CREBZF在治療、預防和診斷代謝性疾病中的應用的制作方法

本發明涉及crebzf在治療、預防和診斷代謝性疾病中的應用。

背景技術：

隨著現代人們生活水平的提高和膳食結構的改變，以肥胖、二型糖尿病、脂肪肝、高血糖、高血脂癥等為代表的代謝綜合征(metabolismsyndrome，ms)發病率逐年升高并且呈現上升的趨勢，由于脂肪代謝紊亂引起的高血脂是脂肪肝、肥胖、冠心病和動脈粥狀硬化等其他慢性病的重要。因此尋找到有效預防和控制代謝紊亂的藥物靶點，對于防治代謝病具有重要的現實意義，同時找到一種能夠監測肥胖、非酒精性脂肪肝(nafld)、高胰島素、高血糖、高血脂等為代表的代謝綜合征相關的分子指標，對于疾病的臨床分子診斷和治療以及預防將會起到積極地作用。

肥胖和二型糖尿病和一系列代謝綜合征的發生發展緊密相關，其中包括胰島素抵抗，脂肪肝，高血糖，血脂異常，同時肥胖和二型糖尿病的發生也會加速臨床中與心血管相關疾病的進程。肝臟中過度累積甘油三酯是脂肪肝的顯著特點，并且和胰島素抵抗具有密切的相關性，肝臟中增加的脂肪酸從頭合成和過多的甘油三酯累積所造成的代謝紊亂也會進一步的加速脂肪肝的發病進程。

crebzf(也被稱作為zf、zhangfei)屬于activationtranscriptionfactor/campresponseelement-bindingprotein(atf/creb)家族的堿性亮氨酸轉錄因子，最初對它的研究是發現它可以通過與單純皰疹病毒中的hcf-1細胞因子發生相互作用來抑制單純皰疹病毒復制〔akhova,o.,m.bainbridge和v.misra，theneuronalhostcellfactor-bindingproteinzhangfeiinhibitsherpessimplexvirusreplication，journalofvirology,2005.79(23):p.14708-14718〕。crebzf和其它atf/creb家族的轉錄因子不同的是，它并不以同源二聚體的形式直接結合dna；在調控內質網應急的未折疊蛋白反應(unfoldedproteinresponse，upr)時，它可以作為一個共轉錄因子和atf4形成異源二聚體來發揮調控作用〔hogan,m.r.、g.p.cockram和r.lu,cooperativeinteractionofzhangfeiandatf4intransactivationofthecyclicampresponseelement，febsletters,2006.580(1):p.58-62〕。之前已有人對crebzf在生化分子功能進行了初步的研究〔xie,y.-b.、b.nedumaran和h.-s.choi，molecularcharacterizationofsmileasanovelcorepressorofnuclearreceptors.nucleicacidsresearch,2009.37(12):p.4100-4115；xie,y.-b.等，transcriptionalcorepressorsmilerecruitssirt1toinhibitnuclearreceptorestrogenreceptor-relatedreceptorγtransactivation.journalofbiologicalchemistry,2009.284(42):p.28762-28774〕，但是對于crebzf在營養過剩的情況下是如何調控代謝的機制研究還知之甚少。

技術實現要素：

本文第一方面提供以下試劑在制備減緩對象體重增加，降低對象血糖血脂，改善對象肝臟脂肪沉積，增加對象葡萄糖耐受性，和/或減緩對象肝細胞脂質堆積的藥物中的用途：

(1)減少對象crebzf蛋白的表達的試劑；和/或

(2)降低對象所表達的crebzf蛋白的活性的試劑。

在一個或多個實施方案中，所述對象的體重增加、高血糖、高血脂、肝臟脂肪沉積、低葡萄糖耐受性和/或肝細胞脂質堆積由該對象的高脂高糖飲食所致。

在一個或多個實施方案中，所述藥物用于降低糖尿病、心血管疾病、肥胖和/或脂肪肝的發病機率或治療這些代謝性疾病。

在一個或多個實施方案中，減少對象crebzf蛋白的表達的試劑為抑制crebzf基因表達或降低其表達水平的試劑。

在一個或多個實施方案中，抑制crebzf基因表達或降低其表達水平的試劑選自：

(a)抑制該crebzf基因轉錄活性的試劑；

(b)抑制該crebzfmrna的轉錄水平的試劑；

(c)促進該crebzfmrna降解的試劑；

(d)針對該crebzf基因的sirna；

(e)抑制crebzfmrna的翻譯的試劑；

(f)特異性識別crebzf基因的導向核酸并進行剪切以降低其表達水平的試劑；和

(g)用于部分或全部敲除crebzf基因的試劑

在一個或多個實施方案中，所述降低對象所表達的crebzf蛋白的活性的試劑為crebzf蛋白的特異性抗體或具有抑制活性的小分子化合物。

本文第二方面提供一種核酸序列，選自：

(1)含有crebzf基因、loxp位點和frt-neo-frt位點的核酸序列；和

(2)(1)所述序列的互補序列。

在一個或多個實施方案中，所述核酸序列還可進一步地含有同源臂序列。

在一個或多個實施方案中，所述核酸序列從5’到3’依次含有loxp位點、crebzf基因、frt-neo-frt位點和loxp位點。

在一個或多個實施方案中，所述核酸序列從5’到3’依次含有同源臂、loxp位點、crebzf基因、frt-neo-frt位點、loxp位點和同源臂。

在一個或多個實施方案中，所述同源臂與loxp位點之間、loxp位點與crebzf基因、frt位點與loxp位點之間以及loxp與同源臂位點之間可具有任選的連接序列。

在一個或多個實施方案中，所述各基因、位點和連接序列的序列如seqidno:9所示。

本文第三方面提供一種載體，其含有本文所述的核酸序列。

在一個或多個實施方案中，所述載體用于同源重組。

本文第四方面還提供一種經基因工程改造的宿主細胞，所述宿主細胞轉入了本文所述的載體，并在其基因組中含有本文所述的從5’到3’依次含有loxp位點、crebzf基因、frt-neo-frt位點和loxp位點的核酸序列。

在一個或多個實施方案中，所述宿主細胞為非人哺乳動物細胞。

在一個或多個實施方案中，所述宿主細胞為嚙齒類動物的細胞。

在一個或多個實施方案中，所述宿主細胞為人的體細胞或非人哺乳動物的胚胎干細胞及體細胞。

本文第五方面還提供一種構建轉基因小鼠的方法，所述方法包括：

(1)提供本文所述的載體；

(2)將所述載體轉入小鼠胚胎干細胞中，篩選獲得同源重組的胚胎干細胞克隆；

(3)將步驟(2)獲得的胚胎干細胞注射到小鼠囊胚中，并將該囊胚轉入假孕母鼠中，獲得雄性嵌合體小鼠；

(4)將步驟(3)獲得的雄性嵌合體小鼠與野生型雌性小鼠交配，獲得帶有flox位點的crebzf等位基因小鼠；

(5)將步驟(4)獲得的帶有flox位點crebzf的等位基因小鼠與albumin-cre或ellacre轉基因小鼠雜交，得到第一代雜合子小鼠，然后采用雜合子小鼠進行第二代自交，從而獲得純合的敲除小鼠，即所述轉基因小鼠。

在一個或多個實施方案中，該構建方法還包括使步驟(5)獲得的純合的敲除小鼠與該步驟獲得的純合的對照小鼠交配，從而擴大純合的敲除小鼠的種群。

在一個或多個實施方案中，該轉基因小鼠的特征是，全身或肝臟不表達crebzf蛋白、或與對照動物相比crebzf蛋白的表達量降低、或表達無活性的crebzf蛋白或活性降低的crebzf蛋白。

因此，本文第六方面也提供一種轉基因小鼠，所述轉基因小鼠的全身或肝臟不表達crebzf蛋白、或與對照動物相比crebzf蛋白的表達量降低、或表達無活性的crebzf蛋白或活性降低的crebzf蛋白。

本文第七方面還提供crebzf基因或蛋白作為靶點在篩選治療或預防代謝性疾病或癥狀的藥物中的應用，或用作分子指標在臨床上用診斷胰島素抵抗、2型糖尿病、高血脂癥、肥胖和脂肪肝等代謝綜合征的病程發展。

本文第八方面提供檢測crebzf基因或蛋白的試劑在制備用于診斷代謝性疾病或判斷代謝性疾病病程發展的試劑盒中的應用。

本文第九方面提供一種檢測試劑盒，所述檢測試劑盒含有檢測crebzf基因和/或蛋白的試劑。

附圖說明

圖1：crebzf肝特異性敲除的小鼠的構建以及鑒定。(a)構建帶有flox位點crebzf等位基因小鼠以及crebzf肝特異性敲除的小鼠模式圖(b)鑒定crebzfflox小鼠使用f1和r1pcr分別產生的目的片段是248bp；鑒定alb-cre的目標片段大小為100bp。

圖2：crebzf肝特異性敲除的小鼠的構建以及鑒定。(a)四個月實驗處理后小鼠體重。*代表與chowdiet組相比有顯著性差異p<0.05，#代表與hfhs組的crebzflko組和crebzfwt組相比有顯著性差異p<0.05，下同。(b)實驗處理期間小鼠體重變化。bar代表標準誤(實驗中小組中小鼠數量為n＝8，8，12，12)。(c)小鼠體成分分析，各組小鼠脂肪與瘦肉(fatmass，leanmass)所占體重比。

圖3：crebzflko小鼠可以改善高脂高糖飲食誘導的小鼠肝臟脂肪沉積，降低小鼠血清和肝臟中甘油三酯水平。(a)不同處理組小鼠肝he染色和油紅o染色，所有的小鼠切片的染色都是觀察大于8張的結果得出。(b)小鼠肝臟中甘油三酯和總膽固醇檢測結果(p<0.05)。(c)小鼠血漿中甘油三酯和總膽固醇檢測結果(p<0.05)。

圖4：crebzf肝臟特異性敲除的小鼠對高脂高糖飲食誘導肥胖小鼠血糖以及葡萄糖的耐受性的影響。(a)不同處理組小鼠肝禁食血糖(p<0.05)。(b，c)正常飲食組和高脂高糖飲食誘導的小鼠組的葡糖糖耐受性測試(gtt)。

圖5：crebzf肝臟特異性敲除的小鼠對高脂高糖飲食誘導肥胖小鼠脂質相關基因的影響。(a)正常飲食和高糖高脂飲食誘導肥胖小鼠肝臟中srebp-1、fas的表達水平。(b)高糖高脂飲食誘導肥胖小鼠肝中ising-2amrna的表達水平(p<0.05)。(c)高糖高脂飲食誘導肥胖小鼠肝臟中srebp-1c的mrna的水平(p<0.05)。(d)高糖高脂飲食誘導肥胖小鼠肝臟中脂肪酸和甘油三酯合成相關的關鍵基因的mrna的水平(p<0.05)。

具體實施方式

應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成優選的技術方案。

本文通過構建肝臟特異性敲除crebzf的小鼠模型，通過高脂肪高蔗糖飲食誘導的疾病模型來探究肝臟中crebzf在營養過剩的情況下中所起的作用和生物學功能。本文發現，肝臟特異性敲除crebzf顯著的減緩高脂高糖飲食誘導的小鼠體重增加，降低血糖血脂，改善小鼠肝臟脂肪沉積，增加葡萄糖耐受性，減緩肝細胞脂質堆積。所以通過一定的技術或者藥物手段，以crebzf為靶點，敲減或者抑制其活性，將能夠有效降低糖尿病、心血管疾病、肥胖和脂肪肝的發病機率。

因此，本文涉及以crebzf為靶點減緩對象高脂高糖飲食誘導的體重增加，降低對象血糖血脂，改善對象肝臟脂肪沉積，增加對象葡萄糖耐受性，和/或減緩對象肝細胞脂質堆積，以有效降低糖尿病、心血管疾病、肥胖和/或脂肪肝的發病機率或治療這些代謝性疾病。

本文中，crebzf是activationtranscriptionfactor/campresponseelement-bindingprotein(atf/creb)家族的堿性亮氨酸轉錄因子。本文包括各種被本領域定義為crebzf的堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子，例如來自不同物種的crebzf。所述不同物種包括但不限于哺乳動物和嚙齒類動物，例如鼠類。人crebzf的編碼基因位于人第11號染色體上，具體的染色體區段是11q14.1，在ncbi中的登陸號為af039942.1(基因序列)和aad28325.1(氨基酸序列)。小鼠(musmusculus)crebzf的編碼基因位于其第7號染色體上，具體的染色體區段是7e1，其氨基酸序列在ncbi中的登陸號為np_660133，基因編號是233490。

本文中，“對象”指各種需要包括但不限于哺乳動物和嚙齒類動物，例如人和鼠。

本文通過抑制crebzf蛋白的活性而實現上述目的。可通過如下方式實現crebzf蛋白活性的抑制：

(1)減少對象crebzf蛋白表達；和/或

(2)降低對象所表達的crebzf蛋白的活性；

減少對象crebzf蛋白表達包括但不限于抑制crebzf蛋白的編碼基因的表達或將其該基因的表達水平。例如，可給予抑制crebzf基因表達或降低其表達水平的試劑，這些試劑包括：抑制該crebzf基因轉錄活性的試劑，抑制該crebzfmrna的轉錄水平的試劑，促進crebzfmrna降解的試劑，針對該crebzf基因的sirna，抑制crebzfmrna的翻譯的試劑，和特異性識別crebzf基因的導向核酸并進行剪切以降低其表達水平的試劑。在某些實施方案中，可通過給予crebzf基因的sirna來抑制crebzf基因表達或降低其表達水平。在其他實施方案中，可通過給予打靶載體將crebzf全基因敲除，從而實現crebzf基因表達的抑制或降低。降低crebzf蛋白活性的試劑可以是例如crebzf的特異性抗體或具有抑制活性的小分子化合物。

在某些實施方案中，也可通過在crebzf蛋白中引入突變而使其活性降低。本文中，crebzf蛋白的活性尤其是指其在本文中所述的介導代謝性疾病的活性。因此，在某些實施方案中，在crebzf蛋白的功能域中引入致其相應活性減弱或喪失的突變。突變可以是1個或數個甚至更多(例如10個以上、20個以上、30個以上)個氨基酸的插入、缺失或取代。可通過給予作用于crebzf基因的試劑，使其所編碼的crebzf蛋白的功能域中存在導致其相關生物學活性減弱或喪失的突變。這類試劑可改變crebzf基因的序列，導致所編碼的crebzf蛋白存在相應的突變，從而具有減弱的活性，或活性喪失。例如，可通過同源重組技術用突變的crebzf基因替換野生型細胞中的crebzf基因，從而導致其表達除弱活性或無活性的crebzf蛋白。

因此，本文包括以下試劑的制藥用途：

(1)減少對象crebzf蛋白的表達的試劑；和/或

(2)降低對象所表達的crebzf蛋白的活性的試劑。

減少對象crebzf蛋白的表達的試劑包括前文所述的抑制crebzf基因表達或降低其表達水平的試劑，而降低對象所表達的crebzf蛋白的活性的試劑包括前文所述的降低crebzf蛋白活性的試劑。

這類試劑可用于預防和/或治療由crebzf蛋白介導的代謝性疾病或癥狀。本文中，由crebzf蛋白介導的代謝性疾病包括但不限于胰島素抵抗、糖尿病(尤其是2型糖尿病)、高血脂癥、肥胖和脂肪肝等代謝綜合征。所述癥狀可包括高脂高糖飲食誘導的體重增加，高血糖，高血脂，肝臟脂肪沉積，低葡萄糖耐受性，和/或肝細胞脂質堆積等。應理解的是，可采用本領域公認標準判斷對象血糖是否為高血糖，血脂是否為高血脂，以及葡萄糖耐受是否為低葡萄糖耐受。在某些方面，所述代謝性疾病或癥狀是營養過剩引起。因此，可使用這些試劑制備降糖藥、降血脂藥、減肥藥和/或降脂肪肝等預防和/或治療代謝綜合征或減輕其癥狀的藥物，用于預防和/或治療糖尿病、心血管疾病、肥胖和/或脂肪肝，或用于降低體重、血糖、血脂、肝臟脂肪沉積、肝細胞脂質堆積和/或增加葡萄糖耐受性。

所述藥物除含有治療或預防有效量的所述試劑外，還可含有藥學上可接受的載體或賦形劑。在某些實施方案中，本文所述的藥物是肝靶向的藥物。

本文中，降低crebzf蛋白的活性包括使crebzf蛋白的活性與其對應的野生型蛋白相比降低至少30％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，甚至完全無活性。

本文也包括治療或預防本文所述的代謝性綜合征或所述的癥狀的方法，所述方法包括給予有此需要的對象治療或預防有效量的下述試劑：

(1)減少對象crebzf蛋白的表達的試劑；和/或

(2)降低對象所表達的crebzf蛋白的活性的試劑。

本文也提供一種動物模型，該動物模型優選為嚙齒類動物模型，尤其是鼠類。該動物模型的特征是，全身或肝臟中不表達crebzf蛋白、或與對照動物相比crebzf蛋白的表達量降低、或表達無活性的crebzf蛋白或活性降低的crebzf蛋白。在某些實施方案中，該動物模型是肝特異性敲除crebzf的轉基因小鼠。

可利用帶有flox位點的crebzf等位基因小鼠和albumin-cre轉基因小鼠(alb-cretg)雜交來構建所述肝特異性敲除crebzf的轉基因小鼠。具體而言，可如下構建所述肝特異性敲除crebzf的轉基因小鼠：

(1)構建帶有crebzf基因、loxp位點、frt-neo-frt位點和兩側同源臂的質粒；

(2)將步驟(1)的質粒轉入小鼠胚胎干細胞中，篩選獲得同源重組的胚胎干細胞克隆；

(3)將步驟(2)獲得的胚胎干細胞注射到小鼠囊胚中，并將該囊胚轉入假孕母鼠中，獲得雄性嵌合體小鼠；

(4)將步驟(3)獲得的雄性嵌合體小鼠與野生型雌性小鼠交配，獲得帶有flox位點的crebzf等位基因小鼠；

(5)將步驟(4)獲得的帶有flox位點crebzf的等位基因小鼠與albumin-cre轉基因小鼠雜交，得到第一代雜合子小鼠，然后采用雜合子小鼠進行第二代自交，從而獲得純合的敲除小鼠，即所述小鼠模型。

在某些實施方案中，所述步驟(5)還獲得純合的對照小鼠，該構建方法還包括使步驟(5)獲得的純合的敲除小鼠與純合的對照小鼠交配，從而擴大純合的敲除小鼠的種群。

在某些實施方案中，利用ellacre(編號003724，名稱b6.fvb-tg(eiia-cre)c5379lmgd/j，來自jackson公司)與所述帶有flox位點的crebzf等位基因小鼠雜交，構建全身敲除crebzf的小鼠(crebzfko)。

作為示范性的例子，crebzf基因的序列可如seqidno:9的第5383－7516位堿基序列所示；同源臂區域可如seqidno:9第142－5312位和第9661－12661位堿基序列所示；loxp位點可如seqidno:9第5329－5362位和第9598－9631位堿基序列所示；frt-neo-frt位點可如seqidno:9第7517－7579位堿基序列所示，其中neo盒子位于第7564－9545位。應理解，可利用本領域熟知的技術和序列來構建上述構建方法步驟(1)的質粒。質粒中還可含有其它本領域熟知的調控元件，以利于該crebzf基因整合如胚胎干細胞的基因組中。另外，可利用本領域熟知的各種實驗小鼠構建所述帶有flox位點的crebzf等位基因小鼠，這類小鼠包括但不限于c57bl/6j小鼠。

可采用類似的方法構建其它動物模型。

在某些方面，本文也提供一種核酸序列，所述核酸序列含有crebzf基因、loxp位點和frt-neo-frt位點。在某些實施方案中，所述核酸序列從5’到3’依次含有loxp位點、crebzf基因、frt-neo-frt位點和loxp位點。所述核酸序列還可進一步地含有同源臂序列。在這些實施方案中，所述核酸序列從5’到3’依次含有同源臂、loxp位點、crebzf基因、frt-neo-frt位點、loxp位點和同源臂。在某些實施方案中，同源臂與loxp位點之間、loxp位點與crebzf基因、frt位點與loxp位點之間以及loxp與同源臂位點之間可具有任選的連接序列。這些連接序列的序列可如本文seqidno:9第5313-5328位堿基序列、第5363-5382位堿基序列、第9580-9597位堿基序列或第9632-9660位堿基序列所示。

本文的核酸序列可包含于質粒或載體中。特別優選地，該質粒或載體為用于同源重組的質粒或載體。質粒或載體中還可含有其它利于在宿主細胞中同源重組的元件。可采用本領域周知的方法構建本文所述的質粒或載體。

可使用本文的質粒或載體轉化宿主細胞，以獲得經基因工程改造的宿主細胞，該宿主細胞轉入了本文所述的載體，并在其基因組中有本文所述的從5’到3’依次含有loxp位點、crebzf基因、frt-neo-frt位點和loxp位點的核酸序列。所述宿主細胞可以是哺乳動物細胞和嚙齒類動物細胞，可以是胚胎干細胞、多能干細胞或體細胞。在某些實施方案中，所述宿主細胞不是人胚胎干細胞。在某些實施方案中，所述宿主細胞是非人哺乳動物細胞，包括其胚胎干細胞和體細胞，例如可以是嚙齒類動物的胚胎干細胞和體細胞。在某些實施方案中，所述宿主細胞是人的體細胞。在某些實施方案中，所述宿主細胞是原代肝細胞、脂肪細胞或小鼠胚胎成纖維(mef)細胞。

本文還涉及crebzf基因或蛋白作為靶點在篩選治療或預防代謝性疾病或癥狀的藥物中的應用，包括但不限于篩選用于預防和/或治療糖尿病、心血管疾病、肥胖和/或脂肪肝的藥物，或用于降低體重、血糖、血脂、肝臟脂肪沉積和/或肝細胞脂質堆積和或增加葡萄糖耐受性的藥物。具體而言，可以crebzf蛋白或基因作為分子靶標，篩選出能抑制其活性或者表達水平的分子，該分子可以是新的小分子化合物，也可以是已知的化合物。可利用表達或不表達crebzf的細胞，如原代肝細胞、脂肪細胞或小鼠胚胎成纖維(mef)細胞通過熒光素酶報告基因實驗、葡萄糖吸收實驗或脂肪酸合成實驗進行所述篩選。例如，可利用已經克隆成功的crebzf啟動子報告基因(crebzf-luc)，通過熒光素酶報告基因實驗在轉入了該啟動子報告基因的原代肝細胞、脂肪細胞或者mef細胞中進行高通量篩選，選擇能夠抑制crebzf-luc轉錄活性的試劑，作為抑制crebzf基因表達的試劑。seqidno：10為本文將crebzf啟動子報告基因克隆到pgl3-basic中后獲得的表達載體(pgl3-basic-mcrebzf-luc)的核苷酸序列，其中，第27-2126位啟動子序列。或者，可利用crebzf⁺/⁺和crebzf^-/^-小鼠的原代肝細胞、脂肪細胞或者mef細胞，利用熒光標記的2-nbdg(2-[n-(7-硝基苯-2-噁-1,3-二唑-4-基)氨基]-2-脫氧-d-葡萄糖，invitrogen)，通過葡萄糖吸收實驗進行高通量篩選，選擇能夠在crebzf⁺/⁺細胞中增加葡萄糖吸收，而在crebzf^-/^-細胞中沒有該作用的試劑，作為潛在的抑制crebzf基因表達或降低其表達水平的試劑。又或者，可利用crebzf⁺/⁺和crebzf^-/^-小鼠的原代肝細胞、脂肪細胞或者mef細胞，通過bodipy(d3922，molecularprobes,carlsbad,calif,usa)熒光標記的脂肪酸合成實驗進行高通量篩選，選擇能夠在crebzf⁺/⁺細胞中抑制脂質合成或者積累，而在crebzf^-/^-細胞中沒有該作用的試劑，作為潛在的抑制crebzf基因表達或降低其表達水平的試劑。上述這類試劑包括但不限于小分子化合物、sirna和多肽。應理解的是，crebzf^-/^-小鼠的原代肝細胞可來自本文所述的肝特異性敲除crebzf的轉基因小鼠和全身敲除crebzf的小鼠，而crebzf^-/^-小鼠的脂肪細胞和mef細胞則可來自全身敲除crebzf的小鼠。

crebzf基因或蛋白還可用作分子指標，在臨床上用于診斷胰島素抵抗、2型糖尿病、高血脂癥、肥胖和脂肪肝等代謝性疾病的病程發展。因此，在某些實施方案中，本文涉及檢測crebzf基因或蛋白的試劑在制備用于診斷代謝性疾病或判斷代謝性疾病病程發展的試劑盒中的應用。這類試劑包括但不限于用于檢測crebzf基因的各種引物和探針，和/或用于檢測crebzf蛋白的特異性抗體等，這類試劑和包括在制作含crebzf基因或蛋白的樣品以及實施檢測過程中使用的其它試劑，如溶劑等，包括但不限于實施pcr等所需的各種試劑。

因此，本文也提供一種檢測試劑盒，所述檢測試劑盒含有前文所述的檢測crebzf基因和/或蛋白的試劑，包括但不限于擴增和檢測crebzf基因所需的引物和探針以及crebzf蛋白的特異性抗體。通過試劑盒快速檢測crebzf的水平，衡量其水平的高低，可作為代謝性疾病判斷的一個備選指標。通常，若檢測到對象crebzf基因的表達水平和/或crebzf蛋白的活性高于正常人群crebzf基因的表達水平和/或crebzf蛋白的活性，則可初步判斷該對象患有代謝性疾病的風險增加或可能患有代謝性疾病。

下文將以具體實施例的方式產生本發明。應理解，這些實施例僅僅是闡述性的，并非意圖用以限制本發明的范圍。實施例中所用到的方法和材料，除非另有說明，否則為本領域常規的方法和材料。

一、材料與儀器

1、實驗動物和食物

帶有flox位點crebzf等位基因小鼠的產生：帶有flox位點的crebzf等位基因小鼠是由賽業公司制作(cyagen，china)。簡而言之，在體外構建一個crebzf基因1062bp個堿基的開放閱讀框(orf)序列以及一個loxp位點和一個frt-neo-frt位點和兩側的同源臂區域(seqidno:9：第142－5312位和第9661－12661位堿基序列為同源臂區域；第5329－5362位和第9598－9631位堿基序列為loxp位點；第5383－7516位堿基序列為cko區域；第7517－7579位堿基序列為frt-neo-frt位點，其中neo盒子位于第7564－9545位；其余為載體骨架的連接序列；外顯子序列在第5383－7516位和第9661－12661位)，克隆到目標質粒上(基因敲除質粒ploxpfneofloxp由賽業公司構建保存，原始質粒來源于pgem-teasyvector，購自promega公司)，通過限制性內切酶swal把質粒線性化，然后通過電穿孔儀把體外構建好的含有目的基因片段的序列導入到胚胎干細胞中(ab1，129/svev)，通過藥物抗性篩選es細胞克隆。使用以下neo探針：

neoprobe-f：tcatctcaccttgctcctgc(seqidno:1)

neoprobe-r：aaggcgatagaaggcgatgc(seqidno:2)

采用southernblot技術對細胞的基因組進行檢測，篩選出同源重組的es細胞克隆，并將篩選出同源重組的es細胞克隆注射到c57bl/6(b6)的囊胚中，將注射好的囊胚按照標準程序轉移到假孕的母鼠(c57bl/6j)輸卵管中，待嵌合體的小鼠出生之后，根據毛色判斷是否為嵌合體以及嵌合體的程度大小，并把雄性嵌合體小鼠和野生型的雌性小鼠c57bl/6j交配。通過flp介導的同源重組得到在crebzfcko(conditionalknockout)兩端含有flox位點的目的小鼠，即所述帶有flox位點crebzf等位基因小鼠。

肝特異性敲除crebzf的小鼠的產生：肝特異性敲除crebzf的小鼠(crebzflko)是通過帶有flox位點crebzf等位基因小鼠和albumin-cre轉基因小鼠(alb-cretg，獲自美國jackson公司，小鼠品名為b6.cg-tg(alb-cre)21mgn/j，小鼠貨號為：003574)雜交，得到第一代雜合子小鼠，然后采用雜合子小鼠進行第二代自交，得到少量純合的敲除小鼠crebzflko(crebzfflox^+/+cre^+/-)和純合的對照小鼠crebzfwt(crebzfflox^+/+cre^-/-)。通過得到的敲除小鼠和對照小鼠交配，擴大種群數量，得到足夠數量的可供實驗的小鼠。基因型鑒定crebzfflox的引物有兩對，分別如下：

f1：gcttgcagtttagagagaaacagc(seqidno:3)

r1：cagccagagtatcgcgagattc(seqidno:4)

f2：ttgacaataagtattgaggcatgcg(seqidno:5)

r2：tttccaacttctcaagtggtgaac(seqidno:6)

使用f1和r1引物進行pcr，分別產生的目的片段是248bp(野生型)和318bp(含有flox位點的crebzf突變型)，使用f2和r2引物進行pcr，分別產生的目的片段是157bp(野生型)和285bp(含有flox位點的crebzf突變型)。用來檢測alb-cre的引物是：

正向:gcggtctggcagtaaaaactatc(seqidno:7)

反向：gtgaaacagcattgctgtcactt(seqidno:8)

c57bl/6背景的八周齡雄性肝特異性crebzf敲除的小鼠(crebzflko)被隨機分為四組，其中兩組給予正常飲食(chow)誘導，另外對應兩組分別給予高脂高糖(hfhs)飲食飼養。

小鼠食用的高脂高糖飼料(hfhs)購買于美國researchdiet公司。

2、主要試劑、儀器和設備

主要試劑：甘油三酯檢測試劑盒(infinitytriglyceridesreagent，tg)、膽固醇檢測試劑盒(infinitycholesterolreagent，tc)購自thermoscientific公司；ultrasensitivemouseinsulinelisa試劑盒(mercodia)；血糖儀freestyle和血糖試紙(abbott)：重組人胰島素注射液(elilillyandcompany)；葡萄糖(sigma)。

使用儀器和設備：核磁共振(nmr)體成分分析(bruker磁共振脂肪含量測量儀mq7.5)；酶標儀(tecan-200-酶標儀infinite200pro)；4℃/-20℃冰箱購自海爾公司；超低溫冰箱購自thermoscientificforma公司；微量移液器購自rainin或者eppendorf公司；垂直電泳槽、濕轉轉膜儀和配套電源均購自bio-rad公司；冷凍離心機購自eppendorf公司；pcr儀購自bio-rad公司；實時熒光定量pcr系統abi7500fastreal-timepcrsystem購自appliedbiosystems公司。

3、動物分組

將八周齡的crebzflko雄性小鼠和匹配的crebzfwt雄性小鼠進行隨機分組，分組情況如表1：

表1：小鼠分組情況及處理方式

4、實驗小鼠模型構建

小鼠一直飼養在spf級動物房中，在22天斷奶后，依據小鼠雌雄進行分籠，小鼠可任意進食及飲水(上海實驗動物中心提供的標準食物)。動物房保持溫度22±3℃，濕度35±5％，12小時晝夜周期。所有實驗都是選用8周齡小鼠進行實驗。

5、小鼠指標測定和小鼠組織收集

(1)小鼠每周指標測定：每個星期測定小鼠的體重、進食量，并記錄數據。

(2)小鼠實驗處理三個月后測其空腹血糖。

(3)小鼠身體組分分析：利用核磁共振系統mini-specnuclearmagneticresonance(nmr)spectrometer(brukercorp)測定小鼠在清醒、自由飲食狀態下的的身體組分，包括脂肪量(fatmass)、瘦組織量(leanmass)和體液成分(bodyfluid)等。

(4)小鼠處死：實驗四個月后將小鼠處死收取組織。

處死方法：采用異氟烷麻醉致小鼠深度昏迷，然后打開胸腔用1ml注射器進行心尖取血，血液放入含有抗凝劑的采血管中，4℃、3000rpm離心15min，取上清。取血后對小鼠腹側面拍照。快速摘取其肝臟，拍照后稱重。取肝臟肝大葉部分進行甲醛固定和冰凍(oct)包埋，用于觀察實驗小鼠肝臟病理性變化，剩余肝臟組織用于westernblot實驗和rt-pcr實驗。打開小鼠腹腔取出所有附睪脂肪，拍照稱重。

二、實驗結果

1、成功的構建了肝特異性crebzf敲除的小鼠

肝特異性crebzf敲除的小鼠的構建過程如前文和圖1(a)所示。肝特異性敲除crebzf的小鼠的鑒定結果如圖1(b)所示。使用引物seqidno:3和4進行pcr，分別產生的目的片段是248bp(野生型)和318bp(含有flox位點的crebzf基因型小鼠)，鑒定alb-cre的目標片段大小為100bp。使用引物seqidno:5和6進行pcr分別產生的目的片段是157bp(野生型)和285bp(含有flox位點的crebzf基因型小鼠)。

2、crebzf肝臟特異性敲除的小鼠可以減緩飲食誘導的小鼠體重增加

采用年齡匹配的八周齡小鼠(crebzfwt和crebzflko)進行實驗，按照分組分別給予普通正常飲食(chowdiet)和高脂高蔗糖飼料飲食(hfhsdiet)喂養。實驗四個月后測定各組小鼠的體重。結果發現實驗組crebzf肝特異性敲除小鼠可以減緩高脂高糖飲食誘導的體重增加(圖2，a)。實驗過程中，每周對小鼠體重進行測定，在正常飲食情況下，crebzflko小鼠和crebzfwt小鼠的體重沒有明顯區別；在hfhs喂養情況下crebzflko小鼠的體重的生長曲線明顯低于對照組(圖2，b)。同時我們采用核磁共振體成分分析儀(nmr)對各組小鼠的每只小鼠的脂肪量，瘦組織量進行活體分析測試。結果發現crebzflko小鼠在高脂高蔗糖飼料(hfhsdiet)喂養情況下可以顯著地降低脂肪量所占的體重比(圖2，c)。這說明肝臟特異性敲除的小鼠可以減緩飲食誘導的小鼠體重增加，同時也能減少體脂含量。同時我們在實驗期間，每周對小鼠進食量進行測定和計算，結果顯示實驗組和對照組的小鼠進食量沒有顯著性差異(結果未顯示在圖中)，說明實驗組小鼠體重的差異并不是由于進食量引起的。

3、crebzf肝臟特異性敲除的小鼠改善高脂高糖飲食誘導的小鼠肝臟脂肪沉積，降低小鼠血清和肝臟中甘油三酯和膽固醇水平

首先，我們把經過4％多聚甲醛48h固定的肝臟組織進行石蠟包埋切片，然后用蘇木精-伊紅染色(he染色)觀察小鼠肝臟病理變化。he染色結果顯示，在正常飲食喂養的情況下，小鼠肝索結構清晰，肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀分布，且肝細胞細胞中無明顯的脂肪堆積，細胞核清晰，胞漿均勻等，并且實驗組和對照組沒有顯著性差別(圖3，a)。在高脂喂養的情況下，對照組小鼠(crebzfwt)的he切片中肝臟肝索結構不明顯，肝細胞中出現大量空泡(脂滴)，但是實驗組小鼠(crebzflko)肝細胞空泡明顯少于對照組，肝細胞中脂滴堆積的情況得到明顯改善(圖3，a)。通過觀察脂滴的數量與大小可以看出，實驗組小鼠(crebzflko)在高脂高糖飲食情況下可以顯著的降低肝臟脂肪沉積。同時我們也通過對oct包埋的肝組織進行肝臟冰凍切片，之后對切片進行油紅染色(oilredstaining)，得到了相同的實驗結果(圖3，a)。所有實驗結果都是觀察大于8只不同小鼠的切片得出。

其次，我們利用甘油三酯(tg)和總膽固醇(tc)檢測試劑盒對小鼠肝臟和血清中的甘油三酯和總膽固醇進行測定。結果顯示，在正常飲食(chowdiet)喂養下，實驗組小鼠和對照組小鼠肝臟和血清中甘油三酯和膽固醇水平沒有顯著性差異，但是在高脂高糖飲食誘導的小鼠模型中，crebzflko組小鼠肝臟和血清中甘油三酯水平與對照組相比均顯著降低(p<0.05)(圖3，b、c)。同時我們也發現crebzflko組小鼠肝臟和血清中總膽固醇水平與對照組相比均顯著降低(p<0.05)(圖3，b、c)。由此說明，在肝臟中特異性敲除crebzf的情況下可以改善由高脂高糖飲食誘導的小鼠肝臟脂肪沉積，降低小鼠血清和肝臟中甘油三酯和膽固醇水平。

4、crebzf肝臟特異性敲除的小鼠對高脂高糖飲食誘導肥胖小鼠血糖以及葡萄糖的耐受性的影響

以上實驗證明，crebzf肝臟特異性敲除的小鼠對高脂高糖飲食誘導的肥胖小鼠腹部和肝臟中脂肪沉積、肝臟和血清甘油三酯水平和膽固醇水平有顯著的改善作用。同時我們也測定了各組小鼠對高脂高糖飲食誘導的肥胖的血糖以及葡萄糖的耐受性情況。

在飲食誘導實驗處理三月后，我們對各組小鼠禁食16h，測定其空腹血糖。結果發現，在正常飲食情況下實驗組和對照組小鼠血糖沒有顯著性變化(圖4，a)。在hfhs飲食誘導的情況下實驗組小鼠(crebzflko)空腹血糖與對照組小鼠(crebzfwt)相比顯著降低(p<0.05)(圖4，a)，同時通過對小鼠進行葡萄糖耐受實驗(gtt)，實驗結果表明在正常飲食情況下實驗組和對照組小鼠葡萄糖耐受性沒有顯著性變化(圖4，b)。在hfhs飲食誘導的情況下實驗組小鼠葡萄糖耐受性相比對照組顯著增加(p<0.05)(圖4，b、c，這說明在肝臟中特異性敲除crebzf可以顯著改善由高脂高糖飲食誘導的葡萄糖耐受性降低的表型。這些結果證明，肝臟中特異性敲除crebzf不僅可以改善高脂高糖飲食誘導的高血脂，而且也可以起到調節血糖穩態的作用。

5、crebzf肝臟特異性敲除的小鼠對高脂高糖飲食誘導肥胖小鼠脂質相關基因的影響

為了研究crebzf肝臟特異性敲除對改善高脂飲食誘導的肥胖小鼠代謝的分子機制，我們提取小鼠肝臟組織蛋白進行westernblot測試分析，同時提取肝組織rna，反轉得到cdna，進行rt-pcr實驗。如圖5(a)所示，crebzf肝臟特異性敲除組在喂養高脂高糖(hfhs)時激活形式的n-srebp-1(sterolregulatoryelementbindingproteins1)表達量顯著降低，同時它調控脂肪生成的下游基因脂肪酸合成酶(fattyacidsynthase,fas)的表達也顯著減少。該結果表明crebzf肝臟特異性敲除之后可以通過降低脂肪酸合成而降低脂肪肝。另外，我們也通過rt-pcr檢測發現，肝臟中crebzf效率可以達到80％，在肝臟特異性敲除crebzf之后，可以顯著性的增加insig-2a的mrna的水平(p<0.05)(圖5，b)，這也導致了srebp-1c的mrna的水平的顯著減少(p<0.05)(圖5，c)。同時我們也檢測了脂肪酸和甘油三酯合成相關的關鍵基因的mrna的水平，包括acly、acc1、fas、scd1、gpat1、dgat和dgat2，結果表明在肝臟特異性敲除crebzf之后這些關鍵基因的mrna的水平都顯著性降低(p<0.05)(圖5，d)。這些結果表明，在肝臟中特異性敲除crebzf可以降低hfhs飲食誘導的脂肪肝以及降低脂肪酸合成相關基因的表達，這可能是通過增加insig-2a的表達水平來抑制肝脂肪的生成。

三、討論

本文首次成功構建了肝特異性敲除crebzf的小鼠，這為之后更好的進行crebzf在體內生物學功能研究起到了非常關鍵的作用，尤其是在研究胰島素抵抗、2型糖尿病、高血脂癥、肥胖和脂肪肝等代謝綜合征模型的研究中起到非常重要的作用。利用該肝特異性敲除crebzf的小鼠，本文發現了堿性亮氨酸拉鏈(bzip)轉錄因子crebzf在營養過剩引起的代謝性疾病中的作用。在本文之前，關于crebzf的研究主要集中在其轉錄調控方面的分子調控機制，及其在生長和增殖方面的作用，而本文通過首次構建得到的肝特異性敲除的crebzf小鼠模型研究其在代謝調控方面的作用和機制，為其在代謝方面進行更加深入的研究提供了新的思路。

本文發現肝臟特異性敲除crebzf顯著的減緩高脂高糖飲食誘導的小鼠體重增加，降低血糖血脂，改善小鼠肝臟脂肪沉積，增加葡萄糖耐受性，同時肝臟病理切片也表明肝臟特異性敲除crebzf顯著的減緩肝細胞脂質堆積。并且還發現肝臟特異性敲除crebzf可以通過增加insig-2a的mrna的水平和降低脂質合成相關基因srebp-1的水平，同時crebzf肝臟特異性敲除喂養高脂高糖(hfhs)組的激活形式是n-srebp-1(sterolregulatoryelementbindingproteins1)表達量顯著降低，它調控脂肪生成的下游基因脂肪酸合成酶(fattyacidsynthase,fas)的表達也顯著減少，這說明敲除crebzf可以通過抑制脂肪酸從頭合成來降低脂肪肝。

在敲除肝臟crebzf情況下，除了能夠達到降糖的目的，同時它也附帶其他改善代謝的作用。因而通過肝臟靶向抑制crebzf有望獲得具有“glucoseplus”功效的降糖藥。因此，可以crebzf作為藥物靶點，研究出降糖的藥物，它將除了能夠單純的降糖之外，同時它還能夠改善代謝，這種藥物的應用前景會很大。另外，通過肝臟到脂肪組織的作用，具有高效減肥的效果。目前在肥胖的病人當中，單純針對脂肪組織的降脂，效果并不明顯。本文的實驗結果表明，在在肝臟中特異性的敲低crebzf，能夠顯著的降低小鼠體脂含量，這種通過肝臟進而靶向到脂肪的作用，從一定程度上來說，達到了高效降脂的作用。

根據本文的研究結果，可針對crebzf設計出特異性的藥物靶點，以crebzf作為分子靶標，設計小分子藥物來抑制其活性或者表達水平，從而使之成為預防和輔助治療過量飲食引起的代謝性疾病的一種新藥。另外也可以通過crebzf的活性或表達水平作為分子靶標來篩選現有的藥物，從眾多未知分子機制的潛在治療藥物中篩選出一種能夠更好的治療胰島素抵抗、2型糖尿病、高血脂癥、肥胖和脂肪肝等代謝綜合征的藥物。在臨床診斷方面，對待胰島素抵抗、2型糖尿病、高血脂癥、肥胖和脂肪肝等代謝綜合征的病人，肝臟中crebzf的臨床水平可以作為判斷其病程發展的一個潛在分子指標，同時也可以開發出crebzf相關的檢測試劑盒，通過試劑盒快速檢測crebzf的水平，衡量其水平的高低，作為其病癥判斷的一個備選指標。

序列表

<110>中國科學院上海生命科學研究院

<120>crebzf在治療、預防和診斷代謝性疾病中的應用

<130>174385

<160>10

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>1

tcatctcaccttgctcctgc20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>2

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<210>3

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

gcttgcagtttagagagaaacagc24

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

cagccagagtatcgcgagattc22

<210>5

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>5

ttgacaataagtattgaggcatgcg25

<210>6

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

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<400>6

tttccaacttctcaagtggtgaac24

<210>7

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>7

gcggtctggcagtaaaaactatc23

<210>8

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>8

gtgaaacagcattgctgtcactt23

<210>9

<211>12745

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>含crebzf基因、loxp位點和frt-neo-frt位點和兩側同源臂的序列

<400>9

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tcatataggtactcttgcaattatttggtgagtcccacaatggggaagaacaagtgtctc720

ctgacgcccagccggttggcttatgagaatgaaccccctcacaggtgtaccatcaagccc780

cagtcaaacctttgggtctttccccatatctgactaaactccatgagaataccagagtca840

tattgctgatccccttacacacacacacacacacacaccatatttgggcttttcacatct900

cacagttttaccacatggctgctataatcagtgacaaaaactcagcttaaaacaacagaa960

atgaattgcctccattccagaagctaaactcagaaatcaagctgtaggcaaggctgtgct1020

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acttttagcacttttggcttacaaacacgatgccccagttatctagtcaggttctcccca1140

ctgtatttctgtattgcctcaccatgtgtctttttcactgtttgcctctgcttcctcctc1200

tctcctactctttcttctctttttcttcctcttcctgccccccgccccccctttctttga1260

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ttggtgtctctgccttaagcctttccatgcaggatttcaggtgtgccctaccatgcccca1380

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gctaagtcccagatctcaaaagtgtttttatttttattttcatatttaaagtttttatta1500

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tctccttttaccttcatgtggttttgggggattggacagtcactcagcttgtacagcaag1680

actctttacctgctgagtgatgttgccatccttacccttgcaactttttaattatataag1740

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ttcccatttttcatgtagggttgagggattagaaaggatggagccacgtccttaacaact1860

attaccttcctcataaccagctgaagtcttcttagagtccatcaagttttgataccatct1920

tcgtcttttagtttcccaaatgaaaattttatatatacatatctcagagaggcattcaca1980

gtcttctccaaactgagaagtctattgttaaaggactgaatatctcacaggaaaaaaaaa2040

aagaaaaaaaaaaagaaagaaaaagaaaagattgtgttatgggaaaacaaagaatgctaa2100

caaagaaaatattgatctgctgcctgccattcattgattttcatgttgtattgcttgctt2160

gctacaaactgaaaaggattgtaatgacagtcagagtgcccatgatgttcttgtgcatgt2220

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tgttctaatcttctggttccttcccattttctggctcatctgcaacctgtctctctaaaa2640

ctgtaccagcaaaactgcctcctctctttcgctctgtgctgctcttttacgttcctgtgc2700

tattttcgtgagagttggaggtattctatctctgacctactctgtcagatattcctctga2760

ttcatcactttgtctgccactcaattagacatcattttcaaacatggccacacaaaatta2820

gtgtgtgtttatcctggaagagttaaaagtaattaaatgtgtaggaggcacggaaatcct2880

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aaagagacaccacccagaaagctgggagcaaaaatagcctggtaacatttactctgtgtg3000

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tctataaaatccatgtggtggtttgaatgtgcttggatcagggattggtaatattaggag3120

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