一種富含細胞因子的脂肪源性基質細胞復合移植材料的制備及其臨床應用的制作方法

本發明屬于生物醫學技術領域，具體是一種富含細胞因子的脂肪源性基質細胞復合移植材料的制備及其臨床應用。

背景技術：

由于外傷、感染、腫瘤切除或先天性缺陷原因等造成的體表組織器官凹陷畸形，除了影響容貌之外，還會不同程度的影響患者的心理健康及社會交際活動。自體脂肪移植填充是目前治療體表軟組織凹陷或輪廓不對稱的主要方法之一。其主要缺點是移植后容易吸收，吸收率占20％～90％不等，大多需要接受反復數次注射才能達到較為滿意的效果，因此如何減少脂肪移植后的吸收率，提高成活率已成為近年的研究熱點。

脂肪細胞在移植早期缺乏有效血供，在移植物的血供充分建立之前，移植的脂肪組織的主要營養來源于周圍組織液的滲透，而中央部分的脂肪組織往往因與周圍組織的距離較大，缺血缺氧時間過長，更容易發生壞死、液化。巴西carpaned醫師于1993年就提出“邊緣地帶”的概念并觀察到約有40％組織存活于距離移植物邊緣約1.5±0.5mm之以內的邊緣地帶，有學者研究發現移植物中央區纖維化較邊緣區多，脂肪細胞體積較小，說明移植物的吸收大部分發生在中央區域，因此改善移植物中央區早期的營養狀態，促進血供建立至關重要[carpanedaca,ribeiromt.studyofthehistologicalterationsandviabilityoftheadiposegraftinhumans.aestheticplastsurg,1993,17(1):43-47.doik,ogataf,etoh,katoh,kunos,kinoshitak,kanayamak,fengj,manabei,yoshimurak.differentialcontributionsofgraft-derivedandhost-derivedcellsintissueregeneration/remodelingafterfatgrafting.plastreconstrsurg,2015,135(6):1607-1617.]。

自2001年zuk等首次從脂肪組織中分離、提取出脂肪干細胞(adipose-derivedstemcells，ascs)并命名以來，ascs因來源廣泛、取材方便、組織損傷小、擴增迅速等優點已成為細胞治療和組織工程應用中的理想工具。大量研究表明，ascs在體內損傷修復、抗衰老等方面均可發揮較為顯著的作用；其生物學作用的實現一部分通過多向分化能力，ascs可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、神經等多種細胞，補充替代老化、缺損的組織細胞；另一部分通過旁分泌功能，ascs可分泌多種細胞因子、多肽類等活性成分，提高受損細胞的生命力和抗凋亡能力。ascs來源豐富，可分化為多種譜系，可分泌多種細胞因子，并具有免疫調節作用，其在組織再生領域中的突出表現使其具有廣闊的臨床應用前景。[zukpa,zhum,mizunoh,huangj,futrelljw,katzaj,benhaimp,lorenzhp,hedrickmh.multilineagecellsfromhumanadiposetissue:implicationsforcell-basedtherapies.tissueeng,2001,7(2):211-28.uzbasf,mayid,parisiam,thompsonsk,kayaa,perkinsad,memilie.molecularphysiognomiesandapplicationsofadipose-derivedstemcells.stemcellrev,2015,11(2):298-308.]

自2005年以來，我們的研究團隊以人類不同解剖部位的皮下脂肪為組織來源，建立了自己的一整套實驗技術平臺及方法，進一步優化ascs分離培養方案，并對其進行多潛能分化表型鑒定，通過在細胞體外培養或體內移植過程中添加人參皂苷rg1或自體prp/prf等成分，觀察及評價細胞表型及其它生物學行為的變化情況，同時評價這些成分對脂肪干細胞生長增殖、多向分化、旁分泌功能及特定組織構建的影響，取得了可喜的研究成果，為脂肪干細胞應用于組織工程、再生醫學研究及在臨床上促進創傷修復、組織再生、器官重建及細胞治療提供理論依據。

技術實現要素：

本發明解決的問題在于提供一種富含細胞因子的脂肪源性基質細胞復合移植材料的制備及其臨床應用。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：

1.一種富含細胞因子的脂肪源性基質細胞復合移植材料的制備，制備方法包括以下步驟：

1)脂肪顆粒團的獲取與純化

選取大腿上段內外側或下腹部為供區，用手持20ml針筒預留空氣法低負壓抽取，根據患者情況，選定脂肪供區位置后，局部腫脹液浸潤麻醉，采用自行設計的多孔專用吸脂針進行抽吸，抽吸時由深層向淺層抽吸，扇形反復抽吸；將抽吸出來的脂肪顆粒，采用生理鹽水沖洗備用；采取低速離心方法獲取并純化脂肪顆粒團，離心轉速600rpm/min，離心時間2min，操作過程全程遵循無菌密閉操作原則，盡量減少脂肪組織與空氣的接觸時間。如圖1所示。

2)納米脂肪基質細胞的獲取

將一部分脂肪顆粒團經機械搗碎乳化法制備富含脂肪干細胞的納米脂肪基質細胞，將步驟1)初步處理后的顆粒脂肪經孔徑0.5mm的濾網過濾，隨后將顆粒脂肪經2個20ml注射針筒連接納米脂肪專用乳化器快速對打30次，機械乳化，用0.5mm孔徑的濾網再次過濾，最后經轉速為8000rpm/min，離心時間為5min高速離心去除油脂后得到的脂肪乳化液即為納米脂肪如圖1所示，這部分乳化后的納米脂肪攜帶有較多的基質血管成分和脂肪干細胞，有利于增加基質血管成分與脂肪細胞的接觸面，提高脂肪移植物的成活率，將機械乳化顆粒脂肪分離培養并傳代后獲得的間充質干細胞稱為納米脂肪來源干細胞。

3)納米脂肪來源干細胞的生物學特性及多向分化鑒定

經步驟2)機械乳化后的納米脂肪基質細胞含有較多的基質血管成分，培養24h后開始有少量成纖維細胞樣形態的細胞散在貼壁，大部分未貼壁細胞為球形或圓形的雜細胞。24-48h后首次換液去除未貼壁細胞后，大部分貼壁細胞呈寬大扁平的成纖維細胞樣細胞，隨著培養時間的延長，這些貼壁細胞呈集落狀生長，集落大小不一；集落中細胞形態為典型的梭形細胞。約7-10d可達80％～90％致密層單層。傳代后細胞形態主要為梭形，如圖2的a、b、c所示。傳代后細胞生長速度較原代細胞明顯增快，如果按1：3傳代，2-3d即可長滿。連續傳代培養10代細胞未出現明顯衰老現象。傳代后細胞突起明顯，呈梭形或多角形，生長較快，經檢測細胞倍增時間平均約為40h，各代細胞形態與傳統膠原酶消化法獲取的脂肪干細胞相似。第3代細胞經成脂誘導14d，可見細胞內有透亮的脂滴形成，油紅o染色可見脂滴被染成鮮紅色如圖2的d、e所示。成骨誘導21d后，可見典型的礦化鈣結節形成，茜素紅染色吳鮮紅色如圖2的f、g所示；成軟骨誘導14d后，可見高度聚集樣生長的細胞團，呈斑片狀或結節狀，周圍細胞呈放射狀；結節較大，肉眼可見；阿利辛藍染色提示結節及周邊聚集的細胞呈藍色如圖2的h、i所示。第3代納米脂肪來源干細胞流式細胞分析顯示cd29、cd44、cd49d、cd54、cd90和cd105呈陽性，而cd34、cd45和cd106呈陰性，如圖5所示。

4)富含細胞因子纖維蛋白膠的獲取

抽取同一個體的適量靜脈血，置于的無菌負壓采血管內，采用choukroun’s法離心轉速為2700rpm/min、離心時間為12min一次高速離心提取富含細胞因子的凝膠狀物質。即刻用20ml無菌注射器采集患者靜脈血液20-40ml，并密封蓋封。將無菌的離心套管放入離心機中，然后將裝有患者靜脈血液的20ml注射器放入套管中，以轉速為2700rpm/min離心12min。靜置3～5min后棄上清，去除底層紅細胞碎片，收集中間纖維蛋白凝膠層，過濾去除血清，將富含細胞因子纖維蛋白膠收集備用，如圖3所示。同時對富含細胞因子纖維蛋白膠在1～168h時間段內進行細胞因子釋放濃度的檢測，結果發現血管內皮生長因子血小板源性生長因子、轉化生長因子-β1、表皮生長因子、白細胞介素-6、基質金屬蛋白酶-1和胰島素樣生長因子-1的濃度呈上升趨勢，如圖4所示。這些細胞因子對促進組織修復和再生具有重要的作用。

5)臨床應用情況

移植物由結構性脂肪顆粒、納米脂肪基質細胞和富含細胞因子纖維蛋白膠按一定比例混合而成，在受區周圍標記，選擇較為隱蔽的部位作為進針點，局部麻醉，自遠向近緩慢注入移植物，使其均勻分布。在注入前，先用銳針剌破皮膚，再換成鈍針注射復合移植物，先回抽是否有回血，尤其是在眼周，避免注入至血管內，注射時，給予最小的壓力，緩慢注入。注射時應注意間斷、扇形、線狀注入，采用多點分層注入，避免團塊情況出現，而影響血運。注射量應較所需量多25％～30％左右：注入后局部按摩，使移植物分布均勻。術后輕度壓迫.敷料固定2天。靜脈使用抗生素3天，預防感染。

本發明項目使用新鮮分離富含基質血管成分的納米脂肪、富含細胞因子纖維蛋白膠與自體顆粒脂肪形成復合移植物后，對62例面部凹陷、皮膚老化及乳房萎縮或先天性發育不良的患者進行局部注射移植治療，經過12～24個月的隨訪，發現脂肪存活情況良好，大部分病例單次注射即能達到滿意效果，僅有5例(8.06％)需行2次注射，而傳統的自體脂肪移植絕大部分患者則需要反復多次注射治療，且移植物發生囊腫、液化的概率較高。此外所有患者術后均未發現局部感染、脂肪液化、硬結、感覺異常等不良并發癥，說明該方法安全性可靠，且效果顯著，可作為臨床上治療各類軟組織缺損及皮膚衰老的首選方案。同時我們還發現所有患者接受移植部位的膚質得到了不同程度的改善，如色斑淡化、細紋消失、毛孔縮小等，其主要作用機制是納米脂肪中血管基質成分的旁分泌功能以及富含細胞因子纖維蛋白膠中的細胞因子發揮了組織再生及皮膚抗衰老作用。

綜上所述，應用新鮮分離富含基質血管成分的納米脂肪、富含細胞因子纖維蛋白膠按一定比例與自體結構性顆粒脂肪移植作為面部、胸部軟組織凹陷或缺損患者的塑形治療，術后患者滿意度高，脂肪組織可以在受區長期存活，未見不良并發癥，單次注射即可獲得比較滿意的效果，是安全性好、遠期療效顯著的面部輪廓及胸部整形方法，該方法可顯著提高脂肪移植成活率，達到塑形、豐胸、精雕面部輪廓并能改善面部膚質的作用，值得進一步深入研究和推廣應用。

本發明的有益效果：

本發明基于基質血管成分促進創傷或創面修復并減少瘢痕增生、促進組織再生修復與器官重建的新技術，縮短患者的康復時間，取得良好的療效，為臨床上細胞輔助的自體脂肪組織移植修復軟組織或器官缺損、燒傷創面、難愈性創面及乳腺癌術后乳房重建提供實驗依據與理論支持。

附圖說明

圖1是本發明結構性顆粒脂肪和納米脂肪的提取圖。

圖2是本發明第3代納米脂肪來源干細胞形態特征及多向分化誘導結果圖。

圖中，a、b、c為傳代后細胞形態主要為梭形，少數為三角形或多邊形；d、e為第3代細胞經成脂誘導14d，可見細胞內有透亮的脂滴形成，油紅o染色可見脂滴被染成鮮紅色；f、g為成骨誘導21d后，可見典型的礦化鈣結節形成，茜素紅染色吳鮮紅色；h、i為成軟骨誘導14d后，可見高度聚集樣生長的細胞團，呈斑片狀或結節狀，周圍細胞呈放射狀；結節較大，肉眼可見；阿利辛藍染色提示結節及周邊聚集的細胞呈藍色。

圖3是本發明富含細胞因子纖維蛋白膠的提取示意圖。

圖4是本發明不同時間點富含細胞因子纖維蛋白膠釋放細胞因子酶聯免疫吸附檢測結果圖。

圖5是本發明第3代nfscs表面抗原流式細胞分析結果圖。

具體實施方式

下面結合典型案例對本發明實施效果作詳細的說明。

典型案例1

患者韋某某，女，30歲，因面部軟組織凹陷及輪廓不協調就診，要求手術改善。于2016年1月29日在局部麻醉下行“富含細胞因子的脂肪源性基質細胞復合移植材料”局部注射治療，其中雙側顳部注射移植45ml，額部注射移植30ml，雙側面頰部注射移植20ml，下巴注射移植5ml。術后隨訪12個月見面部輪廓好，軟組織凹陷處較飽滿，移植物存活良好，面部膚質明顯改善，療效滿意。

典型案例2

患者何某某，女，26歲，因雙側下瞼部(瞼頰溝)、法令紋(鼻唇溝)軟組織凹陷不協調就診，要求手術改善。于2016年3月12日在局部麻醉下行“富含細胞因子的脂肪源性基質細胞復合移植材料”局部注射治療，其中雙側瞼頰溝注射移植1.6ml，雙側鼻唇溝注射移植10ml。術后隨訪12個月見輪廓好，軟組織凹陷處較飽滿，移植物存活良好，局部皮膚光滑、毛孔變小，療效滿意。

典型案例3

患者蘇某某，女，25歲。因先天性乳房發育不良及不對稱來診，要求手術改善。于2015年11月28日在全身麻醉下行雙側大腿吸脂術+雙側乳房“富含細胞因子的脂肪源性基質細胞復合移植材料“注射移植術，其中左側乳房注射細胞復合物220ml，右側乳房注射細胞復合物190ml。術后隨訪12個月見雙側乳房形態飽滿，移植物存活良好，未見移植物液化、硬結、囊腫等并發癥，療效滿意。