一種聚乙二醇偶聯環形多肽iRGD和薯蕷皂苷元載藥納米粒子的制備的制作方法

本發明涉及一種基于聚乙二醇偶聯環形多肽irgd和薯蕷皂苷元靶向性載藥納米粒子的制備方法。

背景技術：

腫瘤是危害人類生命和健康最嚴重的一類疾病。全世界每年約有九百余萬人患惡性腫瘤。每年新發病例約1000萬，死亡約140余萬人，到2020年，可能還會繼續增長。腫瘤的預防與治療已經成為重要課題。因此，如何預防和治療癌癥，依然是當今社會人類面臨的一大難題。薯蕷皂苷元（dgn）是一種有抗癌作用的天然藥物，但由于其水溶性很差，缺乏靶向性，在體內的循環時間很短，載藥量低，在很大程度上限制了它的臨床應用。

在眾多的納米載藥體系中，聚合物納米粒子具有增大藥物的吸收、控釋藥物釋放、提高藥物靶向性與穩定性、減少給藥次數和劑量、降低毒副作用等顯著優勢，在癌癥治療中備受關注。此外，納米載體材料的選擇也非常重要。聚乙二醇（peg）安全、無毒，具有油水二親性，已被fda批準用于人體。peg與藥物相連，能夠增大藥物的相對分子質量(mr)，減少腎消除，延長藥物的半衰期，增大藥物的水溶性，并且peg鏈包裹在藥物表面，能夠遮蔽藥物的抗原決定簇，降低藥物的免疫原性。經過二十多年的發展，peg修飾藥物技術已經進入了實用期。迄今，已有多個藥物通過美國fda批準進入市場，國內此方面的研究也越來越多。irgd是一種新型環形腫瘤穿膜肽，通過對藥物及藥物載體進行修飾以改善藥物或載體向實體瘤深部的滲透能力。研究結果表明，在增加抗腫瘤藥物的腫瘤滲透能力及減少毒副作用方面，irgd的應用均顯示出良好的效果。

藥物的聚乙二醇修飾即聚乙二醇化，通常是將活化的聚乙二醇通過化學方法偶聯到蛋白質、多膚、小分子藥物和脂質體上。1977年abuchowski等首次將甲氧基聚乙二醇（methoxypo1yethyleneglyeol，mpeg）共價連接到蛋白質上，獲得療效優于未修飾原型藥物的mpeg-蛋白質結合物之后，peg修飾技術逐漸受到重視，已成為目前藥物化學修飾的研究熱點。聚乙二醇修飾的藥物與未修飾的藥物相比，具有以下突出的優點：(l)生物活性增強；(2)對腫瘤有更強的被動靶向作用；(3)半衰期延長；(4)最大血藥濃度降低；(5)血藥濃度波動較小；(6)酶降解作用減少；(7)免疫原性及抗原性減小；(8)毒性降低；(9)溶解性提高；(10)用藥頻率減少。

本研究選用薯蕷皂苷元為模型藥物制備納米藥物載體。主要是通過聚乙二醇將薯蕷皂苷元和irgd連接在一起，合成靶向性兩親偶聯物前藥irgd-peg-dgn，使藥物能夠準確靶向至腫瘤部位，大大提高了水溶性和載藥量，再通過自沉淀法制成內部疏水，外部親水的納米粒子包裹另一種疏水性藥物羥基喜樹堿（hcpt），從而進一步提高了其治療效果。

隨著載藥納米粒子體系的發展，將在癌癥治療中體現其巨大的優勢和良好的臨床應用前景。

技術實現要素：

本發明的目的是建立一種基于聚乙二醇偶聯環形多肽irgd和薯蕷皂苷元靶向性載藥納米粒子的制備方法：首先合成一種兩親性高分子載體聚乙二醇-薯蕷皂苷元偶聯物，再將聚乙二醇-薯蕷皂苷元偶聯物與irgd反應合成irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元，最后將疏水性藥物10-羥基喜樹堿包封于內部自組裝形成靶向載藥納米粒子。

所述的irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元偶聯物為以下的結構：

其中：

聚乙二醇一端通過馬來酰胺基團修飾另一端通過羧基修飾；

本發明的技術方案：

靶向性兩親高分子irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元偶聯物的合成：

(2)靶向性載藥納米粒子的制備

沉淀法自組裝制備納米粒子。具體方法：將合成的irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元偶聯物與疏水性藥物10-羥基喜樹堿分別溶于dmso中，然后逐滴加入到高速攪拌水溶液中，pbs透析3h；過濾后，冷凍干燥得到載藥納米粒子。

本發明的優點：

(1)利用疏水性的小分子抗癌藥物薯蕷皂苷元代替傳統的疏水惰性材料制備兩親性高分子載體，提高載藥量，并可以與其他抗癌藥物實現聯合治療，從而提高治療效果；

(2)利用新型環形多肽irgd向實體瘤深部的滲透能力，在合成的兩親性高分子載體材料聚乙二醇-薯蕷皂苷元上引入irgd，從而實現定向靶向至腫瘤部位；

(3)所形成的納米粒中包封模型藥物10-羥基喜樹堿，保證藥物在體循環中保持穩定的同時實現了藥物在細胞內的智能控制釋放和治療效果；

(4)制備工藝簡單，易于操作。

附圖說明

圖1為irgd-peg-dgn/hcpt納米粒子的tem示意圖；

圖2為純藥及納米粒子的細胞毒性。

具體實施方式

下面給出的實例對本發明進行具體描述，但不限制本發明，本發明的范圍由權利要求限定。

實施例1：

聚乙二醇-薯蕷皂苷元偶聯物的合成：向50ml干燥的三口瓶中持續通入n2；在n2的保護下將0.4g薯蕷皂苷元，2.4g聚乙二醇(mw20,000)溶于10mldcm中，添加0.11gedc，0.12gdmap，0°c下攪拌溶解，攪拌反應1h，然后室溫攪拌反應24h；待反應結束后，將溶劑蒸干，加入dcm溶解，過濾除去沉淀，溶液中加入100ml乙醚洗，過濾得到固體，用20mln,n-二甲基甲酰胺/異丙醇（1:4（v/v））重結晶，濾去不溶物，產物用100ml乙醚洗，過濾，將沉淀溶于pbs并透析6h，冷凍干燥，得到純度95%以上的聚乙二醇-薯蕷皂苷元偶聯物；

irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元的制備：取0.48g偶聯物聚乙二醇-薯蕷皂苷元與0.026girgd溶解在20mlpbs中反應6h,含有游離巰基的irgd環形多肽與偶聯物聚乙二醇-薯蕷皂苷元中聚乙二醇一端的馬來酰胺基團發生連接。產物用pbs透析3h后冷凍干燥得到irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元的偶聯物irgd-peg-dgn；

irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元/10-羥基喜樹堿載藥納米粒子的制備：0.2girgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元偶聯物與0.05g10-羥基喜樹堿分別溶于0.5mldmso中，逐滴加入到3.0ml高速攪拌的水溶液中；然后將irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元/10-羥基喜樹堿溶液移至透析袋中pbs透析3h，過濾后，冷凍干燥得到載藥納米粒子；

實施例2：

聚乙二醇-薯蕷皂苷元偶聯物的合成：向50ml干燥的三口瓶中持續通入n2；在n2的保護下將0.4g薯蕷皂苷元，0.9g聚乙二醇(mw7,500)溶于10mldcm中，添加0.05gedc，0.06gdmap，0°c下攪拌溶解，攪拌反應1h，然后室溫攪拌反應24h；待反應結束后，將溶劑蒸干，加入dcm溶解，過濾除去沉淀，溶液中加入100ml乙醚洗，過濾得到固體，用20mln,n-二甲基甲酰胺/異丙醇（1:4（v/v））重結晶，濾去不溶物，產物用100ml乙醚洗，過濾，將沉淀溶于pbs并透析6h，冷凍干燥，得到純度95%以上的聚乙二醇-薯蕷皂苷元偶聯物；

irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元的制備：取0.18g偶聯物聚乙二醇-薯蕷皂苷元與0.026girgd溶解在20mlpbs中反應6h,含有游離巰基的irgd環形多肽與偶聯物聚乙二醇-薯蕷皂苷元中聚乙二醇一端的馬來酰胺基團發生連接，產物用pbs透析3h后冷凍干燥得到irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元的偶聯物irgd-peg-dgn；

irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元/10-羥基喜樹堿載藥納米粒子的制備：0.2girgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元偶聯物與0.1g10-羥基喜樹堿分別溶于0.5mldmso中，逐滴加入到3.0ml高速攪拌的水溶液中；然后將irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元/10-羥基喜樹堿溶液移至透析袋中pbs透析3h，濾膜過濾后，冷凍干燥得到載藥納米粒子；

實施例3：

聚乙二醇-薯蕷皂苷元偶聯物的合成：向50ml干燥的三口瓶中持續通入n2；在n2的保護下將0.4g薯蕷皂苷元，1.6g聚乙二醇(mw10,000)溶于10mldcm中，添加0.08gedc，0.11gdmap，0°c下攪拌溶解，攪拌反應1h，然后室溫攪拌反應24h；待反應結束后，將溶劑蒸干，加入dcm溶解，過濾除去沉淀，溶液中加入100ml乙醚洗，過濾得到固體，用20mln,n-二甲基甲酰胺/異丙醇（1:4（v/v））重結晶，濾去不溶物，產物用100ml乙醚洗，過濾，將沉淀溶于pbs并透析6h，冷凍干燥，得到純度95%以上的聚乙二醇-薯蕷皂苷元偶聯物；

irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元的制備：取0.24g偶聯物聚乙二醇-薯蕷皂苷元與0.026girgd溶解在20mlpbs中反應6h,含有游離巰基的irgd環形多肽與偶聯物聚乙二醇-薯蕷皂苷元中聚乙二醇一端的馬來酰胺基團發生連接。產物用pbs透析3h后冷凍干燥得到irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元的偶聯物irgd-peg-dgn；

irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元/10-羥基喜樹堿載藥納米粒子的制備：0.2girgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元與0.15g羥基喜樹堿分別溶于0.5mldmso中，逐滴加入到3.0ml高速攪拌的水溶液中；然后將irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元/10-羥基喜樹堿溶液移至透析袋中pbs透析3h，濾膜過濾后，冷凍干燥得到載藥納米粒子；

實施例4：

聚乙二醇-薯蕷皂苷元偶聯物的合成：向50ml干燥的三口瓶中持續通入n2；在n2的保護下將0.4g薯蕷皂苷元，2.3g聚乙二醇(mw15,000)溶于10mldcm中，添加0.08gedc，0.12gdmap，0°c下攪拌溶解，攪拌反應1h，然后室溫攪拌反應24h；待反應結束后，將溶劑蒸干，加入dcm溶解，過濾除去沉淀，溶液中加入100ml乙醚洗，過濾得到固體，用20mln,n-二甲基甲酰胺/異丙醇（1:4（v/v））重結晶，濾去不溶物，產物用100ml乙醚洗，過濾，將沉淀溶于pbs并透析6h，冷凍干燥，得到純度95%以上的聚乙二醇-薯蕷皂苷元偶聯物；

irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元的制備：取0.3g偶聯物聚乙二醇-薯蕷皂苷元與0.026girgd溶解在20mlpbs中反應6h,含有游離巰基的irgd環形多肽與偶聯物聚乙二醇-薯蕷皂苷元中聚乙二醇一端的馬來酰胺基團發生連接。產物用pbs透析3h后冷凍干燥得到irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元的偶聯物irgd-peg-dgn；

irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元/10-羥基喜樹堿載藥納米粒子的制備：0.2girgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元與0.2g10-羥基喜樹堿分別溶于0.5mldmso中，逐滴加入到3.0ml高速攪拌的水溶液中；然后將irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元/10-羥基喜樹堿溶液移至透析袋中pbs透析3h，濾膜過濾后，冷凍干燥得到載藥納米粒子。