替羅非班在促進缺血隨意皮瓣存活的作用的制作方法

本發明涉及替羅非班在促進缺血隨意皮瓣存活的作用。

背景技術：

近年來，隨著社會及技術的高速發展，人們的工作和生活的節奏大為加快，導致與職業、交通行為等相關的大面積創傷、組織缺損病例也在逐年增減。這類創傷在修復后多遺留不同程度的畸形和功能障礙，尤其是手部和顏面部的創傷畸形。在手外顯微重建、整形外科、創傷骨科等領域，常常需要做皮瓣轉移手術來鎖蓋創面、重建功能和改善外形，臨床上，隨意皮瓣因其使用的靈活和方便(圖1)，已經成為修復組織缺損的常規手術之一，然而由于隨意皮瓣內無知名的血管供血，所以其長寬比例受到一定限制，一旦超出1.5-2：1的長寬比，皮瓣遠端會出現缺血壞死，這在很大程度上限制了其在臨床上的應用，因此，如何改善超長隨意皮瓣的血運、提商皮瓣的缺血耐受能力、增加缺血隨意皮瓣的存活，改善皮瓣微循環、對提高臨床皮瓣應用范圍和探索高效、特異的防治方法有重要臨床意義。

替羅非班，是一種非肽類的血小板糖蛋白iib/iiia受體的可逆性拮抗劑，替羅非班阻止纖維蛋白原與糖蛋白iib/iiia結合，因而阻斷血小板的交聯及血小板的聚集。替羅非班臨床用于不穩定型心絞痛或非q波心肌梗塞病人，同時也適用于冠脈缺血綜合征病人進行冠脈血管成形術或冠脈內斑塊切除術，預防心臟缺血事件，以預防與經治冠脈突然閉塞有關的心臟缺血并發癥等，對皮瓣存活均無報道。

技術實現要素：

本發明涉及替羅非班在促進缺血隨意皮瓣存活的作用。在促進缺血隨意皮瓣存活的過程中采用肌肉注射的方式，使用方法為每日肌注劑量10mg/kg，5～7天為一療程。

通過大量的動物實驗得出結論，使用替羅非班可以使得皮瓣的成活面積比明顯提高，能很好地促進缺血隨意皮瓣存活。

附圖說明

圖1為本發明缺血隨意皮瓣模型示意圖；

圖2替羅非班實驗組與生理鹽水對照組術后7天的對比圖；

圖3術后7天皮瓣成活面積柱狀對比圖；

圖4替羅非班組與生理鹽水組術后7天皮瓣he染色對比圖；

圖5術后7天皮瓣mvd計數柱狀對比圖；

圖6術后7天皮瓣sod表達柱狀對比圖；

圖7術后7天皮瓣mda表達柱狀對比圖；

圖8術后7天皮瓣vegf表達及ia值柱狀對比圖。

具體實施方式

替羅非班可以促進缺血隨意皮瓣存活性明顯提高。使用方法為每日肌注劑量10mg/kg，配成含量為5%的注射液，5～7天為一療程。以下為替羅非班在促進缺血隨意皮瓣存活的作用評價：

1、缺血隨意皮瓣模型建立

選用健康的雄性sd大鼠30只，由溫州醫科大學實驗動物中心提供，清潔級，scxk（浙）2005-0019，體重200-250g，2—3個月齡。將大鼠按照隨機數字表法分為替羅非班實驗組和生理鹽水對照組，每組15只。采用改良的mcfarlane皮瓣制作方法，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，將動物俯臥位固定，脫毛，碘伏消毒，鋪巾，以大鼠尾部兩髂嵴連線為蒂，在背部正中設計一寬3cm、長9cm矩形隨意型皮瓣，設計線切開皮膚，皮下組織，達深筋膜淺層，保留真皮下毛細血管網，于深筋膜淺層表面分離皮下組織，遇到知名血管即以4-0號絲線結扎。皮瓣完全掀起后，徹底止血，立即用4-0醫用慕絲縫合線間斷縫合。切口周圍碘伏消毒后涂抹金霉素軟膏，腹腔注射生理鹽水(50ml／kg)抗休克。

替羅非班實驗組：1mg/kg替羅非班腹腔注射，生理鹽水對照組：相同劑量腹腔注射，均每日1次，連續注射7天。因大鼠有自殘現象，為避免其術后回頭撕咬傷口影響皮瓣存活，均為其帶上“頸套”（見圖1），并單籠喂養。為減少手術操作帶來的誤差，所有手術由1人完成。

2、觀察指標：

2.1皮瓣存活面積比的檢測

皮瓣存活面積比的檢測：術后第7天，各組大鼠在麻醉狀態下用透明紙準確測量皮瓣成活及壞死面積，并剪成成活或死亡兩部分，分別以電子秤稱重。按以下公式計算皮瓣存活面積比：皮瓣存活面積比=皮瓣存活面積玻璃紙重量/皮瓣總表面積玻璃紙重量×100%)。皮瓣壞死標準：皮瓣顏色發黑，組織回縮、彈性差，質地堅硬，切割組織不出血。病理表現為組織崩解、細胞核消失、炎癥細胞廣泛浸潤、有局灶出血。

7天后實驗組皮瓣的成活面積比為（74.94±3.23）%，對照組皮瓣成活面積比為（51.53±2.36）%，比較兩組皮瓣的成活面積比，差異有統計學意義（p<0.01）（見圖2）。

2.2組織學檢測

皮瓣術后7天取皮瓣標本，將皮瓣組織浸泡于10％中性福爾馬林液中固定，石蠟包埋，制成4微米厚的切片，he染色。光鏡下觀察肉芽組織層厚度、組織水腫、壞死、炎癥細胞浸潤等情況。在10×10倍光鏡下隨意選取5個視野計數微血管密度（mvd）取平均值。mvd計數，替羅非班組在皮瓣中區(30.89±2.34)個/mm²。對照組在皮瓣中區(15.09±1.90)個/mm²，兩組中區mvd比較，差異有統計學意義（p＜0.05）（見圖4、5）．

2.3sod、mda表達的檢測

術后7d，于皮瓣中區正中部位切取0.5cm×0.5cm全層組織，去除肉膜層，稱質量，稀釋，冰水浴中制成體積分數10％組織勻漿液．按照sod、mda檢測試劑盒說明書，檢測二者含量。

替羅非班組皮瓣組織每毫克蛋白中超氧化物歧化酶（sod）含量為(56.81±4.46)u，明顯高于生理鹽水組(28.19±2.28)u，差異有統計學意義（p<0.01）（見圖6）；每毫克蛋白中丙二醛（mda）含量實驗組為(26.59±6.30)nmol、對照組為(58.15±3.72)nmol，差異有統計學意義(p<0.01)（見圖7）。

2.4免疫組化觀察

檢測血管內皮生長因子（vegf）在實驗組和對照組的表達及分布情況。選擇染色均勻的區域，在40×10倍光鏡下進行觀察，每張片子取五個視野拍攝保存，在拍攝過程中，設置白平衡、快門時間等參數一致。將保存的圖片導入image-proplusv6.0軟件，選擇需要分析的指標“累積吸光度ia值”，讀取ia數值進行測量，作為評價vegf表達的指標。

兩組vegf免疫組化表達。通過計算累計吸光度a值（ia），得到實驗組vegf表達量4687±440，對照組vegf表達量2162±313，兩組比較差異有統計學意義（p＜0.01）（見圖8）。

結論：1、替羅非班可以促進缺血隨意皮瓣的存活。

2、替羅非班促進皮瓣存活的機理可能是促進血管內皮生長因子（vegf）的表達，從而促進新生血管的增生有關。

3、替羅非班促進皮瓣存活的機理可能與減少缺血皮瓣組織的缺血再灌注有關。

技術特征：

技術總結
本發明涉及替羅非班在促進缺血隨意皮瓣存活的作用。在促進缺血隨意皮瓣存活的過程中采用肌肉注射的方式，使用方法為每日肌注劑量10mg/kg，5～7天為一療程。通過大量的動物實驗得出結論，使用替羅非班可以使得皮瓣的成活面積比明顯提高，能很好地促進缺血隨意皮瓣存活。

技術研發人員：林丁盛;成梁
受保護的技術使用者：溫州醫科大學附屬第二醫院、溫州醫科大學附屬育英兒童醫院
技術研發日：2017.05.31
技術公布日：2017.10.10