用吸入氧化氮治療血管血栓形成和再狹窄的制作方法

專利名稱：用吸入氧化氮治療血管血栓形成和再狹窄的制作方法
背景技術：
本發明涉及治療、抑制或預防血管血栓形成的方法和治療、抑制或預防由內膜過度增生造成的動脈再狹窄的方法。
血栓形成，即，在血管內形成或存在血凝塊，可能是由諸如經皮經腔冠狀血管成形術(“PTCA”；一類氣囊血管成形術)或冠狀動脈分流手術的血管介入操作產生的動脈壁的物理損傷所造成。血栓形成也可由如動脈粥樣硬化的天然病程造成。各種藥物，包括阿司匹林、前列腺素E1、選擇性的血栓素(thromboxane)A2抑制劑、選擇性的凝血酶抑制劑、血小板受體GPIIb/IIIa阻滯劑、組織纖維蛋白溶酶原活化劑、鏈激酶、肝素和kistrin已用作抗血栓形成劑。參見，如Yasuda等(循環(Circulation)831038(1991))；和Gold等(循環(Circulation)(增刊IV)83IV26(1991))。目前市售的抗血小板藥包括阿司匹林、噻氯匹啶、單克隆抗體、硝酸甘油和硝普鈉。
由血管介入操作造成的動脈損傷產生的另一個不好的結果是動脈再狹窄。例如，PTCA被廣泛地用來開放冠狀和外周血管系統的閉塞的動脈。雖然開始有95％以上的病例得以成功。但在6個月內30-50％的病人發生了再狹窄。
血管介入操作有損傷血管壁的傾向。這樣的損傷引起血管平滑肌細胞增殖，產生了內膜增生。該增殖可能部分是由于粘附于動脈損傷部位的血小板釋放的血小板衍生生長因子的作用。內膜過度增生導致了再狹窄，即動脈腔的再狹窄。這樣，動脈再狹窄可能嚴重地限制了血管介入操作長期有效。
發明綜述現已發現，在關鍵狹窄部位溶解血栓后吸入氧化氮(NO)氣體會增加血管的開放，但不會產生任何全身性的血液動力作用。在停止吸入NO后吸入的NO的抗血栓作用仍會持續。也已發現，吸入NO會抑制由內膜過度增生造成的動脈再狹窄。
因此，本發明的一個特征是通過讓哺乳動物吸入治療有效量的氣態NO來治療、抑制或預防哺乳動物血栓形成的方法。血栓形成可能與疾病或損傷有關。
本發明的另一個特征是通過給哺乳動物吸入治療有效量的氣態NO來治療、抑制或預防動脈再狹窄。動脈再狹窄可能與疾病或損傷有關。
可以配合NO的吸入給哺乳動物施用能增加吸入NO的有益作用的第二個化合物。第二個化合物增加吸入NO有益作用的一個方法是延長吸入的NO在靶組織或能與靶組織作用的細胞中的作用時間，但不產生全身性的血管擴張和全身血壓同時下降的不良作用。更具體的是，可以配合NO吸入(即吸入前、吸入期間和吸入后)通過給予磷酸二酯酶抑制劑來延長吸入的NO的抗血栓和/或內膜增生的抑制作用。較好的磷酸二酯酶抑制劑能選擇性抑制cGMP-特異性磷酸二酯酶，它們同時對其它磷酸二酯酶分解對腺嘌呤核苷3’，5’-環單磷酸酯(cAMP)的的影響最小。有前述特異性的較好的磷酸二酯酶抑制劑是ZaprinastTM(M&B22948；2-鄰-丙氧基苯基-8-氮雜嘌呤-6-酮，Rhone-Poulenc Rorer，英國)。另外一些cGMP特異性磷酸二酯酶抑制劑是已知的，可用來代替ZaprinastTM。
第二個化合物能增強NO吸入有益作用的另一個方法是延長體內NO的半衰期。這可通過，例如給予超氧化物歧化酶來實現。超氧化物歧化酶可除去會與NO反應的超氧化物游離基。
在另一個較好的技術方案中，可以配合NO的吸入對哺乳動物給以能增加吸入的NO抗血栓作用的第二個抗血栓劑。它的例子包括阿司匹林、噻氯匹啶、單克隆抗體、硝酸甘油和硝普鈉。
這里所用的術語“急性冠狀動脈缺血綜合征”表示冠狀動脈急性閉塞，如急性心肌梗死、不穩定型心絞痛、逐漸增強型心絞痛(crescendo angine)、心絞痛、冠狀介導綜合征(coronary inter mediate syndrome)、血栓形成后心絞痛狀態和PTCA后的心絞痛狀態。
這里所用的“抗血栓劑”表示能抑制血栓形成，刺激血栓溶解或有兩者作用的藥物。
這里所用的“內膜增生”表示作為對動脈上皮剝露的一種反應，動脈內膜的平滑肌細胞發生增生。
這里所用的“血管再通”表示對哺乳動物部分機體血供的再建立。
這里所用的“靶細胞”表示在吸入NO后直接與NO相互作用以介導抑制、預防或治療血栓形成或動脈再狹窄的有益作用的非肺細胞。
這里所用的“氣態NO的治療有效濃度”是在病人中誘導一種或多種下列作用的濃度減輕胸痛、減輕呼吸局促、消除局部缺血的心電圖變化、以及改進冠狀動脈血流(這可由血管照影術顯示)。
這里所用的磷酸二酯酶抑制劑的“治療有效”量是可增加氣態NO治療作用的持續時間(即半衰期)或大小的量。
這里所用的“血栓形成”表示血凝塊在血管中形成或存在，該血凝塊會導致由該血管供給的組織的梗死或局部缺血。
這里所用的“動脈再狹窄”表示由于內膜過度增生引起的動脈腔的異常狹窄。
這里所用的“血管介入操作”表示涉及對血管進行解剖破壞或機械破壞的任何外科手術方法。血管介入操作的非排除性名單包括氣囊血管成形術、激光血管成形術、冠狀動脈手術、動脈粥樣化切除術(atherectomy)和冠狀動脈斯滕特固定模。
這里揭示的方法可用來治療、抑制或預防血栓形成，如由自然發生的疾病，如動脈粥樣硬化造成的血栓形成，或由血管介入操作，如血管成形術或冠狀動脈分流手術造成的血栓形成。這里揭示的方法在治療、抑制或預防由內膜過度增生造成的動脈再狹窄中也是有用的。這類動脈再狹窄是與血管介入操作，如PTCA或冠狀動脈分流手術有關的常見并發癥。
根據本發明，可以這樣給予NO氣體(a)連續或間歇地；(b)不吸煙地；(c)濃度為0.1-300ppm，較好的濃度是1.0-200ppm，最好的濃度是20-100ppm；(d)以包括NO、氧氣(O2)和氮氣(N2)或其他惰性氣體的混合物，較好的FiO2(O2的體積比)是0.20-0.99，空氣中O2的比例為0.21，在吸入前不久(如吸入前5分鐘內，較好的是在吸入前1分鐘內)使NO氣體與含O2的氣體混合；以及(e)以這樣的方法，使之監測NO2濃度并使之保持在安全的限度里(如少于1ppm)。
本發明一個重要的進步在于吸入NO不會誘發全身血管擴張和產生急性的全身高血壓。全身血管擴張是不希望的、有潛在危險的副作用，它與經口服或靜注給藥的以前用來抑制血栓形成或抑制內膜過度增生的NO供體化合物緩慢向全身釋放NO有關。
本發明的其它特征和優點可從下面較好的技術方案和權利要求的說明中得以顯示。
附圖簡述

圖1A是犬冠狀動脈血栓形成模型中，在0ppmNO吸入前、吸入期間和吸入后與對照組比較動脈開放時間(作為總時間的百分數)的圖。
圖1B是犬冠狀動脈血栓形成模型中，在20ppmNO吸入前、吸入期間和吸入后與對照組比較，動脈開放時間(作為總時間的百分數)的圖。星號表示數值與基線有顯著的差異(p＜0.05)。
圖1C是犬冠狀動脈血栓形成模型中，在80ppmNO吸入前、吸入期間和吸入后與對照組比較動脈開放時間(作為總時間的百分數)的圖。星號表示數值與基線有顯著的差異(p＜0.05)。
圖1D是犬冠狀動脈血栓形成模型中，在200ppmNO吸入前、吸入期間和吸入后與對照組比較動脈開放時間(作為總時間的百分數)的圖。
圖2是樣品暴露于0ppmNO或400ppmNO時得出的ADP誘導的犬血小板聚集曲線。
圖3是吸入NO對犬血小板聚集的作用的劑量反應數據圖。
圖4是將對照組大鼠；暴露于20ppmNO達兩周的大鼠；暴露于80ppm NO達兩周的大鼠；暴露于80ppmNO達一周，然后呼吸一周空氣的大鼠的內膜/血管中層之比進行比較的圖。星號表示數值與基線有顯著差異(p＜0.05)。
發明詳述血栓形成本發明提供了治療、抑制或預防哺乳動物，如人體血管血栓形成的簡單、迅速、具選擇性且有效的方法。被治療、抑制或預防的血栓形成可由各種導致血栓形成的原因造成。例如，血栓形成的類型可為創傷后的動脈血栓形成。血栓形成可在哺乳動物體內的任何部位。例如，血栓形成可處于動脈、靜脈、冠脈、大腦、股、腎臟或胎盤。較好的是，被治療、抑制或預防的血栓形成的部位不在肺部。
冠狀血栓形成常常與急性冠狀動脈局部缺血綜合征有關。任何與血栓形成有關的急性冠狀動脈局部缺血綜合征可通過施用本發明涉及的吸入NO來治療、抑制或預防。與血栓形成有關的急性冠狀動脈局部缺血綜合征可能與，如動脈閉塞疾病或血管介入操作有關。與血栓形成有關的急性冠狀動脈局部缺血綜合征包括，但不限于，心肌梗死、不穩定型心絞痛、冠狀血管再通后的血栓形成和冠狀血栓溶解后再閉塞。冠狀血管再通可通過各種已知的血管介入操作，如通過PTCA、激光血管成形術、冠狀動脈分流移植、冠狀動脈粥樣病變切除術或冠狀動脈斯脫滕特固定模來進行。
根據本發明，可給被診斷患有血栓形成的哺乳動物施用NO的吸入。已知哺乳動物，特別是人，可以顯示與血栓形成存在有關的各種體征和癥狀，從而可被診斷。這類體征和癥狀的識別屬于醫學領域的范疇。病人的血栓形成的體征和癥狀包括，但不限于，胸痛、呼吸局促、麻痹、肢體痛、心肌梗死、心絞痛、不穩定型心絞痛、逐漸增強型心絞痛、局部缺血性心力衰竭、心原性休克、外周血管疾病和肢體局部缺血。在本發明一個較好的技術方案中，上述的哺乳動物是發生血栓形成的人體，通過吸入NO治療的血栓形成為心肌梗死。
另外，也可用吸入NO來抑制或預防沒有血栓形成但認為有發展成血栓形成的危險的哺乳動物血栓形成的出現。已知某些病情，如動脈粥樣硬化使個體有形成血栓的危險。另外，某些血管介入操作，如氣囊血管成形術和冠狀動脈分流手術會使個體有形成血栓的危險。因此，被診斷患有會增加血栓形成危險的疾病的個體、經受了一種或多種血管介入操作的個體，和即將進行一種或多種血管介入操作的個體，可有利地用本發明的方法進行治療。
相似的是，上述的哺乳動物可為有出現血栓形成的危險的人體，該危險與動脈閉塞性疾病，如動脈粥樣硬化是有關聯的。患這類疾病的個體可由醫學相關領域的醫生來判定。
在本發明另一個較好的技術方案中，危險與諸如血管成形術的血管介入操作有關。在更好的技術方案中，上述的哺乳動物是經過PTCA操作造成的有血栓形成危險的人體。
動脈再狹窄本發明提供了治療、抑制或預防由內膜過度增生造成的動脈再狹窄的簡單、迅速、有選擇性的有效方法。內膜過度增生和動脈再狹窄常發生在諸如任何血管(如頸動脈、股、冠狀等)成形術的血管介入操作之后；或在任何冠狀血管再通術，包括氣囊血管成形術、激光血管成形術、冠狀動脈分流移植術、動脈粥樣病變切除術或冠狀動脈斯滕特固定模后發生。
可施用本發明的吸入NO來治療上述已有動脈再狹窄的哺乳動物。已知這些哺乳動物具有與動脈再狹窄存在相關的體征和癥狀，從而可進行診斷。這類體征和癥狀由醫學領域的人員來識別。哺乳動物中動脈再狹窄的體征和癥狀包括，但不限于胸痛、呼吸局促、心電圖改變和冠狀血管造影所見。吸入NO來治療已存在的動脈再狹窄的目的是降低已再狹窄的脈的內膜厚度，以增加動脈腔的直徑，即減少病理性狹窄。
另外，根據本發明，可使用吸入NO以抑制或預防沒有動脈再狹窄但被認為有形成動脈再狹窄危險的哺乳動物(如人)的動脈再狹窄。某些血管的介入操作，如，PTCA和冠狀分流手術會導致動脈創傷。已知動脈創傷會引起內膜過度增生和動脈再狹窄。因此。這些操作會使病人有出現動脈再狹窄的危險。因此，經受了一個或多個血管介入操作的個體和即將進行一種或多種血管介入操作的個體，可有利地用本發明的方法進行治療。
可給準備進行血管介入操作的病人吸入NO。可在血管介入操作之前吸入NO以使一般與血管介入操作相關的動脈創傷之后發生的內膜增厚的數量達到最小。在血管介入操作之前吸入NO作為預防性措施的病人可以有也可以能沒有動脈再狹窄。另一個方法是，可給已進行血管介入操作的病人吸入NO。在該情況下，較好的是在血管介入操作數小時內開始吸入NO。當然，該技術領域的人員認為吸入NO可在血管介入操作之前、期間和之后進行。不論是在操作前、期間或之后，或在所有的三個階段吸入NO，均可連續或間歇地吸入NO。
給予吸入的NO較好的是用儲存的、壓縮NO氣源給予吸入的NO。可從市售的供應者，如Airco(美國新澤西)得到市售的壓縮NO氣體，典型的是在純N2氣中200-800ppmNO的混合物。NO源可為100％NO、或被N2或任何其它惰性氣體(如氦)稀釋。很重要的是得到及儲存沒有任何污染的O2或其它較高級氮氧化物的混合物，因為較高級的氮氧化物(它們可通過O2與NO反應來形成)對肺組織是潛在有害的。需要時，在給予病人前用已知的方法以化學發光分析來顯示NO的純度。化學發光NO-NOx分析器可購得(如，14A型，Thermo EnvironmentalInstruments，美國馬里蘭)。NO-N2混合物可通過例如先前經肺活量計校正的轉子流量計與空氣或O2混合。呼吸混合物中NO的最終濃度可用該技術領域公知的化學或化學發光技術來確證(如，Fontijin等，分析化學(Anal.Chem.)42575(1970))。另外的方法是，通過電化學分析器來監測NO和NO2濃度。通過暴露于NaOH溶液、baralyme或堿石灰可以分離出諸如NO2的雜質。作為另一種控制，也可分析最終氣體混合物的FiO2。需要時，可以在換氣機的呼氣出口處加上氣體捕集器以保證不會有明顯數量的NO逸入鄰近的環境。
在住院部或急診室內，這樣給予NO氣體例如N2中的壓縮NO的容器與氧氣或氧氣/N2混合物的第二個容器可被連接到吸入器，使之能混合來自兩個氣源的氣體；控制每一氣源的氣體流量，可將病人吸入的NO濃度保持在最佳水平。NO氣體也可用標準的低流量混合器(如，Bird Blender，美國加利福尼亞)與室內的空氣混合。通過使用電NO生成器可從N2和O2(即空氣)中產生NO。這類生成器如Zapol的美國專利申請07/850,383(已得到授權通知書)所述，這里引證供參考。另外，NO可間歇地由吸入器提供。若配合NO，口服或吸入地給予磷酸二酯酶抑制劑時，使用吸入器尤為有利。
可用空氣、純氧或另一合適的氣體或氣體混合物以0.1ppm-300ppm濃度的NO按需要的持續時間給予被診斷患血栓形成或動脈再狹窄的哺乳動物，或被診斷為有形成血栓或動脈再狹窄危險的哺乳動物。較好的濃度為1.0ppm-200ppm；最好的濃度為20ppm-100ppm(如，30ppm，40ppm，50ppm，60ppm或80ppm)。當需要即刻出現明顯效果時，短時間里可暫時增加濃度如5分鐘里濃度為300ppm NO。由于下面解釋的原因，同時用磷酸二酯酶抑制劑處理可降低所需的NO的總劑量(或允許間歇給藥)以產生令人滿意的抗血栓或抗再狹窄作用。
為了治療、抑制或預防動脈再狹窄，對于長期如使用數天或數周，可以通過鼻管、面罩、帷幕、氣管內導管給予吸入的NO。可以在長時間里連續給予吸入的NO，另外，也可在長時間里間歇地給予。可通過自發換氣或機械換氣給予氣態NO。
對吸入NO的作用的評價當吸入的NO被用來治療、抑制或預防血栓形成或動脈再狹窄時，需要監測NO吸入的作用。這類的監測可用于具體的個體以證實其所需要的作用和不良的副作用。這類監測也可用來給給定的個體調節劑量水平、吸入NO的持續時間和頻率。
較好的是，吸入NO對病人的作用通過下列一種或多種方法來評價臨床表現，如胸痛；心電圖；用超聲波、冠狀血管造影或其它方法對血管開放情況的一系列分析；以及血漿或血小板中cGMP水平的上升。
磷酸二酯酶抑制劑通過與分子氧反應可使NO迅速分解產生亞硝酸鹽和硝酸鹽。另外，NO進入血液后通過與血紅蛋白緊密結合而迅速失活。由于這些原因，NO在動脈血中的半衰期很短。這表明吸入NO可有利地避免全身血管擴張，這是一種與從NO供體化合物緩慢地全身釋放NO有關的不希望的有潛在危險性的副作用。
可能需要在靶細胞或與肺部靶細胞相互作用的細胞里延長吸入的NO的有益作用。在血栓形成抑制、預防和治療中，循環的血小板是靶細胞。在動脈再狹窄抑制、預防和治療中，循環的血小板(可能還有白細胞)是與血管中靶細胞相互作用的細胞。
為了確定如何延長吸入的NO的有益作用，有用的是考慮NO的體內作用是溶解的鳥苷酸環化酶的活化，它刺激了鳥嘌呤-3’，5’-環單磷酸酯(cGMP)的產生。NO的至少一些有益作用是由NO刺激cGMP生物合成而產生的。因此，在本發明較好的技術方案中，配合NO的吸入給予磷酸二酯酶抑制劑，以抑制由于內源性磷酸二酯酶而使cGMP分解。
磷酸二酯酶抑制劑可通過任何合適的方法，包括通過口服、透粘膜給予、靜脈注射、肌注、皮下注射或腹腔內注射途徑引入哺乳動物。另外的方法是，抑制劑可通過吸入給予哺乳動物。對于吸入，磷酸二酯酶抑制劑可有利地被制成干燥粉末或氣溶膠化的溶液，其顆粒或液滴大小少于10微米以能最佳地沉積于肺泡中，并可任意地在含NO的氣體中被吸入。
較好的磷酸二酯酶抑制劑是ZaprinastTM(M&B 22948；2-鄰-丙氧基苯基-8-氮雜嘌呤-6-酮；Rhone-Poulenc Rorer，英國)。ZaprinastTM選擇性地抑制cGMP水解，而對血管平滑肌細胞中cAMP的分解作用極小(Trapani等，藥理學與實驗治療雜志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)258269(1991)；Harris等，藥理學與實驗治療雜志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)249394(1989)；Lugnier等，生化藥理學(Biochem.Pharmacol.)351743(1986)；Souness等，英國藥理學雜志(Br.J.Pharmacol.)98725(1989))。當根據本發明使用ZaprinastTM時，較好的給藥途徑是靜注或口服。合適的劑量范圍由該技術領域的人員決定。可制備在0.05NNaOH中的ZaprinastTM儲備溶液。然后儲備溶液可在使用前即刻用Ringer氏乳酸鹽溶液稀釋到所需的最終ZaprinastTM濃度。
本發明可用其它磷酸二酯酶抑制劑來實施。各種磷酸二酯酶抑制劑是該技術領域已知的，包括雙嘧達莫(dipyridamole)和茶堿。像ZaprinastTM一樣，給藥途徑和合適的劑量范圍由該技術領域的人員來決定。
配合NO吸入的其它抗血栓劑可用抑制血栓形成的藥物，刺激血栓溶解的藥物，或兩者兼有的藥物來治療血栓形成。抗血栓藥物的例子是阿司匹林、鏈激酶、尿激酶、組織纖維蛋白溶酶原活化劑(“t-PA”)、met-t-PA(即具有N-末端甲硫氨酸殘基的t-PA)、FE1X(t-PA類似物)肝素、水蛭素和HirulogTM(水蛭素的類似物)。其它抗血栓劑也可用來實施本發明。在用吸入NO的治療前、期間和治療后可給予一種或多種這類抗血栓劑，結果它們獨立的抗血栓活性有利地增加了吸入的NO的抗血栓作用。
例如，在本發明的一個技術方案中，在吸入NO前、期間和吸入NO后即刻給予適當劑量t-PA以治療血栓形成。雖然吸入NO可抑制或預防新血栓的形成，但t-PA可刺激下列血栓的溶解(1)在吸入NO時已經存在的血栓，或(2)在NO吸入時和剛吸入后形成的血栓(雖然其形成速度降低)。選擇合適的抗血栓劑以配合吸入的NO，這些抗血栓劑的合適劑量和給藥途徑由該技術領域人員決定。
在本發明的較好技術方案中，在NO吸入前、期間和吸入后即刻給予阿司匹林以治療血栓形成。較好的阿司匹林劑量范圍是每天81-325毫克(口服)。
已經分別解釋了本發明的兩個方面(即，血栓形成和動脈再狹窄)，它也應適用于已經有或將有血栓形成和動脈再狹窄的危險的個體。在這樣的條件下，本發明的兩個方面可在同一個體中單獨給予吸入的NO來同時實施。
實驗信息血栓形成實驗NO的抗血小板作用已經在認可的血栓形成后急性冠狀血栓溶解的犬模型中得以評價。所用的犬模型基本如Yasuda等(美國心臟病聯合會雜志(J.Am.Coll.Cardiol.)131409(1989))和Gold等(循環(增刊IV)(Circulation，suppl.IV)83IV26(1991))所述。
使25只兩種性別兼有的成年雜種狗(20～25kg)用戊巴比妥(30mg/kg體重)麻醉。按需補充給予戊巴比妥以保持全身麻醉狀態。給狗的支氣管插管，用FiO2為21-35％的換氣機(Hudson Ventronics，美國加利福尼亞)以15次呼吸/分鐘和10-15毫升/kg給它們的肺部進行機械換氣，調節以保持動脈血中O2在80-100mmHg。實驗中用脈沖血氧計(Nellcor，Inc.，美國加利福尼亞)來連續監測氧飽和度。
股動脈和靜脈用聚氯乙烯導管插入以連續地測量動脈壓、取血樣和輸注。發生心律失常時給予利多卡因0.1mg/kg/分鐘滴注。經左第五肋間進行胸廓切開術。打開心包并懸掛制成心包支架。解剖游離左前降動脈，分離出遠離第一斜支的2.5cm片斷。抽取1毫升血供形成血栓。將0.7毫米內徑的導管插入分離的左前降冠狀動脈片斷的側支，將超聲流量探頭(T101Transonic System，Inc.，美國紐約州)冠狀放在動脈的近端以連續地監測血流。用2毫米寬的塑料線(Mass Gas andElectric Supply，美國馬里蘭)逐漸收縮地繞于左前降動脈正好為準備形成血栓的部位的遠端，將血流量限制于50±10％的基線。以前的血管造影術研究顯示這將使腔直徑降低90％以上。
分離的左前降冠狀動脈通過用鈍的鑷子在3-5秒期間進行四次連續的外壓造成創傷，以損傷內皮并促進血栓粘附。在探頭的遠端和接近收縮部位處形成套圈式閉塞。通過側支導管將凝血酶(0.1ml 100單位/毫升；Thrombinar，ArmourPharmaceutical，美國伊利諾斯)與0.3毫升血液的混合物注射入空的冠狀動脈片斷以誘導血栓形成。10分鐘后，松開近端的套圈。2分鐘后，松開遠端的套圈。血栓形成后10分鐘，靜脈推注肝素(75UI/kg)，然后連續用肝素輸注(50UI/kg/小時)。穩定的閉塞30分鐘之后，每隔15分鐘給予重組體t-PA(0.45mg/kg；ActivaseTM，Genentech Inc.，美國加利福尼亞)，直到血栓化的冠狀動脈再通，或最多給予四次推注。
左降冠狀動脈初次再流動之后，以該操作誘發幾個交替的再通和再閉塞(定義為低于25％狹窄后流量)階段。記錄開放時間/總時間的比值作為原始的結果變量。連續記錄心電圖、全身動脈血壓、左心房壓和冠狀血流。(1)沒有再灌注的動物，(2)沒有閉塞的再灌注動物，(3)在最初45分鐘觀察階段少于3個周期的動物，或(4)在第一觀察階段結束前死亡的動物，被排除在進一步研究之外。
用標準低流量混合器(Bird Blender，美國加利福尼亞)使NO氣體(在氮氣中含800ppmNO，Airco，美國新澤西)與室內空氣混合，然后調整NO的量，以在送入換氣機之前保持FiO2恒定。吸入的NO水平用化學發光NO-NOx分析器(14A型，Thermo Environmental Instruments，美國馬里蘭；Fontijin等，同上)連續監測。在含NO的氣體混合后，測量遠離儲袋處的FiO2(氧定量計5590號，Hudson，美國加利福尼亞)。呼出的氣體以及從化學發光分析器排出的氣體通過使用由實驗室中央真空系統維持負大氣壓的文丘里呼氣捕集器來捕集。間歇地用化學發光法測量的環境NO/NOx水平在實驗期間并不增加。每次取出樣品并測量正鐵血紅蛋白水平。監測心率、血壓和冠狀流量。并連續記錄。
經45分鐘基線研究之后(預處理階段)，將動物分成四組組A(n＝6)給予0ppm NO吸入(即空氣)達45分鐘；組B(n＝6)給予20ppmNO吸入達45分鐘；組C(n＝6)給予80ppmNO吸入達45分鐘；組D(n＝6)給予200ppm NO吸入達45分鐘。所有各組動物然后再進行第三階段觀察，以停止給予NO開始，持續45分鐘(處理后階段)。
體外測量血小板聚集來自8只狗的血液被收集在0.01M檸檬酸鹽中，在室溫下以370×g離心5分鐘，以制備富血小板血漿(PRP)，在1200×g下離心10分鐘以制備乏血小板血漿(PPP)。在試驗時PRP僅暴露在塑料容器中或硅烷化的玻璃器皿中。通過用PPP稀釋來調節PRP的血小板計數(Thrombocounter CTM血小板計數器，Coulter Electronics，Inc.美國弗羅里達)以達到300,000/mm3±10％。PRP然后取數分放置小杯中，同時在雙通道集合度計器(440型，Chrono-Log Corp.，美國賓夕法尼亞)中于磁力攪拌下于(1000rpm)、37℃培養。在記錄器(707型，Chrono-Log Corp.，美國賓夕法尼亞)上連續記錄透光度。聚集的樣品管用橡皮塞塞住，經過該塞子放兩支19號針頭(Sherwood Medical，美國密蘇里)，使NO氣體和氧氣的混合物能送至PRP之上入口針頭經流量計與氣體儲器連接，在氣體儲器中送入如上所述中調整的NO氣、空氣和氧氣的混合物。用化學發光NO-NOx分析器連續監測NO濃度。調節針閥使通過樣品的流量約為40毫升/分鐘。通過將出口針頭與充有5厘米水的接受燒瓶連接來保持系統具有正壓，水中保持不斷鼓泡。
ADP誘導的血小板聚集測定研究是在含450微升已調好的PRP的試驗小杯暴露于NO氣體混合物達10分鐘后進行的。在測量ADP誘導的聚集期間連續給予氣體。以隨機的次序，用20、80、200和400ppmNO處理的不同PRP來研究血小板聚集。在給予NO之前和之后進行不暴露于NO的對照的ADP誘導的血小板聚集研究以評價PRP制劑的穩定性。所有的實驗在血樣收集后4小時內完成。
數據分析動脈開放的定義是造成最初的狹窄之后，流量大于25％基礎流量的時間占總的觀察時間的分數。除非另作說明，結果被表達成平均值±SEM。組之間差異的顯著，對于成對或不成對的值用Student的t-試驗確定。NO對ADP誘導的血小板聚集的作用的劑量反應的顯著性用方差的雙向分析評價。p值＜0.05被認為具顯著性。
狗的血栓溶解和再灌注模型的結果在每個實驗組中，外部收縮使左前降動脈血流減少基線的54±2％，從22±2減少到10±1毫升/分鐘。為達到再灌注所需的tPA推注次數的中位數為2，范圍是1-4(表1)。除了一個沒有發生再閉塞之外，在其它所有動物中周期性的再流動和再閉塞伴隨著心電圖出現心肌損傷的跡象；未發生再閉塞的動物被排除在進一步的研究之外。
表1生理參數的基線值
表1中“tPA推注次數”指推注的次數；“ACT”指激活凝血時間；“FiO2”指吸入的O2分數；“比率”指基線時冠狀動脈的比值未閉塞/閉塞；“血小板計數”指血小板的數目；“MetHb”指正鐵血紅蛋白(總血紅蛋白的百分數)。在吸入NO 0ppm(對照)、20ppm、80ppm和200ppm時的基線流速比沒有顯著差異(每組n＝6)。
吸入NO對動脈開放的作用吸入0ppmNO(組A)的動物中，在三個處理階段動脈的開放沒有改變(圖1A)。吸入20ppmNO(組B)的動物中，動脈開放從吸入NO前的基線階段的50.6±6.9％增加到吸入階段的63.8±7.9％(p＜0.01)(圖1B)。在吸入80ppmNO的動物中(組C)，動脈開放從吸入前基線階段的48.8±2.9％增加到吸入階段的75.1±6.7％(p＜0.01)(圖1C)。在吸入200ppmNO的動物中(組D)，動脈開放從吸入前基線階段的45.27±5.6％增加到吸入期的54.8±10.4％(p＝不顯著)(圖1D)。組C中觀察到的NO吸入階段的動脈開放增加持續到吸入后階段的45分鐘(70.1±7.1％對基線，p＜0.05)。
在匯集組B、C和D的吸入階段的動脈開放結果時，匯集的處理組和對照組之間有統計上顯著的差異(p＜0.005)。在匯集組B、C和D吸入后45分鐘階段動脈開放的結果時，匯集的處理組和對照組之間也有統計上顯著的差異(p＜0.005)。
每組動物的血小板計數和血紅蛋白在吸入NO的期間和之后都沒有改變(表3)。在吸入200ppmNO的狗的呼吸中，正鐵血紅蛋白水平從0.2±0.1％增加到1.1±0.4％(表3)。在停止給予NO后該增加仍然持續，給予低劑量NO的狗沒有這種現象。
在該研究中所有組的狗的全身動脈壓都下降，吸入或沒有吸入NO的狗之間沒有差異(表2A)。在整個研究過程中所有組動物的左心房壓都沒有改變(表2B)。
表2A在吸入NO前、期間和吸入后的平均全身動脈壓(SAP)(mmHG)
數值被表示成平均值±SEM。
表2B在吸入NO前、期間和吸入后的平均左心房壓(LAP)(mmHG)
數值被表示成平均值±SEM。
NO對ADP誘導的體外血小板聚集的作用向PRP之上的氣體混合物加入20、80、200和400ppmNO，使ADP造成的透光度的最大變化產生了劑量相關性的下降(圖3)每一研究開始和結束時進行的兩條對照聚集曲線的ADP誘導的光的透光度的下降沒有改變(30.57±5.5％相對31.1±4.31％)。
表3在吸入NO前、期間和吸入后的血紅蛋白值
上述結果顯示吸入NO在溶解了關鍵的狹窄部位的血栓之后增加了冠狀動脈的開放，但不產生任何全身性的血液動力學作用。它們也顯示吸入NO的抗血栓作用在停止吸入NO后可至少持續45分鐘。在相似于體內所達到的NO濃度之下，氣體NO明顯抑制了體外的ADP誘導的血小板聚集。
內膜增生實驗新生內膜平滑肌細胞增生是人體動脈再狹窄的主要病理機制。因此，為了闡明吸入NO對血管介入操作如PTCA后的再狹窄的作用，現用大鼠頸動脈的動脈損傷模型來研究吸入NO對內膜增生的作用(Clowes等，實驗室研究(LaboratoryInvest.)，49372(1983))，這是對于人體新生內膜平滑肌細胞增生的標準的動物模型。
動脈損傷用以前證明會引起新生內膜增生的方法(Clowes等，同上)使成年雄性Sprague-Dawley大鼠(charles River Laboratories，MA)頸動脈產生氣囊損傷。通過腹腔內注射氯胺酮(60-80mg/kg)和乙酰丙嗪(0.1mg/kg)使體重300-350克的大鼠麻醉。一旦得到滿意的麻醉效果，作縱向中線切開，用鈍器解剖法分離左頸動脈。進一步仔細解剖出頸內和頸外動脈的分支點，頸外動脈的遠端用4-0號絲線結扎。用微型解剖剪刀對頸外動脈作動脈切開術，通過動脈切口插入2French Fogarty氣囊導管(Baxter Edwards LIS)，推進到在頸動脈分支點之下2厘米處。氣囊用足量鹽水充盈使頸總動脈可見到膨脹，并慢慢退出到分支水平。然后除去氣囊導管，允許經動脈切開位點反向出血(bak bleeding)以消除潛在的血栓和空氣泡之后，在動脈切開點近端用4-0號絲線結扎頸外動脈。肉眼檢查以保證頸總動脈有充分的搏動后，縫合手術口讓動物從麻醉狀態恢復正常。
慢性吸入NO在特別制備的40升丙烯酸吸入室內進行NO慢性吸入。用對氧氣、加壓的空氣和NO儲存氣體(在N2中的800ppm和10,000ppmNO，美國新澤西)分開調節和校準的流量計來混合氣體混合物。在整個實驗階段定期分析來自該吸入室的氣體以保證穩定的FiO2和NO水平。用極譜電極(Hudson Oxygen Meter 5590，美國加利福尼亞)測量FiO2；通過化學發光(型號14A，Thermo Environmental Instruments，Inc.，美國馬里蘭)測量NO濃度；在通過加熱的不銹鋼爐(850℃)以98％的效率將NOx轉化為NO(型號100B NOx發生器，Thermo Environmental Instruments，Inc.，美國馬里蘭)之后，二氧化氮和較高氧化態的氮(NOx)用化學發光測量。在吸入室內保持新鮮的堿石灰以減少NOx。根據實驗將NO濃度保持在20-80ppm。一系列測量表明FiO2是21％，NOx是3-4ppm。存在在暴露室內的氣體和從化學發光裝置中排出的氣體，用以實驗室中央真空系統保持負大氣壓的文丘里捕集器來捕集。
對照動物被放在與NO處理動物相同的室內的帶過濾器的籠子內。在手術操作前30-120分鐘開始暴露于NO。在手術操作期間，將NO處理組從吸入室取出，并通過來自吸入室的流入氣體管進氣的改良的面罩來暴露于NO。吸入氣體的分析表明，在80ppm實驗中NO水平取出為50-80ppm，在20ppm手術實驗期間為10-20ppm。每只動物從吸入室中處于面罩下的總的時間范圍為20-40分鐘。
形態測定分析氣囊損傷后1、3和14天后用致死量的戊巴比要鈉或氯胺酮經腹腔注射來處死大鼠。將16號導管通過左室尖端引入升主動脈。結扎降胸主動脈。然后在100mmHg壓力下用100毫升生理鹽水、再用50毫升2％在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的聚甲醛灌注動物。體內固定15-30分鐘后，分離出兩個頸總動脈，通過浸在1％PBS中的聚甲醛中過夜來進一步固定。接著用連續增加的乙醇濃度然后是二甲苯使組織脫水，接著包埋在石蠟中。切下橫切面(6微米)，用蘇木精和曙紅和/或彈性蛋白染色以供分析。每個動物鄰近頸動脈分支點的7-8毫米取一個切面用于分析。被分析的切面以100×進行照相。用Kodak 2135TN掃描器使圖像數字化。在Power Macintosh 8100/80TM計算機上用公共流通NIH圖像程序(U.S.National Institutes of Health的Wayne Rasband編寫，可得自互聯網Iippy.nimh.nih.gov(按無名文件傳輸協議)或NTIS，5285的軟盤(美國弗吉尼亞)；材料號PB93-504868)進行內膜和血管中層面積的分析。由對實驗組不了解的研究進行形態測定分析。
統計學分析用市售的StatviewTM(Abacus Concepts)軟件在MacintoshTM計算機上進行統計學分析。用不成對的雙尾t-試驗對實驗組與對照組進行比較。p＜0.05被認為統計學上顯著。所有的數據被表示成平均值+/-SEM。n值指每組動物數。
嚙齒類再狹窄模型的結果使總共62個大鼠經過頸動脈損傷操作。5只大鼠在動脈切開術中或氣囊損傷時因血管并發癥而死亡，操作的死亡率為8％。在不同實驗組間未見有統計學意義的死亡分布失常。在最初操作中存活的57只大鼠在操作后沒有死亡。在整個實驗階段，所有的大鼠，不論其所屬的實驗組，都有正常的飼養行為和活動水平。除了頸動脈損傷一側偶見下垂，大鼠都沒有顯示肉眼可見的神經缺陷。分析實驗組的各動物表明暴露于空氣、20ppmNO和80ppmNO對體增加沒有統計學上的差異。
在第一系列實驗中，進行頸動脈氣囊損傷的大鼠在整個實驗過程中或被暴露于周圍空氣(n＝12)或被暴露于有80ppmNO的空氣(n＝13)。于損傷后14天殺死動物對受損傷的頸動脈進行形態測定分析。光學顯微鏡檢查表明來自空氣(對照)組的3只大鼠和來自NO處理組的1只大鼠在受損傷的頸動脈腔內顯示血栓閉塞。這些動物被排除在進一步的分析之外。如所預期，來自兩組的血管顯示了上皮的缺失，并產生了新的內膜增生。用光學顯微鏡沒有發現新生內膜細胞形態學上質的差異(數據未顯示)。但是，定量分析發現，吸入80ppmNO對新生內膜增生有38％的抑制，即，與0ppmNO(對照，1.512+/-0.147)動物相比，80ppm動物的內膜/血管中層之比為0.932+/-0.13(p＝0.008)(圖4)。
在下一系列的實驗中，試驗了暴露于N01周的作用。在殺死動物前將實驗組(n＝7)暴露于80ppmNO 7天，然后轉移到空氣中再7天。對照組(n＝5)在空氣中暴露整整14天。組之間沒有形態上質的差異。另外，定量分析內膜/血管中層比值表明兩組之間的新生內膜增生沒有顯著的差異，即與1.217+/-0.309的對照組相比，NO處理動物為1.059+/-0.239(p＝沒有意義)(圖4)。
在第三系列實驗中，研究低劑量吸入NO大鼠吸入20ppmNO(n＝8)或空氣(n＝8)。在2組之間沒有發現新生內膜增生程度有質或量的差異，即與吸入空氣的對照組內膜/血管中/之比為0.985+/-0.149相比，20ppmNO處理的動物為0.917+/-0.233(p＝沒有意義)(圖4)。
上述結果顯示在2周內吸入80ppmNO會明顯抑制嚙齒類動物在氣囊誘導頸動脈損傷后新生內膜的增生。
本發明的其它技術方案被下列權利要求所揭示。
權利要求
1.氣態NO在制備用于治療或預防由內膜過度增生造成的哺乳動物動脈再狹窄藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其中治療或預防是采用包括下列步驟的方法(a)診斷出有動脈再狹窄或有形成動脈再狹窄的危險的哺乳動物；以及(b)讓所述的哺乳動物吸入治療有效濃度的氣態NO。
3.根據權利要求1或2所述的應用，其中所述的哺乳動物為人體。
4.根據權利要求1或2所述的應用，其中所述的哺乳動物已經經受或準備經受血管介入操作。
5.根據權利要求4所述的應用，其中所述的血管介入操作選自血管成形術、冠狀動脈手術和冠狀動脈斯滕特固定模。
6.根據權利要求5所述的應用，其中所述的操作是經皮經腔冠狀血管成形術(PTCA)。
7.根據權利要求1或2所述的應用，其中所述的NO按預定濃度范圍吸入。
8.根據權利要求7所述的應用，其中所述的濃度范圍是0.1ppm-300ppm。
9.根據權利要求1或2所述的應用，其中所述的氣態NO以包括NO、O2和N2氣的混合物吸入。
10.根據權利要求9所述的應用，其中所述的混合物包括按體積計，20％-99％的O2氣。
11.根據權利要求9所述的應用，其中所述的O2與所述的NO在所述的混合物被哺乳動物吸入之前即刻混合。
12.根據權利要求1或2所述的應用，它進一步包括為了配合NO的吸入，給所述的哺乳動物施用治療有效量的、可增強氣態NO治療作用的第二個化合物的步驟。
13.根據權利要求12所述的應用，其中所述的第二個化合物選自磷酸二酯酶抑制劑和超氧化物歧化酶。
14.根據權利要求13所述的應用，其中所述的磷酸二酯酶抑制劑選自2-鄰-丙氧基苯基-8-氮雜嘌呤-6-酮(ZaprinastTM)、雙嘧達莫(dipyridamole)和茶堿。
15.根據權利要求1或2所述的應用，其中所述的氣態NO在不吸煙的情況下吸入。
全文摘要
本發明揭示了治療、抑制或預防哺乳動物血管血栓形成或動脈再狹窄的方法。所揭示的方法包括給哺乳動物吸入治療有效量的氣態氧化氮(NO)。也揭示了包括配合吸入NO,施用下列類型藥劑的方法:能增強吸入NO有益作用的化合物,能補充吸入NO有益作用的抗血栓劑。附圖是比較對照大鼠,暴露于20ppmNO達2周的大鼠,暴露于80ppm達1周然后在空氣中暴露1周的大鼠的內膜/血管中層比率的圖。星號表示與基線值有顯著差異的值(p< 0.05)。
文檔編號A61P9/08GK1174513SQ96191929
公開日1998年2月25日 申請日期1996年2月8日 優先權日1995年2月16日
發明者W·M·扎波爾, K·D·布洛克 申請人:總醫院有限公司