黃檗葉中黃柏苷抗肺癌中的醫用用途的制作方法

本發明公開一種黃檗葉中黃柏苷抗肺癌中的醫用用途，尤其涉及黃柏苷在制備抗肺癌藥物中的應用，屬于中醫制藥技術領域。

背景技術：

癌癥泛指惡性腫瘤，是世界第二大死亡原因。癌癥的誘因有很多，多年的流行病學研究及實驗和臨床觀察，發現環境與行為對人類癌癥的發生有重要影響。據估計約80%以上的癌癥與環境因素有關。各種環境和遺傳致癌因素可能以協同或序貫的方式引起細胞非致死性的dna損害，從而激活原癌基因或滅活腫瘤的抑制基因，加上凋亡調節基因和dna修復基因的改變，使細胞發生轉化。被轉化的細胞可先呈多克隆性增生，經過一個漫長的多階段演進過程，其中某個克隆相對無限制擴增，通過附加突變，選擇性形成不同特點的亞克隆，從而獲得浸潤和轉移能力，形成惡性腫瘤即癌癥。

目前，癌癥的治療方法主要包括：手術治療移除腫瘤細胞；化學或放射線治療殺死腫瘤細胞及抑制腫瘤細胞生長和分裂；靶向治療以特異性對抗癌細胞。大部分治療方法的機理為誘導細胞凋亡，破壞細胞遺傳物質，調控細胞周期，控制細胞增殖。

在全球，肺癌是最常見的癌癥之一，并且是導致癌癥相關的死亡率的主要原因。非小細胞肺癌（nsclc）占所有肺癌病例的80％以上。最廣泛使用的nsclc療法是化療，放療和手術。盡管療法有進步，但約85％的患者在診斷的5年內出現死亡，三分之一的iv期疾病患者的2年存活率<20％。因此，尋求有效的治療肺癌的方法迫在眉睫。

黃檗，是一種被稱為阿穆爾軟木樹的蕓香科闊葉樹，目前主要分布在中國東北，內蒙古，俄羅斯遠東，南方薩哈林，韓國和日本。黃檗樹高10-20米，樹皮呈灰褐色至黑灰色，葉柄纖細，卵狀披針形葉片，花序頂生，果呈圓球形。黃檗的樹皮具有發達的木栓層，柔軟而堅韌，質地美觀，是制造軟木塞的材料，亦可用于制作家具和工業藝術品。黃檗樹皮還是一種具有顯著藥用價值的中藥，在中國、日本和韓國被廣泛使用多年。許多報道表明，黃檗提取物具有抗炎和免疫刺激活性，同時，還起到降血壓、降血糖和保護心臟的作用。黃柏苷是一種廣泛分布于黃檗樹葉中的黃酮苷化合物。目前還沒有文獻公開過黃柏苷的抗肺癌應用。

技術實現要素：

本發明公開了黃檗葉中黃柏苷抗肺癌中的醫用用途，黃柏苷作為天然產物，毒性低、副作用小，故本研究為天然產物在抗腫瘤領域的應用提供了新的選擇。

黃柏苷在抗肺癌藥物中的應用。所述的黃柏苷結構式為:

。

本發明所述的黃柏苷為能夠抑制a549細胞增殖的藥物。

本發明所述的黃柏苷為能夠使細胞周期停滯在g2/m期的藥物。

本發明所述的黃柏苷為能夠誘導a549細胞凋亡的藥物。

本發明所述的黃柏苷為能夠破壞a549細胞內氧化-還原平衡的藥物。

本發明所述的黃柏苷為能夠上調細胞內bax/bcl-2相對表達水平的藥物。

本發明所述的黃柏苷為能夠降低細胞內線粒體膜電位的藥物。

本發明所述的黃柏苷為能夠激活細胞內caspase3活性的藥物。

本發明的積極效果在于：提供了黃柏苷具有抗肺癌活性，公開了其新的醫用用途，為黃柏苷這一天然產物在抗肺癌領域的應用提供了參考，具有良好的應用前景。同時，對于黃檗葉的利用還降低了其由于自身的化感作用對環境產生的不良影響，對保護黃檗種群具有積極作用。

附圖說明

圖1黃柏苷對a549細胞增殖能力的影響；

圖2黃柏苷對a549細胞周期的影響-流式圖（空白對照組）；

圖3黃柏苷對a549細胞周期的影響-流式圖（黃柏苷250μm）；

圖4黃柏苷對a549細胞周期的影響-流式圖（黃柏苷1000μm）；

圖5黃柏苷對a549細胞周期的影響-流式圖（黃柏苷2000μm）；

圖6黃柏苷對a549細胞周期的影響；

圖7黃柏苷對a549細胞凋亡的影響-流式圖（空白對照組）；

圖8黃柏苷對a549細胞凋亡的影響-流式圖（黃柏苷250μm）；

圖9黃柏苷對a549細胞凋亡的影響-流式圖（黃柏苷1000μm）；

圖10黃柏苷對a549細胞凋亡的影響-流式圖（黃柏苷2000μm）；

圖11黃柏苷對a549細胞凋亡的影響；

圖12黃柏苷對a549細胞sod活力的影響；

圖13黃柏苷對a549細胞gsh含量的影響；

圖14黃柏苷對a549細胞mda含量的影響；

圖15黃柏苷對a549細胞bax和bcl-2蛋白表達的影響-免疫印跡圖；

圖16黃柏苷對a549細胞bax蛋白表達的影響；

圖17黃柏苷對a549細胞bcl-2蛋白表達的影響；

圖18黃柏苷對a549細胞bax/bcl-2相對表達量的影響；

圖19黃柏苷對a549細胞線粒體膜電位的影響（黃柏苷0h）；

圖20黃柏苷對a549細胞線粒體膜電位的影響（黃柏苷6h）；

圖21黃柏苷對a549細胞線粒體膜電位的影響（黃柏苷12h）；

圖22黃柏苷對a549細胞線粒體膜電位的影響（黃柏苷24h）；

圖23黃柏苷對a549細胞caspase3活力的影響。

具體實施方式

實施例1

1.細胞培養

a549細胞于含10%（v/v）胎牛血清的dmem高糖培養基中，在37℃，5%co2，飽和濕度的培養箱中培養。根據不同的實驗要求分別培養于96孔板和6孔板中。

2.細胞藥物處理

將細胞用250μm，1000μm和2000μm的黃柏苷處理48h，用于mtt、細胞周期、細胞凋亡、sod、mda、gsh、caspase3活力和免疫印跡檢測。將細胞用2000μm的黃柏苷分別處理6h、12h和24h，用于線粒體膜電位檢測。

3.相關結果

（1）黃柏苷對a549細胞增殖起抑制作用。

mtt比色法是檢測細胞活力的一種常見方法，由于細胞活力與細胞數量呈正相關，因此，mtt法也常用于檢測細胞的增殖情況。如圖2所示，黃柏苷可以顯著抑制a549細胞的增殖，且這種抑制作用的強度對藥物呈現出劑量依賴性。當藥物濃度為2000μm時，黃柏苷對a549細胞的抑制率達到70.87%。

（2）黃柏苷阻滯a549細胞周期于g2/m期。

碘化丙啶（pi）可以與細胞內的dna和rna結合，當采用rna酶將rna消化后，通過流式細胞術檢測到的與dna結合的pi染料的熒光強度就直接反映了細胞內dna含量的多少。細胞周期各時相的dna含量不同，通常細胞在g1/g0期具有二倍體細胞的dna含量，在g2/m期具有四倍體細胞的dna含量，而在s期的dna含量介于二倍體和四倍體之間。因此，在用pi染色法檢測細胞周期分布時，可以通過軟件計算得到各時相細胞的百分率。

如圖1-圖6所示，用黃柏苷處理a549細胞48h后，對細胞進行pi染色，通過流式細胞術檢測細胞周期分布情況后發現，細胞在g2/m期的比例顯著上升，并且隨著藥物濃度的增加，g2/m期的細胞所占比例也逐漸增加，各組數據間具有統計學差異，即黃柏苷可以誘導a549細胞周期停滯在g2/m期，從而阻斷肺癌細胞分裂過程，使得細胞產生增殖障礙。

（3）黃柏苷誘導a549細胞凋亡。

在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（ps）只分布在細胞膜脂質雙層的內側，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂酰絲氨酸（ps）由脂膜內側翻向外側。annexinⅴ是一種ca²⁺依賴性磷脂結合蛋白，能與細胞凋亡過程中翻轉到膜外的ps高親和力特異性結合。將annexinⅴ與pi匹配使用，可以將凋亡早期的細胞和晚期的細胞以及死細胞區分開來。壞死細胞可以同時與annexinv-fitc和pi結合顯色，凋亡晚期的細胞也同時被fitc和pi結合染色呈現雙陽性，而pi由于不能透過完整的細胞膜則被排除在活細胞和早期凋亡細胞之外。

如圖7-圖11所示，用黃柏苷處理a549細胞48h后，對細胞進行annexinⅴ與pi雙染色，通過流式細胞術檢測發現，細胞出現不同程度的凋亡現象。并且隨著藥物濃度的增加，細胞的凋亡率也逐漸上升，當黃柏苷濃度為250μm、1000μm和2000μm時，a549細胞的凋亡率分別為13.27%、25.59%和84.32%，各組數據間具有顯著統計學差異。可見黃柏苷能誘導a549細胞發生凋亡，且這種誘導作用均具有劑量依賴性。

（4）黃柏苷破壞a549細胞內氧化-還原平衡。

超氧化物歧化酶（sod）和谷胱甘肽（gsh）是細胞內重要的抗氧化劑和自由基清除劑，丙二醛（mda）是脂質氧化的終產物。這三種物質可以直觀的反映出細胞內的氧化-還原平衡狀態。一旦機體內氧化與抗氧化作用失衡，產生大量氧化中間產物，導致一體化氧化速度超出機體抗氧化能力，便會造成機體組織損傷。

如圖12-圖14所示，通過比色法檢測，被黃柏苷處理48h后的a549細胞內sod活力顯著下降，gsh含量明顯降低，mda含量有所升高。且這種變化隨黃柏苷濃度的增加愈發明顯，最終sod活力下降至對照組的一半，gsh含量降低為對照組的三分之二，而mda含量升高至對照組的1.6倍。這說明黃柏苷可以破壞a549細胞內的氧化-還原平衡狀態，干擾細胞正常代謝，導致細胞氧化損傷，致使其產生氧化應激，進而導致細胞凋亡。

（5）黃柏苷上調a549細胞內bax/bcl-2相對表達水平。

在細胞凋亡的機制中，bcl-2家族是最著名的一方面，該家族包括抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白兩個主要成員。bcl-2是一種抗凋亡蛋白，它抑制細胞凋亡。bax是bcl-2家族的另一個成員，它是一種促凋亡蛋白，它誘導細胞凋亡。bax不僅可以本身形成同型二聚體，而且易與bcl-2蛋白形成異二聚體，從而使bcl-2失活，bax/bcl-2比率通常作為確定凋亡的指標。

如圖15-圖18所示，當a549細胞用黃柏苷處理48h后，利用免疫印跡法檢測了細胞內bax和bcl-2兩種因子的表達量變化，結果顯示細胞內bax蛋白的表達量明顯升高，同時，bcl-2蛋白的表達量顯著下降，且藥物濃度越大，此變化趨勢越明顯，當黃柏苷濃度為2000μm時，bax的表達量升高了3.3倍，而bcl-2的表達量卻下降了86%。由此可知，黃柏苷能夠使a549細胞內bax蛋白和bcl-2蛋白表達量的比值呈劑量依賴性上升，進而導致細胞發生凋亡。

（6）黃柏苷降低a549細胞線粒體膜電位。

線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。jc-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位的理想熒光探針。可以檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位。在線粒體膜電位較高時，jc-1聚集在線粒體的基質中，形成聚合物，可以產生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時，jc-1不能聚集在線粒體的基質中，此時jc-1為單體，可以產生綠色熒光。這樣就可以方便地通過熒光顏色的轉變來檢測線粒體膜電位的變化。

如圖19-圖22所示，通過jc-1染色和熒光顯微鏡觀察發現，在對照組中，由于正常細胞的線粒體膜電位較高，因此大多呈現紅色熒光，當對a549細胞用2000μm黃柏苷處理不同時間后，細胞的綠色熒光逐漸增多，即細胞的線粒體膜電位開始下降，且這種作用呈現出時間依賴性增強。因此，黃柏苷可以明顯降低a549細胞的線粒體膜電位。

（7）黃柏苷激活a549細胞內caspase3活性。

已有研究證實胱天蛋白酶是凋亡途徑的中心執行者，在細胞凋亡的啟動和執行中起中心作用。其中caspase3被鑒定為哺乳動物細胞凋亡的關鍵介質，出現在凋亡的最后階段。

如圖23所示，通過比色法檢測發現，經黃柏苷處理的a549細胞內caspase3活性顯著升高，且藥物濃度越大，caspase3活性越高，與對照組相比，經2000μm黃柏苷處理后的細胞caspase3活性提高了31%。由此可見，黃柏苷可以激活a549細胞內caspase3活性，從而誘導細胞凋亡。

4.結論

（1）黃柏苷能夠抑制a549細胞增殖，阻滯細胞周期，干擾細胞分裂，損傷細胞遺傳物質。

（2）黃柏苷能夠上調a549細胞內bax因子的表達，同時下調bcl-2因子的表達，并且激活caspase3，引起細胞凋亡。

（3）黃柏苷能夠降低a549細胞內抗氧化酶活性使細胞處于氧化應激狀態，影響線粒體氧化呼吸鏈的功能，降低線粒體膜電位，導致細胞無法進行正常代謝活動，最終發生凋亡。

通過以上實驗結果證明，黃柏苷能夠誘導a549細胞凋亡，具有顯著的抗肺癌活性，并且作為天然產物，具有毒性低、副作用少的優點，因此本發明為天然產物在抗腫瘤領域的應用提供了新的選擇。