本申請是2011年4月12日提交的發明名稱為“5-位修飾的嘧啶和它們的用途”的中國專利申請201180028946.3的分案申請。相關申請本申請要求2010年4月12日提交的美國臨時申請61/323,145的權益，將其通過援引全部加入本文。本公開內容涉及核酸化學領域，具體地涉及5-位修飾的尿苷及其亞磷酰胺和三磷酸酯衍生物。本公開內容還涉及其制備和使用方法。本公開內容包括修飾的核苷作為寡核苷酸或適體的一部分的用途。
背景技術：
：：下面的描述提供了與本公開內容有關的信息的總結，且不是承認：在本文中提供的任何信息或引用的任何出版物是本公開內容的現有技術。已經非常關注開發修飾的核苷作為治療劑、診斷劑和用于摻入寡核苷酸中。例如，修飾的核苷(諸如azt、ddi、d4t等)已經被用于治療aids。5-三氟甲基-2'-脫氧尿苷對皰疹性角膜炎是有效的，5-碘-1-(2-脫氧-2-氟-b-d-阿拉伯呋喃糖基)胞嘧啶具有抗cmv、vzv、hsv-1、hsv-2和ebv的活性(atextbookofdrugdesignanddevelopment,povlkrogsgaard-larsen和hansbundgaard編,harwoodacademicpublishers,1991,第15章)。修飾的核苷已經在診斷用途中表現出實用性。在這些用途中，將所述核苷摻入dna中的可檢測的位置，并使用各種診斷方法來檢測修飾的核苷的位置。這些方法包括：放射性標記、熒光標記、生物素化和鏈裂解。鏈裂解的一個實例包括：使所述核苷與肼反應，以產生脲核苷，然后使所述脲核苷與哌啶反應，以造成鏈裂解(maxam-gilbert方法)。還已經將修飾的核苷摻入寡核苷酸中。存在幾種可以將寡核苷酸用作治療劑的方法。反義寡核苷酸可以結合生物體中的某些遺傳編碼區，以阻止蛋白的表達，或阻斷各種細胞功能。此外，稱作selex方法或指數富集的配體系統進化的方法使本領域技術人員能夠鑒別和制備選擇性地結合靶分子的寡核苷酸(稱作“適體”)。所述selex方法描述在美國專利5,270,163中，其內容通過援引加入本文。所述selex方法包括：從候選物的混合物中選擇寡核苷酸，以實現基本上任意的希望的結合親和力和選擇性標準。從寡核苷酸的隨機混合物開始，所述方法包括：在有利于結合(或相互作用)的條件下使所述混合物接觸靶，將未結合的寡核苷酸和已經與靶分子結合(或相互作用)的寡核苷酸分開，解離寡核苷酸-靶對，擴增從所述寡核苷酸-靶對解離出的寡核苷酸，以產生配體富集的寡核苷酸混合物，然后通過如所希望的多個循環，重復所述結合、分開、解離和擴增的步驟。可以將修飾的核苷摻入在selex方法中使用的或由selex方法鑒別出的反義寡核苷酸、核酶和寡核苷酸中。這些核苷可以賦予所述寡核苷酸對內切核酸酶和外切核酸酶的體內和體外穩定性，改變所述分子的電荷、親水性或親脂性，和/或提供三維結構的差異。以前已經描述的核苷的修飾包括：2'-位糖修飾、5-位嘧啶修飾、8-位嘌呤修飾、在環外胺處的修飾、4-硫代尿苷的取代、5-溴或5-碘-尿嘧啶的取代、主鏈修飾和甲基化。修飾還包括3'和5'修飾諸如加帽。pctwo91/14696(通過援引加入本文)描述了化學修飾反義寡核苷酸以增強向細胞中的進入的方法。美國專利5,428,149、5,591,843、5,633,361、5,719,273和5,945,527(它們通過援引整體加入本文)描述了通過鈀偶聯反應來修飾嘧啶核苷。在有些實施方案中，使親核試劑和一氧化碳與嘧啶核苷偶聯(所述嘧啶核苷含有在嘧啶環的5-位上的離去基)，優選地形成酯和酰胺衍生物。已經使用多種方法來提供抗外切核酸酶降解的寡核苷酸。pctwo90/15065描述了制備外切核酸酶抗性的寡核苷酸的方法，其中將2個或更多個亞磷酰胺、單硫代磷酯和/或二硫代磷酯鍵摻入在寡核苷酸的5'和/或3'末端處。pctwo91/06629公開了在相鄰核苷之間具有一個或多個磷酸二酯鍵的寡核苷酸，所述磷酸二酯鍵通過形成能夠結合rna或dna的縮醛/縮酮型鍵而被替代。有利的是，提供用于治療和診斷用途并用于包含在寡核苷酸中的新核苷。當摻入寡核苷酸中時，有利的是，提供這樣的新寡核苷酸：其表現出與靶分子結合的不同的高親和力，和/或表現出與從天然存在的核苷制備的寡核苷酸相比增加的對外切核酸酶和內切核酸酶的抗性。還有用的是，提供具有修飾的核苷酸，所述修飾會賦予不同于內切核酸酶和外切核酸酶抗性或除此之外額外的生物活性。技術實現要素：本公開內容提供具有以下通式的5-位修飾的尿苷：其中r選自-(ch2)n-rx1；rx1選自：h*ch3*表示所述rx1基團與(ch2)n連接基的連接點其中rx4選自：支鏈或直鏈低級烷基(c1-c20)；鹵素(f、cl、br、i)；腈(cn)；硼酸(bo2h2)；羧酸(cooh)；羧酸酯(coorx2)；伯酰胺(conh2)；仲酰胺(conhrx2)；叔酰胺(conrx2rx3)；磺酰胺(so2nh2)；n-烷基磺酰胺(sonhrx2)；其中rx2、rx3獨立地選自：支鏈或直鏈低級烷基(c1-c20)；苯基(c6h5)；rx4取代的苯環(rx4c6h4)，其中rx4如上面所定義；羧酸(cooh)；羧酸酯(coorx5)，其中rx5是支鏈或直鏈低級烷基(c1-c20)；和環烷基，其中rx2＝rx3＝(ch2)n；其中n＝0-10；其中x選自包括、但不限于以下部分的組：-h、-oh、-ome、-o-烯丙基、-f、-oet、-opr、-och2ch2och3和-疊氮基；其中r'選自包括、但不限于以下部分的組：-oac、-obz和-osime2tbu；其中r″選自包括、但不限于以下部分的組：h、dmt和三磷酸酯(-p(o)(oh)-o-p(o)(oh)-o-p(o)(oh)2)或其鹽；并且其中可以被下述部分替代：碳環糖類似物、α-異頭糖、諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖的差向異構糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、無環類似物和諸如甲基核苷的無堿基核苷類似物(abasicnucleosideanalog)。本公開內容包括分別具有以下通式的所述化合物的3'-亞磷酰胺和5'-三磷酸酯衍生物或其鹽：其中所有部分如上所定義。使用制備這些化合物的標準的合成方法或酶促方法，可以將本公開內容的化合物摻入寡核苷酸或適體中。本公開內容也提供制備本公開內容的化合物的方法和通過所述方法制備的化合物。在一個實施方案中，提供用于制備c-5修飾的氨基羰基嘧啶的方法，所述方法包括：在堿的存在下，使在5-位被三氟乙氧基羰基修飾的嘧啶與胺反應；和分離所述c-5修飾的氨基羰基嘧啶。在另一個實施方案中，提供用于制備c-5修飾的氨基羰基嘧啶的3'-亞磷酰胺的方法，所述方法包括：在堿的存在下，使所述c-5修飾的氨基羰基嘧啶與氰基乙基二異丙基氯代亞磷酰胺反應；和分離所述3'-亞磷酰胺。在另一個實施方案中，提供用于制備c-5修飾的氨基羰基嘧啶的5'-三磷酸酯的方法，所述方法包括：a)在堿的存在下，使具有下式的c-5修飾的氨基羰基嘧啶與乙酸酐反應：其中r和x如上面所定義，隨后用酸裂解5’-dmt基團，以形成具有以下結構的3’-乙酸酯：b)對步驟a)的3’-乙酸酯進行ludwig-eckstein反應，繼之以陰離子交換色譜；和c)分離具有以下結構的c-5修飾的氨基羰基嘧啶的5’-三磷酸酯或其鹽：詳細描述現將詳細參考本發明的代表性實施方案。雖然將結合所列舉的實施方案描述本發明，但是應當理解，不旨在將本發明限制為那些實施方案。相反，本發明旨在涵蓋可包括在由所附權利要求書限定的本發明范圍內的所有替代方案、修改和等同。本領域技術人員會認識到許多與本文所述的那些類似或等效的方法和材料，它們可以用于本公開內容的實踐中且在其范圍內。本公開內容絕不限于所描述的方法和材料。除非另外定義，在本文中使用的技術和科學術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常理解相同的含義。盡管與本文所述的那些類似的或等效的任意的方法、裝置和材料可以用于實踐或試驗本發明，但現在描述優選的方法、裝置和材料。在本公開內容中引用的所有出版物、公開的專利文獻和專利申請指明了本公開內容所屬領域的技術水平。在本文中引用的所有出版物、公開的專利文獻和專利申請都通過援引加入本文，其程度如同明確地且單個地指示每篇單獨的出版物、公開的專利文獻或專利申請通過援引加入。如在本公開內容(包括所附權利要求書)中使用的，除非內容清楚地另有指示，單數形式的英文詞“a”、“an”和“the”包括復數指代，且與“至少一個(種)”和“一個(種)或多個(種)”互換地使用。因此，對“適體”的提及也包括適體的混合物等。本文使用的術語“約”代表輕微的數值修飾或變異，使得這些數值相關的項目的基本功能不變。當用于指代多個項目時，術語“每個”意圖表示所述項目中的至少2個。不一定要求形成所述多個的所有項目滿足有關的額外限制。本文使用的術語“包含”、“包括”、“含有”及其任意變體意圖涵蓋非排他性的包含，使得包含、包括或含有一種元件或一系列元件的過程、方法、方法限定的產品或物質組合物不僅包括這些元件，還可能包括沒有明確列出的其它元件或這些過程、方法、方法限定的產品或物質組合物固有的其它元件。本文使用的術語“核苷酸”表示，核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或它們的修飾形式以及它們的類似物。核苷酸包括含有嘌呤(例如，腺嘌呤、次黃嘌呤、鳥嘌呤和它們的衍生物和類似物)以及嘧啶(例如，胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶和它們的衍生物和類似物)的物質。化合物在一個實施方案中，本公開內容提供下式的化合物：其中r選自-(ch2)n-rx1；rx1選自：h*ch3*表示所述rx1基團與(ch2)n連接基的連接點其中rx4選自包括、但不限于以下部分的組：支鏈或直鏈低級烷基(c1-c20)；鹵素(f、cl、br、i)；腈(cn)；硼酸(bo2h2)；羧酸(cooh)；羧酸酯(coorx2)；伯酰胺(conh2)；仲酰胺(conhrx2)；叔酰胺(conrx2rx3)；磺酰胺(so2nh2)；和n-烷基磺酰胺(sonhrx2)；其中rx2、rx3獨立地選自包括、但不限于以下部分的組：支鏈或直鏈低級烷基(c1-c20)；苯基(c6h5)；rx4取代的苯環(rx4c6h4)，其中rx4如上面所定義；羧酸(cooh)；羧酸酯(coorx5)，其中rx5是支鏈或直鏈低級烷基(c1-c20)；和環烷基，其中rx2＝rx3＝(ch2)n；其中n＝0-10；其中x選自包括、但不限于以下部分的組：-h、-oh、-ome、-o-烯丙基、-f、-oet、-opr、-och2ch2och3和-疊氮基；其中r'選自包括、但不限于以下部分的組：-oh、-oac、-obz、-c(o)ch2och3和-osime2tbu；其中r″選自包括、但不限于以下部分的組：-h、4,4'-二甲氧基三苯甲基(dmt)和三磷酸酯(-p(o)(oh)-o-p(o)(oh)-o-p(o)(oh)2)或其鹽；并且其中可以被下述部分替代：碳環糖類似物、α-異頭糖、諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖的差向異構糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、無環類似物和諸如甲基核苷的無堿基核苷類似物。在另一個實施方案中，本公開內容提供下式的化合物或其鹽：其中r、r″和x如上面所定義。該通式的化合物可用于通過化學合成將修飾的核苷摻入寡核苷酸中。在其它實施方案中，本公開內容提供下式的化合物或其鹽：其中r、r'和x如上面所定義。該通式的化合物可用于通過酶促合成將修飾的核苷摻入寡核苷酸中。本文使用的術語“c-5修飾的羧基酰胺尿苷”或“c-5修飾的氨基羰基尿苷”表示這樣的尿苷：其具有在所述尿苷的c-5位處的羧基酰胺(-c(o)nh-)修飾，包括、但不限于上述的那些部分(r)。c-5修飾的羧基酰胺尿苷的實例包括在美國專利5,719,273和5,945,527以及2010年12月14日提交的標題為“nucleaseresistantoligonucleotides”的美國臨時申請61/422,957('957申請)中描述的那些。代表性的c-5修飾的嘧啶包括：5-(n-芐基羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷(bndu)、5-(n-芐基羧基酰胺)-2'-o-甲基尿苷、5-(n-芐基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(n-異丁基羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷(ibudu)、5-(n-異丁基羧基酰胺)-2'-o-甲基尿苷、5-(n-異丁基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(n-色氨基羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷(trpdu)、5-(n-色氨基羧基酰胺)-2'-o-甲基尿苷、5-(n-色氨基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(n-[1-(3-三甲基銨)丙基]羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷氯化物、5-(n-萘基甲基羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷(napdu)、5-(n-萘基甲基羧基酰胺)-2'-o-甲基尿苷、5-(n-萘基甲基羧基酰胺)-2'-氟尿苷或5-(n-[1-(2,3-二羥基丙基)]羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷)。僅僅為了例證目的在本文中描述的c-5修飾的氨基羰基尿苷的具體實例包括以下化合物以及所述化合物的5'-三磷酸酯和3'-亞磷酰胺及其鹽，它們的合成描述在實施例1-5中。5-(4-氟芐基氨基羰基)-2'-脫氧尿苷，5-((r)-2-糠基甲基氨基羰基)-2'-脫氧尿苷，5-((s)-2-糠基甲基氨基羰基)-2'-脫氧尿苷，5-(2-(4-嗎啉代)乙基氨基羰基)-2'-脫氧尿苷；和5-(2-(1-(3-苯并咪唑酮基))乙基氨基羰基)-2'-脫氧尿苷。本文所述的c-5修飾的尿苷的化學修飾也可以與單個的或任意組合的下述修飾相組合：2'-位糖修飾、在環外胺處的修飾和4-硫代尿苷的取代等等。鹽可以方便地或合乎需要地制備、純化和/或處理所述化合物的對應鹽，例如，藥學上可接受的鹽。在berge等人“pharmaceuticallyacceptablesalts”(1977)j.pharm.sci.66：1-19中，討論了藥學上可接受的鹽的實例。例如，如果所述化合物是陰離子的，或具有可以呈陰離子的官能團(例如，-cooh可以是-coo-)，那么可以與合適的陽離子形成鹽。合適的無機陽離子的實例包括、但不限于：堿金屬離子諸如na+和k+，堿土金屬陽離子諸如ca2+和mg2+，和其它陽離子諸如al+3。合適的有機陽離子的實例包括、但不限于：銨離子(即，nh4+)和取代的銨離子(例如，nh3rx+、nh2rx2+、nhrx3+、nrx4+)。一些合適的取代的銨離子的實例是得自以下的那些：乙胺、二乙胺、二環己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、芐胺、苯基芐胺、膽堿、葡甲胺和氨丁三醇，以及氨基酸，諸如賴氨酸和精氨酸。常見的季銨離子的一個實例是n(ch3)4+。如果所述化合物是陽離子的，或具有可以呈陽離子的官能團(例如，-nh2可以是-nh3+)，那么可以與合適的陰離子形成鹽。合適的無機陰離子的實例包括、但不限于得自以下無機酸的那些：鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、亞硫酸、硝酸、亞硝酸、磷酸和亞磷酸。合適的有機陰離子的實例包括、但不限于得自以下有機酸的那些：2-乙酰氧基苯甲酸、乙酸、抗壞血酸、天冬氨酸、苯甲酸、樟腦磺酸、肉桂酸、檸檬酸、依地酸、乙二磺酸、乙磺酸、富馬酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、羥乙酸、羥基馬來酸、羥基萘羧酸、羥乙磺酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、馬來酸、蘋果酸、甲磺酸、粘酸、油酸、草酸、棕櫚酸、雙羥萘酸、泛酸、苯乙酸、苯磺酸、丙酸、丙酮酸、水楊酸、硬脂酸、琥珀酸、對氨基苯磺酸、酒石酸、甲苯磺酸和戊酸。合適的聚合物有機陰離子的實例包括、但不限于得自以下聚合物酸的那些：鞣酸、羧甲基纖維素。除非另外指出,對特定化合物的提及也包括其鹽形式。寡核苷酸的制備在一個方面，本公開內容提供單獨地或與其它修飾的核苷和/或天然存在的核苷組合地使用本文所述的修飾的核苷來制備修飾的寡核苷酸的方法。寡脫氧核苷的自動化合成是許多實驗室中的常規實踐(參見例如，matteucci,m.d.和caruthers,m.h.,(1990)j.am.chem.soc.,103：3185-3191,其內容通過援引加入本文)。寡核糖核苷的合成也是眾所周知的(參見例如scaringe,s.a.等人,nucleicacidsres.18：5433-5441(1990)，通過援用加入本文)。如上面所指出的，所述亞磷酰胺可用于通過化學合成將所述修飾的核苷摻入寡核苷酸中，并且所述三磷酸酯可用于通過酶促合成將所述修飾的核苷摻入寡核苷酸中(參見例如，vaught,j.v.等人(2010)j.am.chem.soc.,132,4141-4151；gait,m.j.“oligonucleotidesynthesisapracticalapproach”(1984)irlpress(oxford,uk)；herdewijn,p.“oligonucleotidesynthesis”(2005)(humanapress,totowa,nj)(它們各自通過援引整體加入本文))。當與寡核苷酸結合使用時，本文使用的術語“修飾”、“修飾的”和它們的任意變體是指，所述寡核苷酸的4種組成核苷酸堿基(即，a、g、t/u和c)中的至少一種是天然存在的核苷酸的類似物或酯。在一些實施方案中，所述修飾的核苷酸會賦予寡核苷酸核酸酶抗性。額外的修飾可以包括：主鏈修飾，甲基化，異常堿基配對組合例如異堿基(isobase)異胞苷(isocytidine)和異胍(isoguanidine)等等。修飾也可包括3'和5'修飾，如加帽。其它修飾可以包括：天然存在的核苷酸中的一個或多個被類似物取代，核苷酸間修飾例如不帶電連接修飾(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)和帶電連接修飾(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)，嵌入劑修飾(例如吖啶、補骨脂素等)、含有螯合劑的修飾(例如金屬、放射性金屬、硼和氧化性金屬等)，含有烷化劑的修飾和用修飾的連接修飾(例如α異頭核酸等)。而且，通常存在于核苷酸的糖中的任何羥基可以被膦酸酯基團或磷酸酯基團替代，被標準保護基保護，或者被激活以制備與額外的核苷酸或固體載體的額外連接。5’和3’末端oh基團可以被磷酸化或者被胺、約1到約20個碳原子的有機加帽基團部分、聚乙二醇(peg)聚合物(在一個實施方案中，約10至約80kda)、peg聚合物(在另一個實施方案中，約20至約60kda)、或者其它親水的或疏水的生物的或合成的聚合物取代。多核苷酸也可以含有本領域通常已知的核糖或脫氧核糖的類似形式，包括2'-o-甲基、2'-o-烯丙基、2'-o-乙基、2'-o-丙基、2'-o-ch2ch2och3、2'-氟-或2'-疊氮基、碳環糖類似物、α-異頭糖、諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖的差向異構糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、無環類似物和諸如甲基核苷的無堿基核苷類似物。如上面所指出的，一個或多個磷酸二酯鍵可被替代性的連接基替代。這些替代性的連接基包括其中磷酸酯被以下基團替代的實施方案：p(o)s(“硫代磷酸酯(thioate)”)、p(s)s(“二硫代磷酸酯(dithioate)”)、(o)nrx2(“酰胺”)、p(o)rx、p(o)orx'、co或ch2(“甲縮醛(formacetal)”)，其中每個rx或rx'獨立地是h或取代的或未取代的任選含有醚(-o-)連接的烷基(c1-c20)、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基(araldyl)。多核苷酸中的所有連接不一定都是一致的。糖、嘌呤和嘧啶的類似形式的取代在設計終產物方面可能是有利的，替代性的主鏈結構(如聚酰胺主鏈)也是如此。如果存在的話，可以在聚合物裝配之前或之后，實現對核苷酸結構的修飾。核苷酸序列可以被非核苷酸組分中斷。在聚合以后，可以進一步修飾多核苷酸，諸如通過與標記組分的綴合。本文使用的“核酸”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互換地用于指示核苷酸的聚合物，且包括dna、rna、dna/rna雜交物以及這些類型的核酸、寡核苷酸和多核苷酸的修飾，其中包括各種實體或部分在任意位置處與核苷酸單元的連接。術語“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”包括雙鏈或單鏈分子以及三螺旋分子。核酸、寡核苷酸和多核苷酸是比術語適體更廣的術語，因而，術語核酸、寡核苷酸和多核苷酸包括作為適體的核苷酸的聚合物，但是術語核酸、寡核苷酸和多核苷酸不限于適體。當指示核酸的修飾時，本文使用的術語“至少一個核苷酸”是指所述核酸中的一個、幾個或所有核苷酸，這指示，a、c、t、g或u中的任一個或全部在核酸中的任一次或所有出現可以被修飾或未被修飾。在其它方面，本公開內容提供單獨地或與其它修飾的核苷和/或天然存在的核苷組合地使用本文所述的修飾的核苷來制備適體和somamer(在下面描述)的方法。在特定的實施方案中，使用如下所述的一般selex或改進的selex方法制備所述適體和somamer。本文使用的“核酸配體”、“適體”、“somamer”和“克隆”可互換地用于指示對靶分子具有希望的作用的非天然存在的核酸。希望的作用包括、但不限于：結合靶、催化地改變靶、以修飾或改變靶或靶的功能活性的方式與靶反應、共價地結合靶(如在自殺抑制劑的情況中)和促進靶與其它分子之間的反應。在一個實施方案中，所述作用是對靶分子的特異性結合親和力，這樣的靶分子是三維化學結構而不是多核苷酸，其通過不依賴于watson/crick堿基配對或三螺旋形成的機理與所述核酸配體結合，其中所述適體不是具有被所述靶分子結合的已知生理功能的核酸。給定的靶的適體包括：通過以下方法從核酸的候選混合物中鑒別出的核酸，其中所述適體是所述靶的配體，所述方法包括：(a)使所述候選混合物接觸所述靶，其中在所述候選混合物中的與其它核酸相比具有增加的對所述靶的親和力的核酸可以與所述候選混合物的其余部分分開；(b)從所述候選混合物的其余部分中分離出親和力增加的核酸；和(c)擴增所述親和力增加的核酸，以產生配體富集的核酸混合物，由此鑒別出所述靶分子的適體。已知親和相互作用是程度問題；但是，在該背景下，適體對其靶的“特異性結合親和力”是指，所述適體與其靶的結合親和力的程度通常遠遠大于它與混合物或樣品中其它非靶組分的結合親和力。“適體”、“somamer”或“核酸配體”是一類或一種具有特定核苷酸序列的核酸分子的拷貝集合。適體可以包括任何適當數量的核苷酸。“適體”表示超過一個這樣的分子集合。不同的適體可能具有相同或不同的核苷酸數量。適體可以是dna或rna，且可以是單鏈的、雙鏈的，或含有雙鏈或三鏈區域。本文使用的“somamer”或慢解離速率修飾適體(slowoff-ratemodifiedaptamer)表示具有改進的解離速率特征的適體。可以使用在標題為“methodforgeneratingaptamerswithimprovedoff-rates”的美國專利公開20090004667中描述的改進的selex方法制備somamer。本文使用的“蛋白”與“肽”、“多肽”或“肽片段”同義地使用。“純化的”多肽、蛋白、肽或肽片段基本上不含有來自細胞、組織或無細胞來源(所述氨基酸序列得自于此)的細胞物質或其它污染蛋白，或當化學地合成時，基本上不含有化學前體或其它化學試劑。selex方法術語“selex”和“selex方法”在本文中互換地使用，通常是指以下二者的組合：(1)選擇以希望的方式(例如高親和力地結合蛋白)與靶分子相互作用的核酸，(2)擴增那些選擇的核酸。selex方法可以用于鑒別對特定靶分子或生物標志物具有高親和力的適體。selex通常包括：制備核酸的候選混合物，使所述候選混合物與希望的靶分子結合以形成親和復合物，使所述親和復合物與未結合的候選核酸分開，從所述親和復合物中分開并分離核酸，純化所述核酸，并鑒別特異性的適體序列。所述方法可以包括多個循環，以進一步改進所選擇的適體的親和力。所述方法可以包括在所述方法中的一個或多個點處的擴增步驟。參見例如標題為“nucleicacidligands”的美國專利5,475,096。selex方法可以用于制備共價地結合它的靶的適體以及非共價地結合它的靶的適體。參見例如標題為“systematicevolutionofnucleicacidligandsbyexponentialenrichment:chemi-selex”的美國專利5,705,337。selex方法可以用于鑒別含有修飾的核苷酸的高親和力適體，所述修飾的核苷酸賦予所述適體改進的特征，例如，提高的體內穩定性或改進的遞送特征。這樣的修飾的實例包括：在核糖和/或磷酸酯和/或堿基位置處的化學取代。在標題為“highaffinitynucleicacidligandscontainingmodifiednucleotides”的美國專利5,660,985中描述了selex方法鑒別出的含有修飾的核苷酸的適體，該專利描述了含有在嘧啶的5'-和2'-位處被化學修飾的核苷酸衍生物的寡核苷酸。美國專利5,580,737(參見同上)描述了高度特異性的適體，所述適體含有一個或多個被2'-氨基(2'-nh2)、2'-氟(2'-f)和/或2'-o-甲基(2'-ome)修飾的核苷酸。也參見標題為“selexandphotoselex”的美國專利申請公開20090098549，它描述了具有擴展的物理和化學性質的核酸文庫和它們在selex和photoselex中的用途。selex也可以用于鑒別具有希望的解離速率特征的適體。參見標題為“methodforgeneratingaptamerswithimprovedoff-rates”的美國專利公開20090004667(它通過援引整體加入本文)，它描述了用于制備可以結合靶分子的適體的改進的selex方法。描述了用于產生適體和光適體的方法，所述適體和光適體具有更慢的與它們各自的靶分子解離的速率。所述方法包括：使所述候選混合物接觸靶分子，允許形成核酸-靶復合物，并執行慢解離速率富集過程，其中具有快解離速率的核酸-靶復合物解離且不會重新形成，而具有慢解離速率的復合物保持完整。另外，所述方法包括在候選核酸混合物的制備中使用修飾的核苷酸，以產生具有改進的解離速率性能的適體(參見美國專利公開20090098549,標題為“selexandphotoselex”)。(也參見美國專利7,855,054和美國專利公開20070166740)。這些申請中的每一篇通過援引整體加入本文。“靶”、“靶分子”或“靶”在本文中是指核酸可以以希望的方式對其起作用的任意化合物。靶分子可以是蛋白、肽、核酸、碳水化合物、脂質、多糖、糖蛋白、激素、受體、抗原、抗體、病毒、病原體、有毒物質、底物、代謝物、過渡態類似物、輔因子、抑制劑、藥物、染料、營養物、生長因子、細胞、組織、任一種前述物質的任意部分或片段等，但不限于此。基本上任意的化學或生物學效應器可以是合適的靶。任意大小的分子均可以充當靶。還可以以某些方式修飾靶，以增強靶和核酸之間的相互作用的可能性或強度。靶還可以包括特定化合物或分子的任意微小變化，例如，在蛋白的情況下，例如在氨基酸序列的微小變化、二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作和修飾，例如與標記組分的綴合，所述綴合基本上不改變分子同一性。“靶分子”或“靶”是一類或一種能夠結合適體的分子或多分子結構的拷貝集合。“靶分子”或“靶”表示超過一個這樣的分子集合。在標題為“modifiedselexprocesseswithoutpurifiedprotein”的美國專利6,376,190中描述了其中靶是肽的selex方法的實施方案。化學合成在本文中描述了在本公開內容中提供的化合物的化學合成方法。可以以已知的方式修改和/或改變這些和/或其它眾所周知的方法，以便促進在本公開內容中提供的其它化合物的合成。參考路線1，在一種方案中，如下制備本公開內容的c-5位修飾的氨基羰基嘧啶：在堿的存在下，使在5-位被三氟乙氧基羰基修飾的嘧啶與胺反應；和分離所述c-5修飾的氨基羰基嘧啶。在一些實施方案中，所述三氟乙氧基羰基嘧啶選自包括、但不限于具有以下結構的化合物的化合物組：其中x選自包括、但不限于以下部分的組：-h、-oh、-ome、-o-烯丙基、-f、-oet、-opr、-och2ch2och3和-疊氮基，且其中可以被下述部分替代：碳環糖類似物、α-異頭糖、諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖的差向異構糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、無環類似物和諸如甲基核苷的無堿基核苷類似物。在一些實施方案中，所述胺選自包括、但不限于以下化合物的組：式rnh2的化合物，其中r選自-(ch2)n-rx1；rx1選自：h*-ch3*表示所述rx1基團與(ch2)n連接基的連接點其中rx4選自：支鏈或直鏈低級烷基(c1-c20)；鹵素(f、cl、br、i)；腈(cn)；硼酸(bo2h2)；羧酸(cooh)；羧酸酯(coorx2)；伯酰胺(conh2)；仲酰胺(conhrx2)；叔酰胺(conrx2rx3)；磺酰胺(so2nh2)；n-烷基磺酰胺(sonhrx2)；其中rx2和rx3獨立地選自：支鏈或直鏈低級烷基(c1-c20)；苯基(c6h5)；rx4取代的苯環(rx4c6h4)，其中rx4如上面所定義；羧酸(cooh)；羧酸酯(coorx5)，其中rx5是支鏈或直鏈低級烷基(c1-c20)；和環烷基，其中rx2＝rx3＝(ch2)n；且其中n＝0-10。在特定的實施方案中，所述胺選自：在一些實施方案中，所述堿是選自三乙胺、二異丙胺等的叔胺。參考路線1，本公開內容還提供用于合成c-5修飾的氨基羰基嘧啶的3'-亞磷酰胺的方法，所述方法包括：在堿的存在下，使所述c-5修飾的氨基羰基嘧啶與氰基乙基二異丙基氯代亞磷酰胺反應；和分離所述3'-亞磷酰胺。在一些實施方案中，所述c-5修飾的氨基羰基嘧啶具有以下結構：其中r和x如上面所定義。在一些實施方案中，所述堿是選自三乙胺、二異丙胺等的叔胺。再參考路線1，本公開內容還提供用于合成c-5修飾的氨基羰基嘧啶的5'-三磷酸酯的方法，所述方法包括：a)在堿的存在下，使具有下式的c-5修飾的氨基羰基嘧啶與乙酸酐反應：其中r和x如上面所定義，隨后用酸裂解5’-dmt基團，以形成具有以下結構的3’-乙酸酯：b)對步驟a)的3’-乙酸酯進行ludwig-eckstein反應，繼之以陰離子交換色譜；和c)分離具有以下結構的c-5修飾的氨基羰基嘧啶的5’-三磷酸酯或其鹽：使用的堿選自包括、但不限于叔胺的組。在一些實施方案中，所述堿是吡啶。在步驟a中使用的酸選自包括、但不限于二氯乙酸、三氯乙酸和1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇的組：。在一個替代方案中，所述三氟乙氧基羰基嘧啶具有以下結構：參考路線2，通過在鈀催化劑和堿的存在下使路線2的化合物(7)與一氧化碳和三氟乙醇反應，形成該化合物。所述堿選自包括、但不限于叔胺的組，所述叔胺選自三乙胺等。本公開內容包括通過上述方法中的每一種制備的化合物。實施例下述實施例僅僅為了例證目的而提供，無意限制由所附權利要求限定的本發明的范圍。使用本領域技術人員眾所周知的且常規的標準技術，實現在本文中描述的所有實施例。可以如標準的實驗室手冊(諸如sambrook等人,molecularcloning:alaboratorymanual,第3版,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,(2001))描述的那樣實現在下述實施例中描述的常規分子生物學技術。使用下述的一般方法制備了在實施例1-3和5中描述的修飾的核苷。在本文中使用的命名法是基于matsuda等人nucleicacidsresearch1997,25：2784-2791所述的系統。路線1實施例1.5'-o-dmt-du-5-羧酰胺(3a-e)的合成5'-o-二甲氧基三苯甲基-5-(4-氟芐基氨基羰基)-2'-脫氧尿苷(3a)。通過matsuda等人的方法(nomura,y.；ueno,y.；matsuda,a.nucleicacidsresearch1997,25∶2784-2791；ito,t.,ueno,y.；matsuda,a.nucleicacidsresearch2003,31∶2514-2523)制備原料5'-o-二甲氧基三苯甲基-5-三氟乙氧基羰基-2'-脫氧尿苷(1)。將(1)(9.85g,15mmol)、4-氟芐胺(2a)(2.25g,18mmol,1.3當量)、三乙胺(4.2ml,30mmol)和無水乙腈(30ml)的溶液在惰性氣氛下在60-70℃加熱2-24小時。通過薄層色譜法(硅膠60,5％甲醇/二氯甲烷)或hplc證實(1)向酰胺(3a)的定量轉化。在真空中濃縮反應混合物，并使用在1％三乙胺/99％乙酸乙酯中的0-3％甲醇洗脫液，通過硅膠快速色譜法(still,w.c.；kahn,m.；mitra,a.j.org.chem.1978,43∶2923)純化殘余物。合并含有純產物的級分，并蒸發。通過與無水乙腈一起共蒸發，去除痕量的殘余溶劑，隨后在高真空下干燥，得到(3a)，為白色固體(6.57g,64％收率)。1h-nmr(300mhz,cd3cn)δ2.20-2.40(2h,m),3.28(2h,d,j＝4.3hz),3.76(6h,s),4.01(1h,dd,j＝3.8,4.2hz),4.26-4.30(1h,m),4.48(2h,bd,j＝6.1hz),6.11(1h,t,j＝6.5hz),6.85-7.46(13h,m),7.03-7.36(4h,m),8.58(1h,s),9.01(1h,t,j＝6.1hz)。ms(m/z)c38h36fn3o8的計算值681.25；測量值680.4[m-h]-。5'-o-二甲氧基三苯甲基-5-((r)-2-糠基甲基氨基羰基)-2'-脫氧尿苷(3b)。如關于(3a)所述，使用(r)-2-糠基甲胺(2b)制備化合物(3b)，并分離，為白色固體(9.3g,94％收率)。色譜法的洗脫液是1％三乙胺/4％甲醇/95％乙酸乙酯。1h-nmr(cd3cn)δ1.51-1.57(1h,m),1.84-1.94(3h,m),2.18-2.38(2h,m),3.25-3.52(4h,m重疊),3.66-3.93(3h,m重疊),3.78(6h,s),3.97-4.02(1h,m),4.24-4.29(1h,m),6.12(1h,t,j＝6.5),6.86-7.47(13h,m),8.54(1h,s),8.83(1h,bs)。ms(m/z)c36h39n3o9的計算值657.27；測量值656.5[m-h]-。5'-o-二甲氧基三苯甲基-5-((s)-2-糠基甲基氨基羰基)-2'-脫氧尿苷(3c)。如關于(3b)所述，使用(s)-2-糠基甲胺(2c)制備化合物(3c)，并分離，為白色固體(9.9g,99％收率)。1h-nmr(cd3cn)δ1.50-1.59(1h,m),1.84-1.95(3h,m),2.18-2.40(2h,m),3.24-3.50(4h,m重疊),3.69-3.97(3h,m重疊),3.78(6h,s),3.98-4.02(1h,m),4.25-4.30(1h,m),6.14(1h,t,j＝6.5),6.87-7.47(13h,m),8.54(1h,s),8.84(1h,bs)。ms(m/z)c36h39n3o9的計算值657.27；測量值656.5[m-h]-。5'-o-二甲氧基三苯甲基-5-(2-(4-嗎啉代)乙基氨基羰基)-2'-脫氧尿苷(3d)。如關于(3a)所述，使用2-(4-嗎啉代)-乙胺(2d)制備化合物(3d)，并分離，為白色固體(8.2g,80％收率)。色譜法的洗脫液是5％甲醇/2％三乙胺/93％二氯甲烷。1h-nmr(cd3cn)δ2.21-2.39(2h,m),2.39-2.41(4h,m),2.48(2h,t,j＝6.2hz),3.27-3.29(2h,m),3.41(2h,dt,j＝5.8,6.2hz),3.61-3.64(4h,m),3.78(6h,s),3.98-4.02(1h,m),4.25-4.30(1h,m),6.10(1h,t,j＝6.4),6.86-7.47(13h,m),8.55(1h,s),8.79(1h,bt,j～6hz)。ms(m/z)c37h42n4o9的計算值686.30；測量值685.7[m-h]-。5'-o-二甲氧基三苯甲基-5-(2-(n-苯并咪唑酮基)乙基氨基羰基)-2'-脫氧尿苷(3e)。如關于(3a)所述，使用n-苯并咪唑酮基-2-乙胺(2e)(casrn64928-88-7)制備化合物(3e)。色譜法的洗脫液是2％甲醇/1％三乙胺/97％二氯甲烷。分離純產物，為褐色固體(8.2g,74.5％收率)。1h-nmr(cd3cn)δ2.20-2.36(2h,m),3.27-3.29(2h,m),3.60(2h,q,j＝6.5hz),3.758(3h,s),3.762(3h,s),3.97(2h,t,j＝6.5hz),3.98-4.02(1h,m),4.27-4.30(1h,m),6.09(1h,t,j＝6.5hz),6.86-7.48(13h,m),6.91-7.10(4h,m),8.52(1h,s),8.76(1h,t,j＝6.1hz)。ms(m/z)c40h39n5o9的計算值733.27；測量值732.0[m-h]-。實施例2.5'-o-dmt-核苷ce-亞磷酰胺(4a-4e)的合成5'-o-二甲氧基三苯甲基-5-(4-氟芐基氨基羰基)-3'-o-[(2-氰基乙氧基)(n,n-二異丙基氨基)氧膦基]-2'-脫氧尿苷(4a)。在干燥的氬氣氛下，將dmt-保護的核苷(3a)(4.00g,5.9mmol)在無水二氯甲烷(40ml)中的溶液冷卻至約-10℃。加入二異丙基乙胺(3.1ml,17.6mmol,3當量)，隨后逐滴加入2-氰基乙基二異丙基氯代亞磷酰胺(1.7ml,7.7mmol,1.3當量)。將溶液攪拌1小時，并通過薄層色譜法(硅膠60,乙酸乙酯/己烷)證實反應結束。在冰冷的2％碳酸氫鈉溶液(200ml)和乙酸乙酯(200ml)之間分配反應混合物。用鹽水洗滌有機層，經無水硫酸鈉干燥，過濾，并濃縮。使用1％三乙胺/99％乙酸乙酯的流動相，通過硅膠快速色譜法純化殘余物。合并含有純產物的級分，并在真空中蒸發(<30℃)。通過與無水乙腈一起共蒸發，去除痕量的殘余色譜溶劑，并在高真空干燥，得到(4a)，為白色穩定泡沫(4.10g,80％收率)。1h-nmr(cd3cn,2種異構體)δ1.02-1.16(12h,m),2.27-2.57(2h,m),2.51/2.62(2h,2t,j＝6.0/6.0hz),3.25-3.37(2h,m),3.50-3.79(4h,m重疊),3.738(3h,s),3.742(3h,s),4.13/4.16(1h,2q,j＝3.5/3.7hz),4.37-4.43(1h,m),4.44-4.47(2h,m),6.09/6.10(1h,2t,j＝6.4/7.1hz),6.83-7.44(13h,m),7.01-7.30(4h,m),8.58/8.60(1h,2s),8.98(1h,b,j～5.5hz),9.24(1h,bs)。31p-nmr(cd3cn)δ148.01(s),148.06(s)。19f-nmr(cd3cn)δ-117.65(m)。ms(m/z)c47h53fn5o9p的計算值881.36；測量值880.3[m-h]-。5'-o-二甲氧基三苯甲基-5-((r)-2-糠基甲基氨基羰基)-3'-o-[(2-氰基乙氧基)(n,n-二異丙基氨基)氧膦基]-2'-脫氧尿苷(4b)。如關于(4a)所述，制備化合物(4b)。分離非對映異構的亞磷酰胺的1∶1混合物，為白色固體泡沫(3.15g,62％收率)。色譜法的洗脫液是1％三乙胺/20％己烷/79％乙酸乙酯。1h-nmr(cd3cn,2種異構體)δ1.14-1.27(12h,m),1.51-1.59(1h,m),1.86-1.94(3h,m),2.27-2.59(2h,m),2.54/2.65(2h,2t,j＝6.0/5.7hz),3.27-3.38(2h,m),3.44-3.97(9h,m重疊),3.782(3h,s),3.786(3h,s),4.11-4.18(1h,m),4.39-4.48(1h,m),6.11/6.13(1h,2t,j＝5.6/6.1hz),6.96-7.47(13h,m),8.58/8.60(1h,2s),8.75(1h,bt,j～5.4hz),9.36(1h,bs)。31p-nmr(cd3cn)δ148.09(s),148.13(s)。ms(m/z)c45h56n5o10p的計算值857.38；測量值856.6[m-h]-。5'-o-二甲氧基三苯甲基-5-((s)-2-糠基甲基氨基羰基)-3'-o-[(2-氰基乙氧基)(n,n-二異丙基氨基)氧膦基]-2'-脫氧尿苷(4c)。如關于(4b)所述，制備化合物(4c)。分離非對映異構的亞磷酰胺的1∶1混合物，為白色固體泡沫(3.74g,74％收率)。1h-nmr(cd3cn,2種異構體)δ1.14-1.27(12h,m),1.51-1.59(1h,m),1.86-1.94(3h,m),2.28-2.51(2h,m),2.53/2.65(2h,2t,j＝6.0/6.0hz),3.25-3.41(2h,m),3.44-4.14(9h,m重疊),3.783(3h,s),3.786(3h,s),4.12-4.19(1h,m),4.40-4.49(1h,m),6.11/6.13(1h,2t,j＝6.3/6.3hz),6.86-7.48(13h,m),8.58/8.60(1h,2s),8.75(1h,bt,j～5.4hz),9.36(1h,bs)。31p-nmr(cd3cn)δ148.09(s),148.13(s)。ms(m/z)c45h56n5o10p的計算值857.38；測量值856.5[m-h]-。5'-o-二甲氧基三苯甲基-5-(2-(4-嗎啉代)乙基氨基羰基)-3'-o-[(2-氰基乙氧基)(n,n-二異丙基氨基)氧膦基]-2'-脫氧尿苷(4d)。除了純化使用1％三乙胺/5％無水乙醇/94％乙酸乙酯的色譜洗脫液以外，如關于(4a)所述，制備化合物(4d)。分離非對映異構的亞磷酰胺的1∶1混合物，為白色固體泡沫(3.9g,75％收率)。1h-nmr(cd3cn,2種異構體)δ1.04-1.19(12h,m),2.28-2.59(2h,m),2.43-2.47(6h,m重疊),2.53/2.64(2h,2t,j＝6.2/6.2hz),3.27-3.76(8h,m重疊),3.61-3.65(4h,m),3.781(3h,s),3.789(3h,s),4.12-4.19(1h,m),4.39-4.49(1h,m),6.11/6.13(1h,2t,j＝5.2//5.2),6.86-7.48(13h,m),8.58/8.60(1h,2s),8.78(1h,bt,j～5.3hz),9.78(1h,bs)。31p-nmr(cd3cn)δ148.08(s),148.11(s)。ms(m/z)c46h59n6o10p的計算值886.4；測量值885.7[m-h]-。5'-o-二甲氧基三苯甲基-5-(2-(n-苯并咪唑酮基)乙基氨基羰基)-3'-o-[(2-氰基乙氧基)(n,n-二異丙基氨基)氧膦基]-2'-脫氧尿苷(4e)。除了純化使用1％三乙胺/10％無水甲醇/89％乙酸乙酯的色譜洗脫液以外，如關于(4a)所述，制備化合物(4e)。分離非對映異構的亞磷酰胺的1∶1混合物，為白色固體泡沫(1.6g,31％收率)。1h-nmr(cd3cn,2種異構體)δ1.03-1.18(12h,m),2.27-2.57(2h,m),2.52/2.63(2h,2t,j＝6.0/6.0),3.27-3.37(2h,m),3.49-3.80(6h,m重疊),3.732(3h,s),3.735/3.738(3h,2s),4.00(2h,bt,j～6.0hz),4.12-4.18(1h,m),4.30-4.47(1h,m),6.08/6.10(1h,2t,j＝6.3/6.3hz),6.85-7.48(13h,m),6.93-7.09(4h,m),8.57/8.60(1h,2s),8.82/8.83(1h,2bt,j～4.3/4.3hz),9.48(1h,bs)。31p-nmr(cd3cn)δ148.07(s),148.10(s)。實施例3.3'-o-乙酰基-核苷(5a-5e)的合成5-(4-氟芐基氨基羰基)-3'-o-乙酰基-2'-脫氧尿苷(5a)。將核苷(3a)(3.00g,4.4mmol)溶解于無水吡啶(30ml)和乙酸酐(3ml)的溶液中。將所述溶液攪拌過夜，并在真空中濃縮，得到3'-o-乙酰基-核苷。通過與無水甲苯(10ml)一起共蒸發，去除殘余的溶劑。將殘余物溶解于無水二氯甲烷(10ml)中，并用在二氯甲烷(58ml)中的3％三氯乙酸處理。將紅色溶液攪拌過夜，在此期間產物結晶。將漿狀物冷卻至-20℃，過濾，并用乙醚洗滌。在真空中干燥殘余物，得到(5a)，為灰白色固體(1.10g,59％收率)。1h-nmr(cd3cn)δ2.07(3h,s),2.33-2.38(1h,m),2.50-2.52(1h,m),3.63-3.64(2h,m),4.10(1h,bdd,j＝3.1,5.1hz),4.46(2h,d,j＝6.0hz),5.19-5.26(2h,m重疊),6.15(1h,t,j＝7.0hz),7.15(2h,tt,j＝2.2,9.0hz),7.31-7.38(2h,m),8.79(1h,s),9.14(1h,bt,j＝6.1hz),11.95(1h,bs)。19f-nmr(cd3cn)δ-116.02(tt,j＝5.5,9.0hz))。ms(m/z)c19h20fn3o7的計算值421.13；測量值419.8[m-h]-。5-((r)-2-糠基甲基氨基羰基)-3'-o-乙酰基-2'-脫氧尿苷(5b)。通過關于(5a)所述的方法，從(4b)制備化合物(5b)，并通過從二氯甲烷和乙酸乙酯的混合物中沉淀來分離，為白色固體(1.27g,73％收率)。1h-nmr(cdcl3)δ1.57-2.02(4h,m),2.12(3h,s),2.46-2.50(2h,m),3.03(1h,bs),3.43-3.64(2h,m),3.75-3.97(2h,m),3.78-4.10(3h.m),4.20-4.21(1h,m),5.40-5.42(1h,m),6.35(1h,dd,j＝6.5,7.7hz),8.91(1h,t,j＝5.5hz),9.17(1h,s),9.44(1h,bs)。ms(m/z)c17h23n3o8的計算值397.15；測量值396.1[m-h]-。5-((s)-2-糠基甲基氨基羰基)-3'-o-乙酰基-2’-脫氧尿苷(5c)。通過關于(5a)所述的方法，從(4c)制備化合物(5c)，并通過從二氯甲烷和乙醚的混合物中沉淀來分離，為淺橙色固體(1.35g,77％收率)。1h-nmr(cdcl3)δ1.57-2.03(4h,m),2.12(3h,s),2.47-2.51(2h,m),2.98(1h,bs),3.40-3.68(2h,m),3.78-3.95(2h,m),3.90-4.12(3h.m),4.20-4.21(1h,m),5.39-5.42(1h,m),6.33(1h,dd,j＝6.7,7.4hz),8.90(1h,t,j＝5.5hz),9.15(1h,s),9.37(1h,bs)。ms(m/z)c17h23n3o8的計算值397.15；測量值395.9[m-h]-。5-(2-(4-嗎啉代)乙基氨基羰基)-3'-o-乙酰基-2'-脫氧尿苷(5d)。將核苷(3d)(1.00g,1.37mmol)溶解于無水吡啶(10ml)和乙酸酐(1ml)的溶液中。將溶液攪拌過夜，并在真空中濃縮，得到3'-o-乙酰基-核苷。通過與無水甲苯(10ml)一起共蒸發，去除殘余的溶劑。將殘余物溶解于1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(20ml)(leonard,n.j.tetrahedronletters,1995,36∶7833)中，并在約50℃加熱3小時。通過薄層色譜法(tlc)證實dmt基團的完全裂解。通過將紅色溶液混合物倒入充分攪拌的甲醇(200ml)中終止反應。在真空中濃縮得到的黃色溶液，并將殘余物溶解于熱的乙酸乙酯(20ml)中。在冷卻后，產物結晶，并在-20℃老化得到的漿狀物，隨后過濾，并用乙酸乙酯洗滌。分離3'-o-乙酰基-核苷(5d)，為白色固體(0.46g,79％收率)。1h-nmr(dmso-d6)δ2.07(3h,s),2.32-2.45(7h,m重疊),2.49-2.52(1h,m),3.33-3.40(2h,m),3.57(4h,t,j＝4.5hz),3.60-3.63(2h,m),4.09(1h,bdd,j＝3.2,5.2hz),5.17-5.25(2h,m),6.14(1h,t,j＝7.0hz),8.74(1h,s),8.89(1h,bt,j＝5.4hz),11.90(1h,bs)。ms(m/z)c18h26n4o8的計算值426.18；測量值425.0[m-h]-。5-(2-(3-乙酰基-苯并咪唑酮-1-基)乙基氨基羰基)-3'-o-乙酰基-2'-脫氧尿苷(5e)。除了在將dmt裂解反應物倒入甲醇中時產物直接結晶以外，如關于(5d)所述，制備化合物(5e)。通過過濾分離二乙酰基核苷(5e)，為白色固體(0.55g,78％收率)。1h-nmr(dmso-d6)δ2.07(3h,s),2.30-2.37(1h,m),2.49-2.52(1h,m),2.63(3h,s)3.33(1h,bs),3.55-3.64(4h,m重疊),3.99(2h,t,j＝6.4hz),4.09(1h,bdd,j＝2.3,5.2hz),5.15-5.25(2h,m),6.13(1h,dd,j＝6.3,7.6hz),7.11(1h,ddd,j＝1.2,7.6,7.9hz),7.22(1h,ddd,j＝1.2,7.6,7.9hz),7.33(1h,dd,j＝0.8,7.9hz),8.02(1h,dd,j＝0.8,8.0hz),8.05(1h,bs),8.83(1h,bt),8.71(1h,s),11.87(1h,bs)。ms(m/z)c23h25n5o9的計算值515.17；測量值513.9[m-h]-。實施例4.3'-o-乙酰基-核苷(5a-5d)的替代性合成還通過一個替代性的途徑(路線2)，從原料3'-o-乙酰基-5'-o-二甲氧基三苯甲基-5-碘-2'-脫氧尿苷(7)(vaught,j.d.,bock,c.,carter,j.,fitzwater,t.,otis,m.,schneider,d.,rolando,j.,waugh,s.,wilcox,s.k.,eaton,b.e.j.am.chem.soc.2010,132,4141-4151)，合成3'-o-乙酰基-核苷(5a-d)。簡而言之，參考路線2，鈀(ii)-催化的碘化物的三氟乙氧基羰基化得到活化的酯中間體(8)。使(8)與胺(2a-d)(1.3當量,三乙胺(3當量),乙腈,60-70℃,2-24小時)縮合，隨后裂解5'-o-dmt保護基(3％三氯乙酸/二氯甲烷或1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇,室溫)，得到(5a-d)，其與通過中間體(3a-d)(路線1)生成的產物相同。路線23'-o-乙酰基-5'-o-二甲氧基三苯甲基-5-(2,2,2-三氟乙氧基羰基)-2'-脫氧尿苷(8)。給500ml厚壁玻璃壓力反應器充入氬，并裝入3'-o-乙酰基-5'-o-二甲氧基三苯甲基-5-碘-2'-脫氧尿苷(7)(15.9g,22.8mmol)、無水乙腈(200ml)、三乙胺(7.6ml,54.7mmol)和2,2,2-三氟乙醇(16.4ml,228mmol)。劇烈攪拌得到的溶液，通過抽空脫氣至<100mmhg持續2分鐘。給燒瓶充入氬，并加入雙(芐腈)二氯化鈀(ii)(175mg,0.46mmol)。將得到的黃色溶液再次脫氣，然后從氣體歧管充入一氧化碳(99.9％)(注意：毒氣！)。維持1-10psico的壓力，同時劇烈攪拌反應混合物，并在60-65℃加熱12小時。過濾冷卻的反應混合物(注意：毒氣)，以去除黑色沉淀物，并在真空中濃縮。在二氯甲烷(120ml)和10％碳酸氫鈉(80ml)之間分配橙色殘余物。用水(40ml)洗滌有機層，并經硫酸鈉干燥，過濾，并濃縮，剩下橙色泡沫(17g)。該粗產物原樣使用，或通過硅膠快速色譜法(使用30％己烷/1％三乙胺/69％乙酸乙酯洗脫液)進一步純化，得到(8)，為無色固體泡沫(12.7g,80％收率)。1h-nmr(cd3cn))δ2.03(3h,s),2.37-2.56(2h,m),3.36-3.38(2h,m),3.78(6h,s),4.15-4.19(1h,m),4.37-4.55(2h,m),5.21-5.26(1h,m),6.09(1h,t,j＝6.1hz),6.84-7.46(13h,m),8.53(1h,s)。19f-nmr(cd3cn)δ-74.07(t,j＝8.8hz)。ms(m/z)c35h33f3n2o10的計算值698.21；測量值697.4[m-h]-。實施例5.核苷5'-o-三磷酸酯的合成5-(4-氟芐基氨基羰基)-2'-脫氧尿苷-5'-o-三磷酸酯(三-三乙基銨鹽)(6a)。通過ludwig和eckstein的方法(ludwig,j.和eckstein,f.j.org.chem.1989,54∶631)，在500μmol規模(5x)，從3'-o-乙酰基-核苷(5a)合成三磷酸酯(6a)。如在一般方法(下文)中所述，通過陰離子交換色譜法，純化在氨解和蒸發以后得到的粗三磷酸酯產物。三磷酸核苷的陰離子交換hplc純化的一般方法。使用hplc柱，通過陰離子交換色譜法，純化三磷酸核苷，所述柱裝有sourceq樹脂(gehealthcare)，安裝在制備型hplc系統上，在278nm進行檢測。線性洗脫梯度采用2種緩沖液(緩沖液a：10mm三乙基碳酸氫銨/10％乙腈，和緩沖液b：1m三乙基碳酸氫銨/10％乙腈)，在洗脫過程中在環境溫度從低緩沖液b含量至高緩沖液b運行所述梯度。希望的產物通常是最后從柱上洗脫的物質，并顯示為跨約10-12分鐘保留時間的寬峰(較早洗脫的產物包括多種反應副產物，最突出的是二磷酸核苷)。在產物洗脫過程中，收集幾個級分。通過在waters2795hplc上的反相hplc，使用waterssymmetry柱(pn:wat054215)分析級分。在genevacvc3000d蒸發器中蒸發含有純產物的級分(通常>90％)，得到無色至淡褐色樹脂。在去離子水中重構級分，并合并，用于最終分析。通過使用hewlettpackard8452a二極管陣列分光光度計在278nm分析，進行產物定量。經由方程式a＝εcl計算產物收率，其中：a是紫外吸光度，ε是估計的消光系數，l是光路長度(1cm)。將粗產物(6a)溶解于約5ml緩沖液a(表1:制備型hplc條件1)中。每次純化注射包括：將約1ml該溶液的過濾等分試樣注射進具有486檢測器的waters625hplc中，后者配有resourceq6ml柱(gehealthcare產品代碼：17-1179-01)，以12ml/分鐘，使用0％-100％緩沖液b的流動相梯度，洗脫50分鐘。對于(6a)[ε估計13700cm-1m-1]，分離的純化產物是130μmol(26％收率)。1h-nmr(d2o)1.15(27h,t,j＝7.3hz),2.32-2.37(2h,m),3.07(18h,q,j＝7.3hz),4.06-4.17(3h,m重疊),4.42(2h,bd,j～0.7hz),4.49-4.53(1h,m),4.70(>7h,bs,hod),6.12(1h,t,j＝6.8hz),6.96-7.26(4h,m),8.45(1h,s)。19f-nmr(d2o)δ-116.18(m)。31p-nmr(d2o)δ-10.58(d,j＝20hz),-11.45(d,j＝20hz),-23.29(t,j＝20hz)。ms(m/z)c17h21fn3o15p3的計算值619.02；測量值618.0[m-h]-。表1.制備型hplc條件15-((r)-2-糠基甲基氨基羰基)-2'-脫氧尿苷-5'-o-三磷酸酯(三-三乙基銨鹽)(6b)。如關于(6a)所述，從3'-o-乙酰基-核苷(5b)合成三磷酸酯(6b)。在具有waters2489檢測器的waters2767制備型系統上，使用裝有196mlsource15q樹脂(gehealthcare產品代碼：17-0947-05)的watersap-5柱(waterspn:wat023331,50mmx100mm)，以單次注射純化粗產物(6b)。使用與上面相同的緩沖液，但是將洗脫梯度修改為25％至80％緩沖液b，以50ml/分鐘洗脫90分鐘(表2:制備型hplc條件2)。在c18hplc柱上進行第二次純化，以去除殘余的雜質(表4:制備型hplc條件4)。對于(6b)[ε估計10200cm-1m-1]，分離的純化產物是325μmol(65％收率)。1h-nmr(d2o)1.17(27h,t,j＝7.3hz),1.49-1.63(1h,m),1.77-2.02(3h,m),2.34-2.39(2h,m),2.85-3.83(5h,m重疊),3.08(18h,q,j＝7.3hz),4.01-4.19(3h,m重疊),4.52-4.56(1h,m),4.70(>7h,bs,hod),6.15(1h,t,j＝6.8hz),8.48(1h,s)。31p-nmr(d2o)δ-10.50(d,j＝20hz),-11.51(d,j＝20hz),-23.25(t,j＝20hz)。ms(m/z)c15h24fn3o16p3的計算值595.04；測量值594.1[m-h]-。表3.制備型hplc條件35-((s)-2-糠基甲基氨基羰基)-2'-脫氧尿苷-5'-o-三磷酸酯(三-三乙基銨鹽)(6c)。如關于(6a)所述，從3'-o-乙酰基-核苷(5c)合成三磷酸酯(6c)。在具有waters2489檢測器的waters2767制備型系統上，使用裝有196mlsource15q樹脂(gehealthcare產品代碼：17-0947-05)的watersap-5柱(waterspn:wat023331,50mmx100mm)，以單次注射純化粗產物(6c)。使用與上面相同的緩沖液，但是將洗脫梯度修改為25％至80％緩沖液b，以50ml/分鐘洗脫90分鐘(表2:制備型hplc條件2)。在c18hplc柱上進行第二次純化，以去除殘余的雜質(表4:制備型hplc條件4)。對于(6c)[ε估計10200cm-1m-1]，分離的純化產物是255μmol(51％收率)。1h-nmr(d2o)1.17(27h,t,j＝7.3hz),1.49-1.63(1h,m),1.78-2.01(3h,m),2.34-2.39(2h,m),2.85-3.82(5h,m重疊),3.09(18h,q,j＝7.3hz),4.01-4.19(3h,m重疊),4.52-4.56(1h,m),4.70(>7h,bs,hod),6.15(1h,t,j＝6.7hz),8.48(1h,s)。31p-nmr(d2o)δ-10.60(d,j＝20hz),-11.42(d,j＝20hz),-23.25(t,j＝20hz)。ms(m/z)c15h24fn3o16p3的計算值595.04；測量值594.1[m-h]-。5-(2-(4-嗎啉代)乙基氨基羰基)-2'-脫氧尿苷-5'-o-三磷酸酯(二-三乙基銨鹽)(6d)。如關于(6a)所述，從3'-o-乙酰基-核苷(5d)合成三磷酸酯(6d)。使用與用于(6a)的相同的設備和緩沖液純化粗產物(6d)，但是將梯度修改為在50分鐘洗脫內緩沖液b從15％至60％，以提高產物的拆分(表3:制備型hplc條件3)。對于(6d)[ε估計10200cm-1m-1]，分離的純化產物是54μmol(11％收率)。1h-nmr(d2o)1.17(18h,t,j＝7.3hz),2.37-2.41(2h,m),2.91-2.98(2h,m),3.09(12h,q,j＝7.3hz),3.20-3.27(4h,m),3.87-3.90(4h,m),3.63-3.68(2h,m),4.10-4.18(3h,m重疊),4.56-4.60(1h,m),4.70(>7h,bs,hod),6.15(1h,bt,j＝6.3hz),8.48(1h,s)。31p-nmr(d2o)δ-9.99(d,j＝21hz),-11.90(d,j＝20hz),-23.19(t,j＝20hz)。ms(m/z)c16h27n4o16p3的計算值624.06；測量值623.1[m-h]-。表2.制備型hplc條件2表4.制備型hplc條件45-(2-(n-苯并咪唑酮基)乙基氨基羰基)-2'-脫氧尿苷-5'-o-三磷酸酯(二-三乙基銨鹽)(6e)。如關于(6a)所述，從3'-o-乙酰基-核苷(5e)合成三磷酸酯(6e)。使用與用于(6a)的相同的設備和緩沖液純化粗產物(6e)，但是將梯度修改為在50分鐘洗脫內緩沖液b從15％至60％，以提高產物的拆分(表3:制備型hplc條件3)。對于(6e)[ε估計13700cm-1m-1]，分離的純化產物是101μmol(20％收率)。1h-nmr(d2o)δ1.17(18h,t,j＝7.3hz),2.17-2.36(2h,m),3.09(12h,q,j＝7.3hz),3.60-3.73(2h,m),4.01(2h,t,j＝5.4hz),4.03-4.15(3h,m),4.45-4.50(1h,m),4.70(>7h,bs,hod),6.04(1h,t,j＝6.6hz),6.95-7.12(4h,m),8.02(1h,s)。31p-nmr(d2o)δ-10.35(d,j＝20hz),-11.40(d,j＝20hz),-23.23(t,j＝20hz)。ms(m/z)c19h24n5o16p3的計算值671.04；測量值670.1[m-h]-。前述實施方案和實施例意圖僅僅作為實例。特定實施方案、實施例、或特定實施方案或實施例的元素都不應解釋為任何權利要求的關鍵的、必需的或重要的元素或特征。進一步，在本文中描述的元素不是實踐所附權利要求所必需的，除非明確地描述為“必需的”或“關鍵的”。對公開的實施方案可以進行各種改變、修改、替換和其它變化，而不背離所附權利要求限定的本發明的范圍。說明書(包括實施例)應被認為是說明性的，而不是限制性的，而且所有這樣的修改和替換意圖包括在本發明的范圍中。因此，本發明的范圍應當由所附的權利要求和它們的法律等同方案(而不是又上面所給出的實施例)來確定。例如，在任何方法權利要求中敘述的步驟可以以任何可行的順序來執行，并不限于在任何實施方案、實施例或權利要求中所表述的順序。當前第1頁12當前第1頁12