糖尿病患者食用。在結腸中不被腸道菌群發酵，可避免腸胃不適。

3.本發明口腔微生態制劑可增加口腔中益生菌數量，增加口腔環境中抗菌肽和過氧化氫的含量達到抑制口腔不良菌株的效果，促進口腔微生態的穩定，增強口腔清潔，并且有效的控制口腔疾病的發生，可成為一種新的抗生素替代品，并為輔助治療牙周疾病等提供新方法。

附圖說明

圖1為對分離菌株基因組dna進行rep-pcr擴增得到菌種基因的組指紋圖譜。

圖2為制備微生態制劑的工藝流程圖。

圖3為本發明口腔微生態制劑對變異鏈球菌的抑菌活性圖。

圖4為葡萄糖濃度的苯酚硫酸法標準曲線。

圖5為本發明口腔微生態制劑中各菌株產胞外多糖的含量。

圖6為過氧化氫濃度的標準曲線。

圖7為本發明口腔微生態制劑對變異鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌的影響。

圖8為標準鈣濃度的標準曲線。

圖9為本發明口腔微生態制劑對變異鏈球菌降解羥基磷灰石的關系曲線。

圖10為本發明口腔微生態制劑對牙齦卟啉單胞菌降解羥基磷灰石的的關系曲線。

具體實施方式

下面結合具體實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。除非特別說明，本發明采用的試劑、方法和設備為本技術領域常規試劑、方法和設備。

實施例中所述mrs培養基的配方為：蛋白胨10.0g、牛肉粉5.0g、酵母4.0g、葡萄糖20.0g、吐溫-801.0ml、磷酸氫二鉀2.0g、乙酸鈉5.0g、檸檬酸三銨2.0g、硫酸鎂0.2g、硫酸錳0.05g、瓊脂粉15.0g和蒸餾水1000ml。

實施例1植物乳桿菌kf-18菌株的分離與鑒定

1.菌株分離

(1)植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)kf-18是從開菲爾酸奶中分離獲得。具體分離方法如下：將實驗室保存的開菲爾原液用mrs液體培養基富集乳酸菌，然后經過稀釋涂布劃線得到純化的菌株。

(2)上述分離得到菌株植物乳桿菌kf-18具有產抗菌肽，具有能夠抑制致病菌生長的特征。

2.菌株鑒定

提取上述分離的菌株的基因組dna，通過常規方法pcr擴增其序列，并測序分析，得到16srdna測序鑒定結果如seqidno：1所示，顯示其與目前已公開的開菲爾乳酸菌的菌株均不同。

同時，結合其他鑒定數據結果顯示，該菌株為植物乳桿菌種的一個新菌株，將該菌株命名為植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)kf-18，于2016年11月21日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，其保藏號為gdmcc60118。

rep-pcr指紋圖譜是一種揭示菌株和種屬遺傳差異和多樣性的分析技術。原理是利用特定的引物擴增細菌基因組的進化過程中高度保守的短重復序列，得到系列的特定譜帶，即細菌基因的指紋圖譜，對細菌進行鑒定和多態性研究。對上述分離的菌株基因組dna進行rep-pcr擴增得到植物乳桿菌kf-18菌種基因組的指紋圖譜如圖1(a)所示。其中，泳道1為box-pcr譜帶；泳道2為(gtg)5-pcr譜帶；泳道3為rep-pcr譜帶；泳道m為dnamarkeriii。從圖1(a)中可知，植物乳桿菌kf-18特有的box-pcr主條帶約4條，(gtg)5-pcr主條帶為8～10條，rep-pcr主條帶為7～10條，大小集中在0.3k～4kbp之間，由此指紋圖譜可對該植物乳桿菌kf-18進一步鑒定和多態性研究。

實施例2乳酸乳球菌kf-20菌株的分離與鑒定

1.菌株分離

(1)乳酸乳球菌(lactococcuslactis)kf-20是從開菲爾酸奶中分離獲得。具體分離方法如下：將開菲爾原液用mrs液體培養基富集乳酸菌，然后經過稀釋涂布劃線得到純化的菌株。

(2)上述分離得到乳酸乳球菌kf-20菌株具有產過氧化氫的量為3％左右的特征。

2.菌株鑒定

提取上述分離的菌株的基因組dna，通過常規方法pcr擴增其序列，并測序分析，得到16srdna測序鑒定結果如seqidno：2所示，顯示其與目前已公開的開菲爾乳酸菌的菌株均不同。

乳酸乳球菌kf-20菌株為乳酸乳球菌種的一個新菌株，將該菌株命名為乳酸乳球菌(lactococcuslactis)kf-20，于2016年11月21日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，其保藏號為gdmcc60116，地址為廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓。

對上述分離的菌株基因組dna進行rep-pcr擴增得到乳酸乳球菌kf-20菌種基因組的指紋圖譜如圖1(b)所示。其中，泳道1為box-pcr譜帶；泳道2為(gtg)5-pcr譜帶；泳道3為rep-pcr譜帶；泳道m為dnamarkeriii。從圖1(b)中可知，乳酸乳球菌kf-20特有的box-pcr主條帶約7條，(gtg)5-pcr主條帶為8～10條，rep-pcr主條帶為7～10條，大小集中在0.3k～4kbp之間，由此指紋圖譜可對該乳酸乳球菌kf-20進一步鑒定和多態性研究。

實施例3乳酸乳球菌kf-22菌株的分離與鑒定

1.菌株分離

(1)乳酸乳球菌(lactococcuslactis)kf-22是從開菲爾酸奶中分離獲得。具體分離方法如下：將開菲爾原液用mrs液體培養基富集乳酸菌，然后經過稀釋涂布劃線得到純化的菌株。

(2)上述分離得到的乳酸乳球菌kf-22菌株具有產胞外多糖的量達到特征。

2.菌株鑒定

提取上述分離的菌株的基因組dna，通過常規方法pcr擴增其序列，并測序分析，得到16srdna測序鑒定結果如seqidno：3所示，顯示其與目前已公開的開菲爾乳酸菌的菌株均不同。

乳酸乳球菌kf-22菌株為乳酸乳球菌種的一個新菌株，將該菌株命名為乳酸乳球菌lactococcuslactiskf-22，于2017年1月5日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，其保藏號為gdmcc60139，地址為廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓。

對上述分離的菌株基因組dna進行rep-pcr擴增得到乳酸乳球菌kf-22基因組的指紋圖譜如圖1(c)所示。其中，泳道1為box-pcr譜帶；泳道2為(gtg)5-pcr譜帶；泳道3為rep-pcr譜帶；泳道m為dnamarkeriii。從圖1(c)中可知，乳酸乳球菌kf-22特有的box-pcr主條帶約9條，(gtg)5-pcr主條帶為8～10條，rep-pcr主條帶為7～10條，大小集中在0.3k～4kbp之間，由此指紋圖譜可對該乳酸乳球菌kf-22進一步鑒定和多態性研究。

實施例4腸膜明串球菌kf-15菌株的分離與鑒定

1.菌株分離

腸膜明串球菌(leuconostocmesenteroides)kf-15是從開菲爾酸奶中分離獲得。具體分離方法如下：將開菲爾原液用mrs液體培養基富集乳酸菌，然后經過稀釋涂布劃線得到純化的菌株。

2.菌株鑒定

提取上述分離的菌株的基因組dna，通過常規方法pcr擴增其序列，并測序分析，得到16srdna測序鑒定結果如seqidno：4所示，顯示其與目前已公開的開菲爾乳酸菌的菌株均不同。

腸膜明串球菌kf-15菌株為乳酸乳球菌種的一個新菌株，將該菌株命名為腸膜明串球菌(leuconostocmesenteroides)kf-15，于2017年1月5日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，其保藏號為gdmcc60138，地址為廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓。

對上述分離的菌株基因組dna進行rep-pcr擴增得到腸膜明串球菌kf-15菌種基因組的指紋圖譜如圖1(d)所示。其中，泳道1為box-pcr譜帶；泳道2為(gtg)5-pcr譜帶；泳道3為rep-pcr譜帶；泳道m為dnamarkeriii。腸膜明串球菌kf-15基因指紋圖譜，泳道1為box-pcr譜帶；泳道2為(gtg)5-pcr譜帶；泳道3為rep-pcr譜帶；泳道m為dnamarkeriii。從圖1(d)中可知，腸膜明串球菌kf-15特有的box-pcr主條帶約9條，(gtg)5-pcr主條帶為8～10條，rep-pcr主條帶為7～10條，大小集中在0.3k～4kbp之間，由此指紋圖譜可對該腸膜明串球菌kf-15進一步鑒定和多態性研究。

實施例5口腔微生態制劑的制備

圖2為制備口腔微生態制劑的工藝流程圖，具體步驟如下：

1.將植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)kf-18、乳酸乳球菌(lactococcuslactissubsp)kf-20、乳酸乳球菌(lactococcuslactis)kf-22、腸膜明串球菌(leuconostocmesenteroides)kf-15復壯后，分別按4％的接種量加入mrs培養基培養，將其以3500rpm轉速，4℃的條件下離心20min得到相應的單菌菌體，然后用10％的牛奶溶液作為保護劑凍干得到單菌菌粉，將相應的單菌菌體按質量比為1:1:1:1制成混合菌粉；

2.將1％抗菌肽粗品，1％胞外多糖粗品，奶粉15.4％，菌粉77.9％，0.5％的硬脂酸鎂，3％的羧甲基纖維素鈉(cmc-na)，1.2％的赤蘚糖醇混合用藥材攪碎機處理5s，過20目篩，用壓片機制作口腔微生態制劑。

口腔微生態制劑按原料的質量百分比計為：混合菌粉為15.4～19.48％，奶粉為61.6～77.92％，抗菌肽粗品1～8％，胞外多糖粗品1～9％，甜味劑0.5～3％，輔料0.1～3％。

實施例6口腔微生態制劑的質量檢測

1.口腔微生態制劑的檢測：主要分為口腔微生態制劑的外觀和口感兩部分，檢測標準如表1。本發明制劑的外觀色澤均已為乳白色，每一片均為0.5g，無松片裂片等現象，口腔細膩，無顆粒感，甜度適中，說明制劑通過成型工藝和口感工藝的優化能使制劑的外觀更美觀，口感更細膩符合大眾口味。

表1制劑外觀檢測標準

2.片重差異的檢查方法：取口腔微生態制劑20片，精密稱定每片的片重并求得平均片重，然后以每片片重與平均片重比較，超出差異限度(±7.5％)的藥片不得多于2片，并不得有1片超出限度1倍。檢測結果：每一片均為0.5g，結果說明制劑壓片工藝優化得到片中差異很小。

3.硬度的檢查方法：取口腔微生態制劑20片從1.5m高自由下落，每片重復2到3次，該口腔微生態制劑沒有明顯碎片或斷裂，說明該口腔微生態制劑硬度合格。

4.檢測制劑的活菌數方法：取2片口腔微生態制劑稱重(約1g)粉碎，用無菌生理鹽水稀釋至10ml，再取1ml作10倍遞增稀釋，取10^-9，10^-10和10^-11三個稀釋度，分別吸取1ml注入mrs瓊脂柱中培養至少48h，計算活菌數。檢測結果為2.5×10¹¹cfu/g，說明經過優化之后制劑比市面上生產的產品中活菌數10⁶cfu/g提高了5個等級。

5.檢測口腔微生態制劑的理化指標：按gb5009的方法檢測口腔微生態制劑的理化指標，包括口腔微生態制劑中蛋白質含量、水分含量、脂肪含量以及還原糖含量等。

(1)蛋白質含量的檢測：采用凱氏定氮法測定化合物或混合物中總氮量，即在有催化劑的條件下，用濃硫酸消化樣品將有機氮都轉變成無機銨鹽，然后在堿性條件下將銨鹽轉化為氨，隨水蒸氣餾出并為過量的酸液吸收，再以標準堿滴定，就可計算出樣品中的氮量。由于蛋白質含氮量比較恒定，可由其氮量計算蛋白質含量。經檢測蛋白質含量為26.41％，高于dbs15/002-2013食品安全地方標準含乳固態成型制品中蛋白質含量6.5％，口腔微生態制劑的蛋白質含量遠高過國標中的要求，說明這對于氮的獲取是有利的。

(2)水分含量的檢測：采用直接干燥法，原理為利用食品中水分的物理性質，在101.3kpa(一個大氣壓)，溫度101～105℃下采用揮發方法測定口腔微生態制劑中干燥減失的重量，包括吸濕水、部分結晶水和該條件下能揮發的物質，再通過干燥前后的稱量數值計算出水分的含量。經檢測口腔微生態制劑中的水含量為5.08％，小于dbs15/002-2013食品安全地方標準中含乳固態成型制品中水含量14％，口腔微生態制劑的水分含量很少，有利于口腔微生態制劑的存放，延長貨架期，且不易吸潮。

(3)脂肪含量的檢測：采用目前國內外普遍采用抽提法，其中索氏抽提法(soxhletextractormethod)是公認的經典方法，也是我國糧油分折首選的標準方法。經檢測制劑中的脂肪含量為7.1％，結果說明制劑中脂肪含量很少。

(4)還原糖含量的檢測：采用3,5-二硝基水楊酸法，區別于傳統的滴定法，分光度法靈敏且準確，可重復性強，便于操作。檢測結果：還原糖含量為11.89％，結果說明碳水化合物含量較高，糖醇能達到蔗糖等糖的增加甜味的作用。

(5)貯藏試驗及產品品質變化分析：壓得的片重約為3.0g，采用兩種不同的包裝材料(鋁箔袋和夾鏈袋)進行密封分裝，每袋150片，置于-18℃、4℃和室溫的環境中，一開始1個月中測1次/半個月，后續每月取樣測定1次，主要檢測指標有活菌數、硬度、脆碎度及感官評價。檢測結果：口腔微生態制劑在-18℃可以儲存一年，4℃放半年和室溫可以儲存三個月，結果說明該口腔微生態制劑由于其獨特的抑菌活性可延長貨架期，有利于改制劑的運輸保藏。

實施例7口腔微生態制劑生物活性指標的測定

1.抑菌活性測定：處理乳酸菌，10000轉離心20min得到發酵上清液，然后先調ph到7再加過氧化氫酶到10mg/ml在37℃水浴2h然后6000轉離心5min過0.22μl的濾膜除菌，然后把牛蛋培養基加熱倒薄薄的一層，然后再倒第二層是100ml的牛蛋含有200μl的要做一個生長曲線(或者用稀釋涂布法)的培養基再一薄薄的一層，然后放上牛津杯，然后打入200μl的處理樣品。4℃下靜置30min，37℃下靜置培養24h，測量抑菌圈直徑，并換算成效價，結果如表2所示，從表2中看出具有廣譜抑菌活性，植物乳桿菌細菌素對口腔致病菌變異鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌菌具有抑制作用，說明制劑對口腔致病菌有抑制作用。圖3為口腔微生態制劑對變異鏈球菌的抑菌活性圖。其中，圖3a圖為空白對照，圖3b為口腔微生態制劑的抑菌圖，從圖3中可以看出口腔微生態制劑具有明顯的抑菌圈，說明該口腔微生態制劑對口腔致病菌活性很強，抑菌圈效果明顯。

表2植物乳桿菌細菌素抑菌譜

注：0-5+、5-10++、10-15+++、15-20++++

2.胞外多糖含量測定：吸取0.2ml的樣品液，以蒸餾補至2.0ml，然后加入1.0ml的6％苯酚和5.0ml濃硫酸，搖勻冷卻室溫放置20min以后于490nm測光密度。以標準曲線計算多糖含量，結果如圖4和圖5所示。其中，圖4為苯酚硫酸法標準曲線。標準曲線方程為y＝0.0268x-0.0139，r²＝0.9977，結果表明該標準曲線可以作為測胞外多糖含量的曲線，利用該曲線方程，算出對應每株菌產生的胞外多糖的含量，再進行篩選。圖5為各菌株產胞外多糖的含量，從圖5中可以看出乳酸乳球菌kf-22產胞外多糖的量最多，達到68.85mg/l，相對于其他從開菲爾里面篩出的產胞外多糖54mg/l的乳酸菌還高，說明kf-22株菌是高產胞外多糖的菌株。

圖6為過氧化氫的標準曲線。過氧化氫含量測定：取200μl的細胞培養液，12000r/min離心5min，取上清液再過0.22μm的有機濾膜得到澄清菌液，再取1ml加9mlpbs稀釋10倍后測定od510值，然后根據圖5為標準曲線計算過氧化氫的含量，標準曲線方程為y＝0.1159x-0.0085，r²＝0.9991。結果表明該標準曲線可以作為測過氧化氫含量的曲線，利用該曲線方程，算出對應每株菌發酵液產生的過氧化氫的含量，再進行篩選。

表3為過氧化氫的篩選結果。從表3中可知乳酸乳球菌kf-15、kf-18、kf-20和kf-22四種菌株均產生過氧化氫，其中，乳酸乳球菌kf-20產過氧化氫的量最多，達到27.9μg/ml，換算為2.79％的過氧化氫，這接近于文獻中報道3％過氧化氫含量是最適度的清潔口腔的量，由于過多的過氧化氫會腐蝕口腔，過少達不到效果，說明kf-20菌株產出的過氧化氫能達到很好的清潔口腔的效果。

表3過氧化氫的篩選結果

實施例8口腔微生物制劑的抑制作用

1.評價口腔微生態制劑抑制變異鏈球菌菌膜的能力

將2.5mlmrs培養基與2.5mltsb培養基混合并加入5％蔗糖與0.5％2-嗎啉乙磺酸(mes)緩沖液。取100μl變異鏈球菌(1×10⁹cfu/ml)接入此培養基中，于37℃搖床培養12h后，接入同濃度的乳酸菌菌液，繼續培養12h。吸出培養基，用pbs緩沖液洗滌3次。將穩定黏附于試管表面的菌膜經超聲處理30min，使其均勻分散于等體積的生理鹽水中，梯度稀釋涂布于tsb固體培養基中。根據變異鏈球菌與乳酸桿菌菌落形態的差異，分別對菌膜中乳桿菌與變異鏈球菌進行菌落計數。對照組不接入乳桿菌，結果如圖7所示。圖7為本發明口腔微生態制劑對變異鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌的影響。其中，a為變異鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌，b為植物乳桿菌。從圖7可以看出，植物乳桿菌對口腔致病菌變異鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌的生物膜的抑制作用，先測得變異鏈球菌生物膜在tsb培養基上培養12h后的活菌數為10^8.3cfu，牙齦卟啉單胞菌生物膜在血平板上培養48h后的活菌數10^8.5cfu，同時測了植物乳桿菌在mrs培養基上的培養12h的活菌數10^8.0cfu，然后將變異鏈球菌生物膜與植物乳桿菌混合培養之后分別將其在tsb和mrs上培養活菌數均降低了1個數量級，同時植物乳桿菌的菌落數也降低了，說明植物乳桿菌和口腔致病菌發生共聚作用，導致了致病菌生物膜的活菌數的降低。

2.評價口腔微生態制劑降解羥磷灰石的能力

采用鈣檢測試劑盒(甲基百里香酚藍法mtb法)測定菌株對于羥磷灰石的降解能力，試劑盒組成如表4所示。

表4鈣檢測試劑盒組成

標準曲線的制作：

用去離子水將2.5mm鈣標準液稀釋成0.0625mm、0.125mm、0.25mm、0.5mm、0.625mm、1mm和2mm不同的濃度。

按表5加樣混勻，放5min后，分光光度計波長610nm，用空白管調零，讀取各管吸光度，制作標準曲線如圖8所示。圖8為標準鈣濃度的標準曲線，從圖8中可知標準曲線的回歸系數為0.9994，具有很高的回歸系數，說明這條標準曲線可作為測試樣品的對照曲線。

表5標準鈣濃度的標準曲線制作加樣表

表6測試樣品的加樣表

將變異鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌的血培養基進行離心獲得上清液，按表6加樣混勻，放5min后，分光光度計波長610nm，用空白管調零，讀取各管吸光度。圖9為本發明口腔微生態制劑對變異鏈球菌降解羥基磷灰石的關系曲線。其中，a為變異鏈球菌，b為植物乳桿菌，c為變異鏈球菌和植物乳桿菌混合。可以看出植物乳桿菌能降低變異鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌降解羥基磷灰石的能力，未加入植物乳桿菌的變異鏈球菌釋放ca的含量吸光度值是0.6，但是加入植物乳桿菌之后，變異鏈球菌釋放ca的含量降低到了吸光度值為0.2，顯著降低了變異鏈球菌降解羥基磷灰石的能力。圖10為本發明口腔微生態制劑對牙齦卟啉單胞菌降解羥基磷灰石的的關系曲線。其中，a為牙齦卟啉單胞菌，b為牙齦卟啉單胞菌和植物乳桿菌混合。從圖10中可以看到牙齦卟啉單胞菌釋放ca的含量由原來吸光度值0.8降低到了0.2，說明了本發明的口腔微生態制劑具有降低牙齦卟啉單胞菌降解羥基磷灰石的能力，也說明植物乳桿菌能夠有效的預防齲齒。

本發明的上述實施為較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合和簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內本發明權利要求的保護范圍之內。

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<110>華南農業大學

<120>一種口腔制劑微生態制劑及其制備方法

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