診斷及治療鱗狀細胞癌的方法

專利名稱：診斷及治療鱗狀細胞癌的方法
技術領域：
本發明是關于診斷及治療鱗狀細胞癌的方法，它基于CD44基因的可變外顯子v6的表達，用于這些方法的制劑，以及其用途。
目前已經表示表面糖蛋白CD44的變體的表達，對于在大鼠的非-轉移性胰腺癌細胞系，以及大鼠的非-轉移性纖維肉瘤細胞系兩者，為足以誘發所謂的自發性轉移行為，是必要的(Gunthert等人，1991)。然而，最小的CD44-同種型、標準型的CD44，在許多包括上皮細胞的不同組織中，普遍都有表達，但是某些CD44的剪接變體(CD44v)僅在上皮細胞的亞群中表達。CD44-同種型是通過另一種剪接方式產生，該方式要將在CD44中的10個外顯子的序列(v1-v10)完全刪除，但在較大的變體中可能發生不同的組合(Screaton等人，1992；Heider等人，1993；Hofmann等人，1991)。變體的差異在于在蛋白質的細胞外部分的特定位置，插入不同的氨基酸序列。這種變體可在不同的人類腫瘤細胞和在人體腫瘤組織中檢測到。因此，目前已經在研究CD44-變體在結直腸致癌作用中的表達(Heider等人，1993)。在正常人類的結腸上皮中沒有CD44-變體的表達，而在腔穴的增殖細胞中，僅可檢測到輕微的表達。在腫瘤進行的后期，例如在腺癌中，所有的惡性變性表達CD44的變體。此外，目前已經在已激活的淋巴細胞中，以及在非-何杰金(Hodgkin)的淋巴瘤中，證實了CD44-剪接變體的表達(Koopman等人，1993)。
已經采用各種途徑，使CD44-基因的變體外顯子在腫瘤和正常組織中的不同表達，以用于診斷和治療的目的上(WO 94/02633、WO 94/12631、WO 95/00658、WO 95/00851、EP 0531300)。
也已經研究了變體CD44-分子在鱗狀細胞癌中的表達。Salmi等人(1993)發現，具有v6-特異性抗體變體(Var)3.1，在腫瘤細胞中比在正常細胞中，有降低的v6-表達。利用v6特異性抗體11.9,Brooks等人(1995)獲得一種異源性染色的鼻咽癌。僅在2/12個病例中達到強染色，同時通過免疫組織學，在大部分的病例中僅能檢測到輕微病灶的v6-表達。
本發明的目的是發展用于診斷和治療鱗狀細胞癌的新穎方法，并提供這類方法的制劑。
通過本發明已經完成這個目標。它涉及用于診斷和治療鱗狀細胞癌的方法，該方法是基于作為分子標記或標靶的CD44基因的變體外顯子v6的表達。特別是，本發明是關于以v6在鱗狀細胞癌中強有力的同型性表達為基礎的方法，令人驚訝地發現，這與現有技術中得知的教導相反。具有相應特異性的抗體分子，特別適用于活體內作為選擇到達鱗狀細胞癌的載體。
優選的方法是其特征在于使用識別氨基酸序列QWFGNRWHEGYRQT的抗體分子，更優選的是氨基酸序列WFGNRWHEGYR。由雜交瘤細胞系分泌的單克隆抗體BIWA-1(克隆系VFF-18)，以及該抗體的衍生物是特佳的，它在1994年7月6日，以登記號DSMACC 2174，儲存在DSM-DeutscheSammlung fhr Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Mascheroder Weg 1b,D-38124 Braunschweig,Germany(WO 95/33771)。
本發明的其他方面是這類抗體分子在根據本發明方法中的用途，以及進行這些方法的制劑。
已知CD44-基因的變體外顯子v6的核酸和氨基酸序列(Screaton等人，1992,Tolg等人1993)。變性或等位變體的存在，對于本發明的實施不太重要；因此這類變體明顯也包含在內。
人類CD44-基因的外顯子v6的序列為Q A T P S S T T E E T ATC CAGGCAACTCCTAGTAGTACAACGGAAGAAACAGCTT Q K E Q W F G N R W H B GACCCAGAAGGAACAGTGGTTTGGCAACAGATGGCATGAGGGAY R Q T P R E D S H S T T QTATCGCCAAACACCCAGAGAAGACTCCCATTCGACAACAGGGT AACAGCTG.
本發明可利用對由外顯子編碼的抗原決定基有特異性的多克隆或單克隆抗體來進行，特別是在氨基酸序列QWFGNRWHEGYRQT內的抗原決定基，最好是在氨基酸序列WFGNRWHEGYR內的抗原決定基。制備對已知氨基酸序列的抗體，可根據原本已知的方法(Catty,1989)來進行。例如可以合成方式來制備該序列的肽，并使用該肽在免疫程序中作為抗原。其他的方法是制備一種含有所要求的氨基酸序列的融合蛋白質，其中通過整合一種核酸，該核酸編碼該序列進入表達載體內，并在宿主生物中表達該融合蛋白質(可以合成方式制備，或例如通過聚合酶連鎖反應(PCR)從適當的探針制備)。然后在免疫程序中，使用必要時純化的融合蛋白質作為抗原，插入-特異性的抗體，或者在單克隆抗體的情況下，表達插入-特異性抗體的雜化瘤，可通過適當方法進行選擇。這類方法在現有技術中已知的。Heider等人(1993,1996a)和Koopman等人(1993)，描述了對CD44變體抗原決定基的抗體的制備。
然而，根據本發明方法，也可以使用其他的抗體分子，它由多-或單克隆抗體產生，例如免疫球蛋白的Fab或F(ab＇)2-片段、由重組方法制備的單鏈抗體(scFv)、嵌合型或人類化的抗體，以及其他對由外顯子v6編碼的抗原決定基呈特異性結合的分子。Fab或F(ab＇)2-片段或其他片段，例如可從抗體BIWA-1(VFF-18)或其他抗體的完整的免疫球蛋白產生(Kreitman等人，1993)。本領域技術人員也可在適當位置產生重組的v6-特異性抗體分子。尤其是，在分析抗體BIWA-1(VFF-18)的氨基酸序列，和/或使用產自該抗體的雜化瘤細胞株后，尤其是其中含有遺傳訊息的，它可以產生具有像BIWA-1(VFF-18)一樣的個體基因型的重組抗體，也就是在抗原結合部位區(互補性-決定區，CDR)具有像BIWA-1(VFF-18)一樣的氨基酸序列的抗體分子。這類方法在現有技術中是已知的。這類的重組抗體分子可以是例如人類化的抗體(Shin等人，1989；Gussow和Seemann,1991)、兩種特異性或兩種功能性的抗體(Weiner等人，1993；Goodwin,1989；Featherstone,1996)、單-鏈的抗體(scFv,Johnson和Bird,1991)、完整的或片段的免疫球蛋白(Coloma等人，1992；Nesbit等人，1992；Barbas等人，1992)，或通過鏈變動(chain shuffling)而產生的抗體(Winter等人，1994)。人類化的抗體可通過例如CDR移殖而制備(EP 0239400)。也可以修改骨架(EP0519596；WO 9007861)。關于人類化的抗體，現在可以使用諸如PCR之類的方法(參見例如EP 0368684；EP 0438310；WO 9207075)，或計算機-模擬(參見例如WO 9222653)。也可以制備并使用融合蛋白質，例如單-鏈抗體/毒素的融合蛋白質(Chaudhary等人，1990；Friedman等人，1993)。術語“抗體”和“抗體分子”，覆蓋的不僅是多克隆和單克隆抗體，還有在本段所討論的所有產自免疫球蛋白并可用原本已知的方法來制備的所有化合物。
利用BIWA-1(VFF-18)的抗原決定基(參見

圖1、圖4)的知識，來制備具有相同結合特異性的相當抗體，也在普通技術人員的能力范圍內。因此這樣的抗體也包括在本發明之內。
為了診斷的目的，可將抗體分子，優選是BIWA-1抗體分子、其片段，或具有相同個體基因型的重組的抗體分子，可以和例如諸如125I、131I、111In、99mTc之類的放射性同位素相連結，或是和放射性化合物(Larson等人，1991；Thomas等人，1989；Srivastava,1988)，諸如過氧化酶或堿性磷酸酶之類的酶(Catty和Raykundalia,1989)、和熒光染料(Johnson,1989)或生物素分子(Guesdon等人，1979)相連結。為了治療之目的，可使v6-特異性抗體分子，優選的是BIWA-1(VFF-18)-抗體分子或VFF-18-衍生的抗體分子，例如其片段或具有相同個體基因型的重組抗體分子和放射性同位素，如90Y、131I、186Re、188Re、153Sm、67Cu、212Bi、213Bi、177Lu(Quadri等人，1993；Lenhard等人，1985；Vriesendrop等人，1991；Wilbur等人，1989；Mara-veyas等人，1995a,Jurcic和Scheinberg,1994)、毒素(Vitetta等人，1991；Vitrtta和Thorpe,1991；Kreitman等人，1993；Theuer等人，1993)、細胞抑止劑(Schrappe等人，1992)、藥物前驅物(Wang等人，1992；Senter等人，1989)、光可激活的物質(Hemming等人，1993)、具有不同特異性的抗體分子或放射性化合物連結。該抗體分子也可連結到細胞分裂素或一些其他的免疫調節多肽，例如與腫瘤壞死因子、淋巴細胞毒素(Reisfeld等人，1996)或介白細胞素-2(Becker等人，1996)。抗體分子也可改性以用于預告瞄準的系統，例如利用抗生蛋白鏈菌素或生物素(Goodwin,1995)。
有利的是，本發明的診斷方法可用于研究得自患者的試樣，例如得自活組織檢查，它是在懷疑有鱗狀細胞癌，或是已經做出診斷但需要進一步表征時。檢測含有由可變外顯子v6編碼的氨基酸序列的變體CD44-分子，可在蛋白質層面利用抗體來進行，或是在核酸層面使用用于聚合酶連鎖反應(PCR)的特異性核酸探針或引物來進行。因此，本發明也關于用于這類方法的、適合作為探針或引物的抗體分子和核酸，以及這些抗體和核酸在診斷和分析鱗狀細胞癌中的用途。例如，通過原本已知的方法，可利用抗體以免疫組織化學的方式來檢測組織切片。也可用其他的免疫學方法，使用抗體來研究得自組織試樣的萃取物或體液，例如在Western印跡法，酵素-連結的免疫吸附分析法(ELISA,Catty和Raykundalia,1989)、放射性免疫測試法(RIA、Catty和Murphy,1989)或相關的免疫測試法。這些研究可以是定性的、半-定量的或定量的。
除了體外的診斷外，根據本發明的具有特異性的抗體分子，亦適用于在活體內診斷鱗狀細胞癌。如果該抗體分子帶有可檢測的標記，則可檢測該標記用于診斷目的，例如使腫瘤在體內呈像，或是供放射性引導的手術使用。例如，使用與放射性同位素相結合的抗體以用于免疫閃爍照相法(呈像)，作為實施本發明的基礎，本領域技術人員可使用許多程序(Siccardi等人,1989；Keenan等人，1987；Perkins和Pimm,1992；Colcher等人，1987；Thompson等人，1984)。
因此，可使用通過檢測和/或定量變體CD44-抗原決定基v6表達所獲得的數據來診斷和預后。將這些數據和其他的預后參數相結合是有利的，例如腫瘤的等級。
根據本發明具有特異性的抗體分子，必要時可與細胞毒性制劑混合，有利于鱗狀細胞癌的治療。可全身性或局部施用，例如經由靜脈內的途徑(如以團塊或連續輸液)，或經由腹腔內、肌肉內、皮下或其他注射/輸液。投予結合或未-結合抗體(它們是以完整的免疫球蛋白、片段、重組人類化的分子或其類似物的形式)的程序是現有技術中已知的(Mulshine等人，1991；Larson等人，1991；Vitetta和Thorpe,1991；Vitetta等人，1991；Breitz等人，1992,1995；Press等人，1989；Weiner等人，1989；Chatal等人，1989；Sears等人，1982)。它們可在治療方面使用，例如，以抗體1.1ASML的同樣方式(Seiter等人，1993)。如果未經修改的單克隆抗體本身具有適于細胞毒性作用的內在效應子功能，例如補體-誘發或抗體-誘發的細胞毒性，則為了治療目的可直接使用未改性的抗體(Riethmuller等人，1994)。適于這種應用的單克隆抗體，為同型物IgG2a的老鼠抗體，或人類IgG1-型的抗體。也可施用未改性的抗體，以便經由抗-個體基因型的機制來誘發患者自己的抗腫瘤反應(Baum等人，1993；Khazaeli等人，1994)。
根據治療應用的優選的具體實施例，將人類化的v6-特異性免疫球蛋白或其F(ab＇)2片段與90Y(Quadri等人，1993；Vriesendrop等人，1995)、131I(Maraveyas等人，1995a,1995b；Juweid等人，1995；Press等人，1995；Thomas等人，在Catty 1985，第230-239頁)、186Re(Breitz等人，1992,1995)或其他適當的放射性同位素連結，并用于鱗狀細胞癌的放射性免疫治療中。例如，可利用螯合衍接物，如ITCB-DTPA(異硫氰酰芐基-二亞乙基三胺五乙酸)，將抗體BIWA-1,BIWA-1的人類化的譯本，或BIWA-1之F(ab＇)2片段，或人類化的抗體，與90Y連結，達到5-20毫居里/毫克的特定放射性，較佳的是10毫居里/毫克。然后以0.1到1毫居里/公斤體重的劑量，將該制劑給藥于抗原-陽性腫瘤的患者，優選的是0.3到0.5毫居里/公斤體重。如果該抗體分子與131I連結，則投藥計劃可能為例如，對2毫居里/毫克的特定活性，以6周的間隔給藥2×150毫居里。本領域技術人員可利用原來已知的方法(Maraveyas等人，1995a,1995b)，定出可能的劑量。當給藥的蛋白質的總量為2到5毫克時，則可通過快速靜脈內的團塊注射的形式給藥。在較大量蛋白質的情況下，注射可能是較適當的投藥方法。使用單克隆抗體，可能需要在給藥前，將該制劑與過量的(例如十倍摩爾過量)無放射活性的抗體混合；在該情況下，最好是以靜脈注射的形式給予該制劑，例如在15分鐘之內。這可重復進行。該治療可與外部的放射性治療相結合。也可通過骨髓移殖來支持；這在治療期間，當到達骨髓的劑量超過1.6Gy時是特別需要的。
根據本發明的抗體分子，也可在體外使用，以純化CD34-陽性的干細胞和前體細胞制品(免疫清除)使用。也可使用自體骨髓移殖來支持鱗狀細胞癌的放射治療和化學治療。因此必需給予不含腫瘤細胞的造血干細胞和前體細胞的制品。這可通過與本發明抗體分子一起培養來完成，例如抗體-毒素共軛物(Myklebust等人，1994；DEP 196482097)。
也可將根據本發明抗體分子，以重組結構的形式導入T-淋巴細胞的T-細胞受體中。這類經過重編程序的T-淋巴細胞可選擇性地與表達抗原的腫瘤細胞相結合，并發展出細胞毒性的活性，導致可使它們用于治療鱗狀細胞癌(PCT/歐洲專利9604631號；Altenschmidt等人，1996)。
附1通過結合到由人類CD44v6序列衍生的合成肽，決定BIWA-1的抗原決定基特異性。用抗體1.1ASML來測試得自大鼠CD44v6的相應肽。以ELlSA決定結合使用，其中肽是固定在微滴盤上(參見Heider等人，1996b,圖2)。-無結合，+/-稍有結合；+強結合。
圖2用CD44v6-特異性單克隆抗體BIWA-1，來進行喉頭的鱗狀細胞癌(a)和食道癌的肝轉移(b)的免疫組織化學分析。在這兩種情況下，觀察抗體與腫瘤細胞膜的反應性。原始放大40x，計數染色蘇木精。
圖3抗原與各種CD44v6-特異性mAb的結合作用的比較。在細胞ELISA中測定四種不同的CD44v6-特異性mAb和人類SCCA-431-細胞的結合作用。MAb BIWA-1對腫瘤細胞呈顯出比其他MAb更高的親和力。
圖4mAb BIWA-1的精細的抗原決定基圖。通過競爭性ELISA，測量BIWA-1對各種重疊合成的肽的結合作用，它跨越CD44v6-編碼區的氨基酸18-32。其最低結合的序列(肽v6(19-29))下有畫線。
圖5在A-431異種移殖的裸鼠中125I-BIWA-1的生物分布。在注射4、24、48、120和168小時后，得到的按％ID/克(平均值±標準差)表示的抗體累積。
實施例實施例1CD44v6在鱗狀細胞癌中的表達組織用mAb BIWA-1(克隆VFF-18)，以免疫組織化學法分析總共126個以石蠟包埋的腫瘤試樣的CD44v6的表達。試樣包括31個原發性磷狀細胞癌(15例喉頭，16例皮膚)，91例淋巴結轉移瘤(喉頭，n=38；肺，n=27；食道，n=11；口腔，n=11；扁桃體，n=4)，以及4例肝轉移瘤(食道)。抗體通過聚合酶鏈反應(PCR)從人類角化細胞-cDNA，放大CD44v6的HPKII型的全部的變體區域(Hofmann等人，1991)。使用兩個PCR引物5＇-CAGGCTGGGAGCCAAATGAAGAAAATG-3＇和5＇-TGATAAGGAACGATTGACATTAGAGTTGGA-3＇如同Hofmann所述，前者位于LCLC97-變體區域的25-52處，后者位于1013-984處，它含有EcoRⅠ識別位點，它用于將PCR產物直接克隆到載體pGEX-2T內(Smith等人，1988)。所得的構體(pGEX CD44v6 HPKⅡ,v3-v10)編碼大約70kD的融合蛋白質，包括得自日本吸血蟲(Schistosomajaponicum)的谷胱甘肽-S-轉移酶，和人類CD44的外顯子v3-v10(圖1；Heider等人，1993)。在大腸桿菌(E.coli)中表達該融合蛋白質，然后在谷胱甘肽-瓊脂糖上使其進行親和純化作用(Smith等人，1988)。
用經過親和純化的融合蛋白質，根據下列的計劃，以腹腔內的方式免疫接種雌性的Balb/c老鼠第1次免疫接種 90微克融合蛋白質在弗氏(Freund＇s)完全助劑中第2次和第3次免疫接種 50微克融合蛋白質在弗氏不完全助劑中間隔4周給予免疫接種。在最后一次免疫接種后第14天，連續3天以在PBS中的10微克融合蛋白質免疫接種動物。在第二天使用聚乙二醇4000，將得自動物具有高抗體效價的脾細胞與P3.X63-Ag8.653老鼠骨髓瘤細胞融合。然后在微滴盤中，在HAT-培養基中選擇雜交瘤細胞(Kohler和Milstein,1975；Keamey等人，1979)。
測定在血清中的抗體效價，或篩選雜交瘤上清液，都使用ELISA進行。在該試驗中，所有微滴盤的第一個都用融合蛋白質(GST-CD44v3-10)覆蓋，或僅用谷胱甘肽-S-轉移酶覆蓋。然后將其與系列稀釋的血清試樣或雜交瘤上清液一起培養，并利用連結抗老鼠免疫球蛋白的抗體的過氧化酶來檢測特異性抗體。任何僅與谷胱甘肽-S-轉移酶反應的雜交瘤都棄去。剩下的抗體，首先在ELISA中，用結構域-特異性融合蛋白質(外顯子v3，外顯子v5+v6，外顯子v6+v7，外顯子v8-v10)進行表征(Koopman等人，1993)。在人類的皮膚切片上測試其免疫組織化學的反應性。
BIWA-1(VFF-18；其制備和特性亦可參見WO 95/33771)僅與含有由外顯子v6編碼的結構域的融合蛋白質結合。為了更進一步限制該抗體的抗原決定基，在ELISA結合試驗中使用代表部分v6結構域的各種合成肽(圖1)。14個氨基酸肽v6D，顯示出最強的結合作用。所以，BIWA-1的抗原決定基，是完全或部分在由外顯子v6編碼的結構域的序列QWFGNRWHEGYRQT之中。該序列與抗體1.1ASML的結合抗原決定基是同源的，它可用于治療的大鼠模式，且其對大鼠CD44v6是特異性的(圖1)。免疫組織化學在與原抗體一起培養前，將在洛提西斯醇(Rotihistol)(Roth，德國)中的石蠟切片(4μm)脫蠟三次，每次10分鐘，然后在逐漸提高的酒精系列中再水化。以蒸餾水簡單地中洗切片，然后在0.01M鈉檸檬酸鹽緩沖液中，在微波爐(SharpR-6270型)中以600瓦烘烤三次，每次各10分鐘。在每次微波培養后，將切片冷卻20分鐘。在最后一次冷卻階段后，以PBS沖洗載體，并與正常的山羊血清(10％在PBS)一起預培養。在PBS中沖洗3次后，將該切片與原抗體(BIWA-1:5微克/毫升；老鼠的IgG(同型物-相當于陰性對照組)5微克/毫升，在PBS/1％BSA中)一起培養1小時。用于染色反應的陽性對照組是用正常人類皮膚切片，因為角化細胞表達CD44-同種型，它含有v3-v10。利用在PBS中的0.3％H2O2來阻斷內源的過氧化酶，并將切片與生物素基化的二級抗體(抗-老鼠IgG-F(ab＇)2,DAKO公司.)一起培養30分鐘。為了展開染色，將該切片與辣根過氧化物酶一起培養30分鐘，該酶偶聯到生物素而以抗生蛋白鏈菌素-生物素-過氧化酶復合物形式存在(DAKO Corp.)。然后在3,3-氨基-9-乙基-咔唑底物(SigmaImmunochemicals)中培養該切片5-10分鐘，利用H2O使反應中止，并以蘇木精反染色。用Zeiss Axioskop光學微鏡來評價染色，并如下定量顏色的強度+++，強表達；++，中等的表達；+，弱表達；-，不清楚或未檢測到表達。只有具有清楚膜染色的腫瘤細胞被評為陽性。粗略地測定在每個切片中陽性腫瘤細胞的百分比，并形成兩組局部陽性的腫瘤(低于10％的與抗體反應的腫瘤細胞)，和陽性的腫瘤(10％或10％以上的陽性腫瘤細胞)。如果在與該抗體反應的陽性細胞中，腫瘤細胞少于80％，則指示相對應的百分比。
利用CD44v6-特異性單克隆抗體BIWA-1來分析126例的各種來源的鱗狀細胞癌。在除了一個試樣外的全部試樣中，觀察到含有CD44v6的同種型的表達。大部分試樣顯示抗原在80-100％的腫瘤細胞中表達，且染色被限制在腫瘤細胞的膜上。在基質組織、淋巴細胞、肌肉細胞或內皮細胞上未觀察到反應。
為了定量CD44v6-分子在這些腫瘤細胞上的表達，將正常人類皮膚的切片，與腫瘤切片并行地染色。正常皮膚角化細胞表達高量的CD44-同種型，并且是在到目前為止已經描述的正常細胞CD44v6的最強表達子中。因此，使用角化細胞的染色作為參考值，并在我們的評估系統中分類為“強”(+++)。在大部分受檢查的腫瘤試樣中，腫瘤細胞的染色可與皮膚角化細胞的染色相比較，或甚至超過，而僅有一些病例顯示出弱的腫瘤染色(3例淋巴結轉移瘤)，或中等的腫瘤染色(2例原發性癌，10例轉移瘤)。染色反應在特定的腫瘤切片中是非常均一的，且在切片中大部分的腫瘤細胞具有相同的染色強度。在原發性腫瘤和轉移瘤之間，在CD44v6-表現模式中未觀察到明顯的差異。在表1中列出結果的詳細概要，而實例示于圖2中。表1CD44v6在鱗狀細胞癌中的表達
80-100％的腫瘤細胞與BIWA-1呈陽性的反應。在較少腫瘤細胞與該抗體反應的情況下，給出所得的百分比。實施例2CD44v6在腎細胞癌、前列腺癌和結腸癌的肝轉移瘤中的表達組織分析19例腎細胞癌(12例透明細胞、5例易染細胞、1例難染細胞、1例大嗜酸粒細胞瘤)，16例前列腺原發性腺癌和19例前列腺癌的淋巴結轉移瘤，以及30例結腸癌的肝轉移瘤。抗體BIWA-1(參見實施例1)免疫組織化學其方法參見實施例1。
與鱗狀細胞癌對比，在大部分受試的腎細胞和前列腺癌中，未檢測到CD44v6-同種型的表達，或僅有局部的表達。在前列腺癌中在高于局部表達的病例中，與正常前列腺上皮的染色相比較，染色主要是散射胞質性的并且是弱的和異質性的。在50％受試的結腸癌的肝轉移瘤中，檢測到高于局部表達的CD44v6同種型。在大部分的情況下，染色是模糊到中等的，但在試樣中通常少于100％的腫瘤細胞呈顯有BIWA-1的任何染色。其結果概述于表2中。表2在前列腺腺癌、腎細胞癌和結直腸癌的肝轉移瘤中CD44v6的表達
實施例3CD44v6-特異性抗體的特征細胞株從美國典型培養物收集中心(American Type Culture Collec-tion)(Rockwell MD)獲得人類SCC細胞株A-431(女陰的自發性表皮樣癌)，并根據制造商的指南進行培養。通過FACS分析，使用FITC-連結的mAbBIWA-1，來測定含有同種型的CD44v6的表面表達。動力學常數的分析通過表面胞質基因組共振(Surface Plasmon Resonance)(SPR)，使用BIAcore 2000系統(Pharmacia Biocensor)，測定出單克隆抗體CD44v6-相互作用的親和性和動力學。將含有由外顯子v3-v10編碼的區域的谷胱甘肽-S-轉移酶-CD44-融合蛋白質(GST/CD44v3-v10)固定在CM5傳感器片(Sensor Chip)上，根據制造商的指南進行氨基偶聯法。以5微升/分鐘的流速，將在HBS(10mM HEPES pH 7.4,150mM氯化鈉，3.4mM EDTA,0.05％BIA核心表面活性劑P20)中之各種濃度的抗體(8-132nM)注射到抗原-特異性的表面上。以SPR信號的變化來記錄相互作用。在緩沖溶液流動(HBS)中觀察抗體的分離5分鐘。利用15微升30mM HCl的單脈沖，再生該薄片的表面。利用Pharmacia Biocensors BIA評估軟件，第2.1版，進行數據分析和動力學常數的計算。
以這種方式比較BIWA-1和其他CD44v6-特異性mAb(VFF4、VFF7、BBA-13(IgGl,R & D Systems,Abingdon,UK))的抗原親和性。在兩個分開的實驗中，測定各種抗體的動力學和親和性常數。表3列出4種mAb的締合速率(Ka)、離解速率(Kd)和離解常數(Kd)的值。所有的mAb都表示有類似的Ka和Kd，除了BBA-13以外，它具有低3-倍的Ka，還有VFF7，與其他mAb相比較，它具有明顯較高的離解速率(因子5)。VFF7和BBA-13，與VFF4和BIWA-1相比較，其結果有較低的結合親和性。BIWA-1表明在全部所研究抗體中Kd最低。表3各種CD44v6-特異性mAb的動力學和親和性常數
使用ELISA分析抗體-蛋白質的相互作用。
在37℃下，以每孔5×104的量，在96-孔培養盤(Falcon MicrotestⅢ,Bectob Dickinson,Lincoln Park,NJ)中，以帶有10％胎牛血清的PRMI 1640來培養表達CD44v6的A-431細胞。用PBS/0.05％吐溫20沖洗后，以冰冷的乙醇固定細胞1分鐘，接著是沖洗的步驟。在室溫下與初級抗體(VFF4、VFF7、BIWA-1、BBA-13,1毫微克/毫升到600毫微克/毫升，每例都在試驗緩沖溶液中PBS/0.5％BSA/0.05％吐溫20)一起培養1小時，接著沖洗3次。所使用的二級抗體為兔-抗鼠-IgG-辣根過氧化物酶連接的抗體(DAKO Corporation,Copenhagen,Denmerk；以試驗緩沖溶液稀釋1∶6000)(在室溫下1小時)。在3次沖洗步驟后，使用TMB溶液(Kirkegaard andPerry,Gaithersburg,USA)展開顏色。使用Hewlett-Packard ELISA閱讀器來測定其消光。
圖3表示由BIA核心分析所測定的，反映其與腫瘤細胞相互作用的抗體的相關親和性，BIWA-1清楚地表示最高的結合親和性。
由CD44-外顯子v6編碼的蛋白質結構域，包括45個氨基酸(圖4)。為了更正確地定義由BIWA-1識別的抗原決定基，在ELISA分析中使用一系列合成肽。預備實驗表示結合到位于中央的14-部分(氨基酸群18-31；圖4，也可參見圖1)，但是沒有結合到該區外的肽上。因此合成第二系列肽，并以競爭性ELISA測試(圖4)。結果表明肽19-29(WFGNRWHEGYR)代表高親和性結合所需的最小結構。刪除C-終端的精氨酸基團導致結合作用減弱100倍以上。實施例4在有異源移殖的裸鼠中放射性碘化的CD44v6-抗體的生物分布A-431-異源移殖模式將5×106個經過培養的A-431細胞(人類女陰的表皮樣癌)，在左側中線處皮下注射到8周齡的雌性BALB/cnu/nu裸鼠(B & K Universal,Renton,WA)。在兩周內使用帶有A-431腫瘤的異源移殖的動物，進行生物分布的實驗(腫瘤重量40-50毫克)。放射性碘化的BIWA-1使用異雙功能的交聯劑琥珀酰亞胺基4-(N-順丁烯二酰亞胺-甲基)環己烷-1-羧酸鹽將蛋白質G-純化的mAb BIWA-1(鼠的IgG1)偶聯到抗生蛋白鏈菌素。將抗生蛋白鏈菌素-賴氨酰基與通過用二硫蘇糖醇預先處理抗體而產生的還原抗體半胱氨酰基連結。得到1∶1的共軛物(＞90％)，并通過離子交換層析法進一步純化。關于生物分布的實驗，通過帶有125I的賴氨酸的伯胺，用對-碘苯基標記試劑(PIP；NEN Dupont,Wilmington,DE)來標記BIWA-1/SA，接著進行Willbur等人(1989)的方法。以SA或125I標記BIWA-1并不會影響該抗體在鼠中的免疫反應性或藥物動力學。生物分布的實驗經由側面的尾部靜脈，對用人類A-431腫瘤異種移殖的裸鼠靜脈內注射有5-7微居里125I的50微克mAb BIWA-1(比放射性0.1-0.14毫居里/毫克)。在n=3的動物組中，在注射后4、24、48、120和168小時處進行時間-生物分布的研究。在所選定的時間，稱重老鼠，從眼后眶采血，并通過頸椎脫臼法將其殺死。收集九個器官和組織并將其稱重血液、尾巴、肺、肝、脾、胃、腎、小腸和腫瘤。通過與注射抗體制品的標準比較，在γ-閃爍計數器(Packard Instrument Company,Meriden,CT)上對該組織的放射性計數，將1251的能量窗設定在25-80keV。計算出每克組織的注射劑量的百分比(％ID/克)。
預實驗已表明BIWA-1不會與鼠CD44v6-抗原有交叉-反應。表4和圖5表示放射性在腫瘤和正常組織中的吸收作用。碘化的BIWA-1表示迅速的腫瘤吸收(在注射后4小時為7.6％注射劑量/克)，它在48小時后增加到18％ ID/克以上，然后在高達120小時時保持不變。在注射后7天(168小時)，腫瘤仍然含有15.3％ ID/每克組織。就各個時間段計算出腫瘤組織之比，并將其示于表4中。在注射后24小時，腫瘤血液之比為0.48，并在第7天增加到3.16。在正常組織中攝入很少，且最有可能在組織活檢時由血庫背景所引起。在裸鼠中利用125I-標記的BIWA-1選擇人類SCC-異種移殖的活體靶，表明在用于SCC患者的診斷和治療上，作為靶載體該單克隆抗體具有很高的潛力。表4:125I-BIWA-1在帶有A-431-腫瘤的裸鼠身上，在注射后各種時間的腫瘤組織之比
a平均值(n=3)；SD＜7％實施例5CD44v6在大量人類腫瘤中的不同表達在較廣泛的研究中，利用單克隆抗體BIWA-1(克隆VFF-18)，以免疫組織化學的方式檢測總共544個腫瘤試樣的CD44v6的表達。在用手術移出后，將試樣立即包埋在石蠟中或冷凍在液態氮中，并儲存在-70℃直到需要為止。分析下列的腫瘤基細胞癌(n=16)，乳房的腺癌(AC)(n=55)，結腸的AC(n=83)，頭和頸的鱗狀細胞癌(SCC)(n=125)，肺癌(n=120)，前列腺AC(n=34)，腎細胞癌(n=27)，皮膚的SCC(n=15)和胃的AC(n=69)。通過例行的手術或生檢獲得組織，并伴隨著腫瘤試樣一起獲得正常組織。按照實例1來進行免疫組織化學研究。
表5表示用mAb BIWA-1對397個不同類型的腫瘤進行免疫組織化學分析的概要。表5CD44v6在人類腫瘤中的表達
在小細胞肺癌、腎細胞癌和前列腺AC中，未觀察到反應性或僅有很少的反應性。所有受檢的其他類型腫瘤，以各種程度表達含有CD44v6的同種型。在大部分受檢的乳房AC中，表示與BIWA1的反應性，而受檢的SSC(喉頭、肺和食道)，以全部病例的100％來表達CD44v6。
對185例各種類型和類別的各種SCC病例，研究它與BIWA1的反應性。這些包括67例原發性SCC(喉頭，n=15；口腔，n=16；口咽，n=3；皮膚，n=15)，77例淋巴結轉移瘤(喉頭，n=12；肺，n=27；食道，n=11；口腔，n=6；口咽，n=7；下咽部，n=10；扁桃體，n=4)，以及3例肝轉移瘤(食道)。表6綜述了所有受檢的SSC試樣的免疫組織化學分析。
表6CD44v6在鱗狀細胞癌中的表達
發現含有CD44v6的同種型除了3個腫瘤試樣外在全部試樣中表達(1例喉頭，2例肺)。大部分的試樣表示，抗原在單一切片的80到100％的腫瘤細胞中表達，且染色主要濃縮在腫瘤細胞的膜上。在喉頭、食道和咽下部的癌中，發現最均勻的染色模式，而在切片中大部分的腫瘤細胞具有相同強度的染色。
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序列一覽表(1)一般數據(ⅰ)申請人(A)姓名Boehrinqer Ingelheim intemational GmbH(B)街Rheirtstrasse(C)市鎮Ingelheim(E)國家Germany(F)郵政編碼55216(G)電話+49-(0)-6132-772770(H)傳真+49(0)-6132-774377(A)姓名Forschungszentrum Karlsruhe GmbH(B)街Postfach 3640(C)市鎮Karlsruhe(K)國家Germany(F)郵政編碼76021(A)姓名Heider,Karl-Heinz(B)街Hervicusgasse4/3/21(C)市鎮Vienna(B)國家Austria(E)郵政編碼1120(A)姓名Adolf,Guenther(B)街Stiftgasse 15-17/10(C)市鎮Vienna(E)國家Austria(F)郵政編碼1070(A)姓名Ostermann Elinborg(B)街Mauerbachstr.56/6(C)市鎮Vienna(E)國家Austria(F)郵政編碼1140(A)姓名Patzelt,Eirk
(B)街Hans-Buchmueller-Gasse8(C)市鎮Purkersdorf(E)國家Austria(F)郵政編碼3002(A)姓名Sprall,Narlies(B)街Schwenkgasse3(C)市鎮Vienna(E)國家Austria(F)郵政編碼1120(ⅱ)發明名稱診斷及治療鱗狀細胞癌的方法(ⅲ)序列數16(ⅳ)計算機可讀版本(A)數據載體軟盤(B)電腦IBM PC兼容(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件專利放棄(Patentln Release)#1.0第1.30版(EPO)(2)關于序列1的資料(ⅰ)序列特征(A)長度129個堿基對(B)性質核苷酸(C)股型雙股(D)拓樸學兩種(ⅱ)分子性質基因組DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵外顯子(B)位置1..129(C)其他資料/產物=“CD44”/標記-v6/注記-“基因庫登記號L05411”/文獻出處([1])(ⅸ)特征
(A)名稱/關鍵CDS(B)位置3..128(ⅹ)出版信息(A)作者Screaton,GRBell,MVJackson,DGComelis,FBGerth,UBell,JI,,(B)標題編碼淋巴細胞反巢受體CD44的DNA的基因結構顯示至少12個交替剪接外顯子(C)期刊Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.
(D)卷89(F)頁數12160-12164(D)日期1992年12月(K)序列1的主要基自1至129(ⅹ)出版信息(H)文件編號德國專利19545472.3.,(I)申請日1995年12月16日(ⅹ)出版信息(H)文件編號德國專利19615074.4(I)申請日1996年4月17日(ⅹⅰ)序列描述序列lTCCAGGCAACTCCTAGTAGTACAACGGAAGAAACAGCTACCCAGAAG47Gln Ala Thr Pro Ser Ser Thr Thr Glu Glu Thr Ala Thr Gln Lys1 5 1015GAA CAG TGG TTT GGC AAC AGA TGG CAT GAG GGA TAT CGC CAAACA CCG 95Glu Gln Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Try Arg Gln Thr Pro20 25 30AGA GAA GAC TCC CAT TCG ACA ACA GGG ACA GCT G 129Arg Glu Asp Ser His Ser Thr Thr Gly Thr Ala35 40(2)關于序列2的數據(ⅰ)序列特征(A)長度42個氨基酸(B)性質氨基酸(D)拓樸學直線(ⅱ)分子性質蛋白質(ⅹⅰ)序列描述序列2Gln Ala Thr Pro Ser Ser Thr Thr Glu Glu Thr Ala Thr Gln Lys Glu1 5 1015Gln Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gln Thr Pro Arg2025 30Glu Asp Ser His Ser Thr Thr Gly Thr Ala35 40(2)關于序列3的數據(ⅰ)序列特征(A)長度14個氨基酸(B)性質氨基酸(C)股型單股(D)拓樸學直線(ⅱ)分子性質肽(ⅹ)出版信息(H)文件編號德國專利19545472.3(I)申請日1995年12月6日(ⅹ)出版信息(H)文件編號德國專利19615074.4(I)申請日1996年4月17日(ⅹⅰ)序列描述序列3Gln Trp Phe Gly Asn Arg Trp HIS Glu Gly Tyr Arg Gln Thr1 5 10(2)關于序列4的數據(ⅰ)序列特征(A)長度27個堿基對(B)性質核苷酸(C)股型單股(D)拓樸學直線(ⅱ)分子性質其他核酸(A)說明/desc=“PCR引物”(ⅹ)出版信息(H)文件編號德國專利19545472.3(I)申請日1995年12月6日(ⅹ)出版信息(H)文件編號德國專利19615074.4(I)申請日1996年4月17日(ⅹⅰ)序列描述序列4CAGGCTGGGAGCCAAATGAAGAAAATG(2)關于序列5的數據(ⅰ)序列特征(A)長度30個堿基對(B)性質核苷酸(C)股型單股(D)拓樸學直線(ⅱ)分子性質其他核酸(A)說明/desc=“PCR引物”(ⅹ)出版信息(H)文件編號德國專利19545472.3(I)申請日1995年12月6日(ⅹ)出版信息(H)文件編號德國專利19615074.4
(I)申請日1996年4月17日(ⅹⅰ)序列描述序列5TGATAAGGAACGATTGACATTAGAGTTGGA(2)關于序列6的數據(ⅰ)序列特征(A)長度11個氨基酸(B)性質氨基酸(C)股型單股(D)拓樸學直線(ⅱ)分子性質核苷酸(ⅹ)出版信息(H)文件編號德國專利19545472.3(I)申請日1995年12月6日(ⅹ)出版信息(H)文件編號德國專利19615074.4(I)申請日1996年4月17日(ⅹⅰ)序列描述序列6Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg1 5 10(2)關于序列7的數據(ⅰ)序列特征(A)長度43個氨基酸(B)性質氨基酸(C)股型單股(D)拓樸學直線(ⅱ)分子性質肽(ⅹ)出版信息(H)文件編號德國專利19545472.3(I)申請日1995年12月6日(ⅹ)出版信息(H)文件編號德國專利19615074.4
(I)申請日1996年4月17日(ⅹⅰ)序列描述序列7Gln Ala Thr Pra Ser Ser Thr Thr Glu Glu Thr Ala Thr Gln Lys Glu1 5 10 15Gln Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gln Thr Pro Arg20 25 30Glu Asp Ser His Ser Thr Thr Gly Thr Ala Ala35 40(2)關于序列8的數據(ⅰ)序列特征(A)長度11個氨基酸(B)性質氨基酸(C)股型單股(D)拓樸學直線(ⅱ)分子性質肽(ⅹ)出版信息(H)文件編號德國專利19545472.3(I)申請日1995年12月6日(ⅹ)出版信息(H)文件編號德國專利19615074.4(I)申請日1996年4月17日(ⅹⅰ)序列描述序列8Ser Ser Thr Thr Glu Glu Thr Ala Thr Gln Lys1 5 10(2)關于序列9的數據(ⅰ)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)性質氨基酸(C)股型單股(D)拓樸學直線(ⅱ)分子性質肽(ⅹ)出版信息(H)文件編號德國專利19545472.3(I)申請日1995年12月6日(ⅹ)出版信息(H)文件編號德國專利19615074.4(I)申請日1996年4月17日(ⅹⅰ)序列描述序列9Glu Glu Thr Ala Thr Gln Lys Glu Gln Trp1 5 10(2)關于序列10的數據(ⅰ)序列特征(A)長度11個氨基酸(B)性質氨基酸(C)股型單股(D)拓樸學直線(ⅱ)分子性質肽(ⅹ)出版信息(H)文件編號德國專利19545472.3(I)申請日1995年12月6日(ⅹ)出版信息(H)文件編號德國專利19615074.4(I)申請日1996年4月17日(ⅹⅰ)序列描述序列10Thr Ala Thr Gln Lys Glu Gln Trp Phe Gly Asn1 5 10(2)關于序列11的數據(ⅰ)序列特征(A)長度14個氨基酸(B)性質氨基酸(C)股型單股(D)拓樸學直線(ⅱ)分子性質肽(ⅹ)出版信息(H)文件編號德國專利19545472.3(I)申請日1995年12月6日(ⅹ)出版信息(H)文件編號德國專利19615074.4(I)申請日1996年4月17日(ⅹⅰ)序列描述序列11Gln Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gln Thr1 5 10(2)關于序列12的數據(ⅰ)序列特征(A)長度11個氨基酸(B)性質氨基酸(C)股型單股(D)拓樸學直線(ⅱ)分子性質肽(ⅹ)出版信息(H)文件編號德國專利19545472.3(I)申請日1995年12月6日(ⅹ)出版信息(H)文件編號德國專利19615074.4(I)申請日1996年4月17日(ⅹⅰ)序列描述序列12Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gln Thr Pra1 5 10(2)關于序列13的數據(ⅰ)序列特征(A)長度11個氨基酸(B)性質氨基酸(C)股型單股
(D)拓樸學直線(ⅱ)分子性質肽(ⅹ)出版信息(H)文件編號德國專利19545472.3(I)申請日1995年12月6日(ⅹ)出版信息(H)文件編號德國專利19615074.4(I)申請日1996年4月l7日(ⅹⅰ)序列描述序列13Glu Gly Tyr Arg Gln Thr Pro Arg Glu Asp Ser1 5 10(2)關于序列14的數據(ⅰ)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)性質氨基酸(C)股型單股(D)拓樸學直線(ⅱ)分子性質肽(ⅹ)出版信息(H)文件編號德國專利19545472.3(I)申請日1995年12月6日(ⅹ)出版信息(H)文件編號德國專利19615074.4(I)申請日1996年4月17日(ⅹⅰ)序列描述序列14Thr Pro Arg Glu Asp Ser His Ser Thr Gly1 5 10(2)關于序列15的數據(ⅰ)序列特征(A)長度42個氨基酸(B)性質氨基酸
(C)股型單股(D)拓樸學直線(ⅱ)分子性質肽(ⅹ)出版信息(H)文件編號德國專利19545472.3(I)申請日1995年12月6日(ⅹ)出版信息(H)文件編號德國專利19615074.4(I)申請日1996年4月17日(ⅹⅰ)序列描述序列15Frp Ala Asp Pro Asn Ser Thr Thr Glu Glu Ala Ala Thr Gln Lys Glu1 5 1015Lys Trp Phe Glu Asn Glu Trp Gln Gly Lys Asn Pro Pro Thr Pro Ser20 25 30Glu Asp Ser His Val Thr Glu Gly Thr Thr35 40(2)關于序列16的數據(ⅰ)序列特征(A)長度14個氨基酸(B)性質氨基酸(C)股型單股(D)拓樸學直線(ⅱ)分子性質肽(ⅹ)出版信息(H)文件編號德國專利19545472.3(I)申請日1995年12月6日(ⅹ)出版信息(H)文件編號德國專利19615074.4(I)申請日1996年4月17日(ⅹⅰ)序列描述序列16Lys Trp Phe Glu Asn Glu Trp Gln Gly Lys Asn Pro Pro Thr1 5 10
權利要求
1．一種診斷或治療鱗狀細胞癌的方法，其特征是，該方法是基于作為分子標記的基因CD44的可變外顯子v6的表達。
2．根據權利要求1的方法，其特征是，該方法是基于抗體分子與由基因CD44的可變外顯子v6編碼的抗原決定基的結合作用。
3．根據權利要求2的方法，其特征是，使用識別氨基酸序列WFGNRWHEGYR的抗體分子。
4．根據權利要求3的方法，其特征是，使用單克隆抗體BIWA-1(VFF-18)，或該抗體的衍生物，抗體是由具有登記號DSM ACC2174的雜交瘤細胞系形成。
5．根據權利要求1至4中之一的方法，其特征是，抗體分子為單克隆抗體，免疫球蛋白的Fab-或F(ab＇)2-片段，通過重組方法制備的抗體，通過重組方法制備的嵌段型或人源化的抗體，雙功能或單鏈的抗體(scFv)。
6．一種抗體分子在根據權利要求1至4中之一的方法中的用途，該抗體分子對于由CD44-基因的變體外顯子v6編碼的抗原決定基有特異性。
7．根據權利要求6的用途，其特征是，該抗體分子與氨基酸序列WFGNRWHEGYR結合。
8．根據權利要求6或7的用途，其特征是，該抗體分子是單克隆抗體BIWA-1(VFF-18)或該抗體的衍生物，它是由具有登記號DSM ACC2174的雜交瘤細胞系形成。
9．根據權利要求6至8中之一的用途，其特征是，該抗體分子是單克隆抗體、免疫球蛋白的Fab-或F(ab＇)2片段，通過重組方法制備的抗體，通過重組方法制備的嵌合型或人源化的抗體，雙功能或單鏈的抗體(scFv)。
10．一種抗體分子在治療鱗狀細胞癌上的用途，該抗體分子對于在由CD44-基因的可變表現序列v6編碼的氨基酸序列內的抗原決定基有特異性。
11．根據權利要求10的用途，其特征是，該抗體分子與氨基酸序列WFGNRWHEGYR結合。
12．根據權利要求10或11的用途，其特征是，該抗體分子是單克隆抗體BIWA-1(VFF-18)或該抗體的衍生物，它是由登記號DSM ACC2174的雜交瘤細胞系形成。
13．根據權利要求10至12中之一的用途，其特征是，該抗體分子是單克隆抗體、免疫球蛋白的Fab-或F(ab＇)2-片段，通過重組方法制備的抗體，通過重組方法制備的嵌合型或人源化的抗體，雙功能或單鏈的抗體(scFv)。
14．根據權利要求10至13中之一的用途，其特征是，將該抗體分子與放射性同位素、光可激活的化合物、放射性化合物、酶、熒光染料、生物素分子、毒素、細胞靜止素、藥物前驅物、具有不同特異性的抗體分子、細胞因子或其他的免疫調節多肽相連結。
15．一種用以實施權利要求1至5中之一的方法的制劑，其特征是，它是對由CD44-基因的外顯子v6編碼的抗原決定基有特異性的抗體或抗體分子。
16．一種抗體分子在制備用于診斷和/或治療鱗狀細胞癌的藥物組合物中的用途，該抗體分子對于在由CD44基因的可變外顯子v6編碼的氨基酸序列內的抗原決定基有特異性。
全文摘要
本發明是關于診斷和治療鱗狀細胞癌的方法,它基于作為分子目標的CD44基因的變體外顯子v6的表達。在優選的實施方案中,為此目的而使用v6－特異性抗體分子,特別是單克隆抗體BIWA－1(VFF－18)。
文檔編號A61K51/00GK1207811SQ96199248
公開日1999年2月10日 申請日期1996年12月5日 優先權日1995年12月6日
發明者卡爾-海因茨·海德, 岡瑟·阿道夫, 埃林伯格·奧斯特曼, 埃里克·帕特澤爾特, 馬利斯·斯普羅爾 申請人:貝林格爾·英格海姆國際有限公司, 卡爾斯魯厄研究中心