增強過繼細胞療法

增強過繼細胞療法
【專利說明】増強過繼細胞療法 發明領域
[0001] 本發明涉及生命科學和醫藥領域。具體地，本發明涉及人類的癌癥治療。更具體 地，本發明涉及單獨使用的或與用于癌癥的治療用途和治療方法的治療組合物一起使用的 溶瘤腺病毒載體。在一個方面，本發明涉及過繼細胞治療組合物和溶瘤腺病毒載體的分開 給藥。此外，本發明涉及都利用溶瘤腺病毒載體的藥物試劑盒和藥物組合物。
[0002] 發明背景
[0003] 對于癌癥治療，新的治療方法是不斷發展的。過繼細胞療法（ACT)是用于治療癌 癥的有效方法，但也可用于治療其他疾病，諸如感染和移植物抗宿主疾病。過繼細胞轉移是 以轉移移植物的免疫功能和特征為目標，將體外（ex vivo)生長的細胞（最常見的是免疫 源細胞）被動轉移到宿主中。過繼細胞轉移可以是自體的，如過繼T細胞療法中常見的，或 者是同種異體的，如通常用于治療感染或移植物抗宿主病的。臨床上，這種方法的常見實施 方案包括將免疫促進或致耐受性細胞如淋巴細胞轉移至患者，以增強對病毒和癌癥的免疫 力，或者促進在自身免疫性疾病如I型糖尿病或類風濕性關節炎的設定中的容忍力。
[0004] 對于癌癥治療，ACT方法是在20世紀80年代由在美國工作的少數小組所構想的， 領導小組之一是在NCI (美國國立癌癥研究所）工作的Steven Rosenberg和同事。自體 腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL)或遺傳學上重新定向的外周血單核細胞的過繼轉移已經用于成 功地治療患有晚期實體瘤如黑色素瘤的患者以及患有表達CD19的惡性血液病的患者。在 ACT中，最常用的細胞類型是T細胞，有時分類為⑶8+，但其他變型包括⑶4+細胞、NK-細 胞、δ - γ T細胞、調節性T細胞和外周血單核細胞。細胞可以是未修飾的，如在TIL療法中 的，或是基因修飾的（modified)。有兩種常用的方法來實現將T細胞對腫瘤特異性靶標的 基因靶向。一種是具有已知特異性（TCR療法）和具有匹配的人類白細胞抗原（HLA，被認為 是嚙齒類動物中的主要組織相容性復合體）類型的T細胞受體的轉移。另一種是用人造分 子（諸如嵌合抗原受體（CAR))的細胞修飾。這種方法不依賴于HLA且相對于靶向分子更 靈活。例如，可以使用單鏈抗體，且CAR還可以結合共刺激域。然而，CAR細胞的靶標需要 在靶細胞的膜上，而TCR修飾可以利用細胞內靶標。
[0005] 對于ACT發展的第一個十年，重點關注的是TIL。TIL被發現于腫瘤中，表明腫瘤 觸發了宿主中的免疫應答。這種所謂的腫瘤免疫原性由腫瘤抗原介導。這些抗原將腫瘤與 健康細胞區分開，從而提供免疫學刺激。
[0006] 例如，US2003194804 A1描述了一種通過利用TIL來增強T細胞對腫瘤細胞的反 應性的方法。在US2003194804 A1中，將T細胞暴露于試劑，并重新引入到患者體內。該試 劑能夠降低或防止在T細胞中內源性Notch或Notch配體的表達或相互作用。
[0007] US5126132 A描述了一種治療癌癥的方法，其中，使用有效量的自體TIL和細胞因 子。
[0008] Diaz RM 等人（Cancer Res. 2007 Mar 15 ;67 (6) : 2840-8 (癌癥研究 2007 年 3 月 15日；67 (6) :2840-8))描述了通過使用過繼T細胞轉移療法結合皰疹性口腔炎病毒的瘤 內病毒療法來提高腫瘤抗原特異性T細胞的循環水平。Diaz等人在過繼T細胞轉移療法中 使用ΟΤΙ細胞，即人工單克隆細胞系。
[0009] 雖然即使在ACT的早期試驗中，也有治療效果突出，甚至治愈的例子，但多數患者 沒有受益，并且許多患者出現了嚴重的副作用。在過繼細胞療法的第一個二十年期間，細胞 轉移本身的安全性一般是好的，但顯著的毒性甚至死亡率與用于增強治療的聯合治療（包 括預處理化療和放療）和轉移后使用的IL-2相關。預處理用于殺死宿主中的抑制細胞如 調節性T細胞和骨髓衍生的抑制劑，以調節腫瘤微環境和為移植物"讓出空間"。轉移后使 用IL2以減少移植物的無能（anergy)并使之繁殖。
[0010] 關于功效，留下了改進空間。一般而言，保證了細胞療法的提高的特異性和足夠的 腫瘤殺傷能力。具體而言，在現有技術的ACT中，轉移細胞無法運輸至腫瘤，且即使它們行 進至腫瘤，它們也往往很快變成無能的，或者不能殺死腫瘤細胞或無法繁殖，導致細胞數量 快速下降。此外，癌癥經常下調腫瘤細胞中的人類白細胞抗原（HLA)-被認為是動物中的主 要組織相容性復合體，因而導致T細胞不能殺死，因為需要HLA來向T細胞受體呈現腫瘤表 位。
[0011] 本發明提供了利用過繼細胞轉移進行癌癥治療的有效工具和方法。
[0012] 發明概述
[0013] 本發明的一個目的是提供克服低效率、不安全且不可預測的癌癥療法的上述問題 的簡單方法和工具。更具體地，本發明提供用于細胞療法的新穎方法和手段。本發明的目 的通過其特征在獨立權利要求中所聲明的病毒載體、方法和布置（arrangement)實現。本 發明的具體實施方案在從屬權利要求中公開。
[0014] 本申請描述了重組病毒載體的構建、與病毒載體有關的方法以及它們在腫瘤細胞 系、動物模型和癌癥患者中的用途。
[0015] 本發明是基于以新穎和創造性的方式將編碼細胞因子的溶瘤腺病毒載體或腺病 毒載體與過繼細胞療法結合用于癌癥治療的想法。本發明是基于令人驚喜的效果，即，過繼 T細胞療法中的以下改進：i)到腫瘤的轉移細胞的聚集（recruitment) ;ii)腫瘤處轉移細 胞的繁殖；iii)腫瘤處轉移細胞的增強的反應性（圖20)。實際上，病毒載體和細胞因子與 過繼細胞療法的所述結合提供了對比可能被假定的更寬的靶標的更有效的結果。與單獨的 包含細胞因子轉基因的病毒載體或單獨的過繼細胞轉移的效果相比，包含細胞因子轉基因 的病毒載體與過繼細胞轉移的所述結合的效果是協同性的。
[0016] 本發明的另一個目的是提供用于人體中惡性腫瘤的治療的腫瘤浸潤淋巴細胞 (TIL)和轉基因（由病毒遞送的轉基因產生的）白細胞介素-2 (IL-2)的結合。本發明的上 述和各種其他目的和優點通過一種治療人體中惡性腫瘤的方法來實現，該方法包括：在有 或沒有預處理化療和/或放療的情況下，對患有癌癥的患者施用有效量的TIL和IL-2,以引 起癌癥的消退或穩定。
[0017] 本發明涉及治療受試者中癌癥的方法，其中該方法包括對受試者分開施用過繼細 胞治療組合物和編碼至少一種細胞因子的溶瘤（=腫瘤而不是正常細胞中的復制能力）腺 病毒載體。
[0018] 本發明還涉及用于癌癥治療的編碼至少一種細胞因子的溶瘤腺病毒載體以及分 開的過繼細胞治療組合物。
[0019] 本發明還涉及編碼至少一種細胞因子的溶瘤腺病毒載體以及分開的過繼細胞治 療組合物在制備用于治療受試者中癌癥的藥物中的用途。
[0020] 本發明還涉及用于提高受試者中過繼細胞療法或T細胞療法的功效的溶瘤腺病 毒載體。
[0021] 而且，本發明涉及溶瘤腺病毒載體在制備用于提高受試者中T細胞療法的療效的 藥物中的用途。
[0022] 而且，本發明涉及通過對有需要的受試者施用溶瘤腺病毒載體來提高受試者中過 繼細胞療法或T細胞療法的功效的方法。
[0023] 本發明還涉及藥物試劑盒，其包含過繼細胞治療組合物和編碼至少一種細胞因子 的溶瘤腺病毒載體，其中過繼細胞治療組合物被配制在第一劑型（formulation)中，和編 碼至少一種細胞因子的溶瘤腺病毒載體被配制在第二劑型中。
[0024] 此外，本發明涉及一種溶瘤腺病毒載體，其包含：
[0025] 1)包含5/3嵌合纖突結（chimeric fiber knob)的血清5型腺病毒（Ad5)核酸骨 架；
[0026] 2)用于E1A的腫瘤特異性表達的E2F1啟動子；
[0027] 3)腺病毒E1的Rb結合恒定區2中的24bp缺失（D24);
[0028] 4)病毒gpl9k和6. 7k閱讀框的核酸序列缺失；以及
[0029] 5)E3區中的缺失的gpl9k/6. 7K處的導致病毒E3啟動子下轉基因表達的復制相 關控制的編碼至少一種細胞因子轉基因的核酸序列，其中該細胞因子選自：干擾素 α、干 擾素 β、干擾素 γ、補體 C5a、IL-2、TNF(腫瘤壞死因子）a、CD40L、IL12、IL-23、IL15、 IL17、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14-1、CCL14-2、CCL14-3、CCL15-1、CCL15-2、CCL16、 CCL17、CCL18、CCL19、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23-1、CCL23-2、CCL24、CCL25-1、 CCL25-2、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL3L1、CCL4、CCL4L1、CCL5( = RANTES)、CCL6、CCL7、 CCL8、CCL9、CCR10、CCR2、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCRL1、CCRL2、CX3CL1、CX3CR、CXCL1、 CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、 CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL9、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7 和 XCL2。
[0030] 此外，本發明涉及一種血清3型（Ad3)溶瘤腺病毒載體，其包含：Ε3區中的缺失和 E3的缺失區處的用于轉基因的表達的腫瘤特異性啟動子。
[0031] 進而，本發明涉及一種藥物組合物，其包含本發明的溶瘤載體。
[0032] 而且，本發明涉及一種治療受試者中癌癥的方法，其中該方法包括對有需要的受 試者施用本發明的溶瘤腺病毒載體。而且，本發明涉及用于癌癥治療的本發明的溶瘤腺病 毒載體。
[0033] 而且，本發明涉及本發明的溶瘤腺病毒載體在制備用于治療受試者中癌癥的藥物 中的用途。
[0034] 本發明布置的優點是治療效果增強和副作用降低。預防了嚴重不良事件，甚至死 亡，因為療效的增強和我們的方法的抗抑制效果可降低對現有技術方法中用于為轉移細胞 "讓出空間"和減少腫瘤免疫抑制的預處理化療和/或輻射的需要。而且，預防了嚴重不良 事件，甚至死亡，因為如果在腫瘤中復制時病毒產生IL2,則不需要分開加入現有技術方法 中用于在將細胞轉移進患者之后繁殖和維持轉移細胞的IL2。腫瘤處的局部產生也可以增 強IL-2的受追捧效果（sought-after effects)(移植的刺激和繁殖），同時減少導致不良 事件的全身性暴露。本發明提供了選擇性治療，對健康組織的毒性或損傷更小。
[0035] 而且，本發明通過以下提供了令人驚喜的治療效果：i)例如通過將包含重組細胞 因子的病毒載體注射進腫瘤中來向腫瘤提供運輸（trafficking)信號。病毒注射導致產生 與這種效果（對與病原體相關分子模式識別受體結合的病毒的反應）相關的細胞因子，但 是通過額外產生最相關的細胞因子作為來自病毒的轉基因可以實現好得多的效果。ii)通 過增加危險信號減少了耐受性。病毒注射本身可以通過與病原體相關分子模式識別受體結 合實現這一點，但效果可以通過額外產生細胞因子作為來自病毒的轉基因來增強。iii)誘 導HLA表達。病毒感染增加了 HLA表達，因為細胞試圖呈現用于安裝抗病毒T細胞應答的 病毒表位。出乎意料的是，這可以用來增強需要HLA起作用的針對腫瘤抗原表位的T細胞 療法。病毒對HLA的效果部分地由細胞因子介導；在本發明的一個令人驚喜的實施方案中， 所述由病毒產生細胞因子可以因此也在附近的腫瘤細胞中誘導HLA表達。iv)通過解除由 病毒本身的存在（再次通過病原體相關分子模式識別受體）介導的但通過產生細胞因子增 強的免疫抑制來誘導細胞的繁殖（圖48)。因此，這種方法可以解決目前阻礙自適應細胞療 法的關鍵障礙。
[0036] 附圖簡要說明
[0037] 下面將借助于具體實施方案并參照附圖更詳細地描述本發明，附圖中：
[0038] 圖1示出用Ad5/3嵌合溶瘤腺病毒處理增加了 B16-0VA腫瘤中的細胞因子和趨化 因子分泌。干擾素 γ可以上調HLA( = MHC) I類的表達，從而生成可以由TIL有效地識別 的腫瘤細胞表型。可促進TIL活化和增殖的免疫細胞聚集中涉及各種IFN-γ誘導趨化因 子（如RANTES、MIP-la和MCP-1)。而且，TIL的運輸可以通過這些趨化因子的上調而得到 增強。
[0039] 圖2示出了在有或沒有過繼細胞轉移情況下多次注射5/3嵌合溶瘤腺病毒后的腫 瘤生長控制。相較于PBS治療，單獨使用腺病毒處理（A)對B16-0VA腫瘤生長的影響很小。 500000(B)或2000000(C)個腫瘤特異性0Τ-Ι淋巴細胞的過繼轉移與病毒注射聯用導致顯 著的腫瘤生長控制。單獨使用腺病毒或0Τ-Ι細胞與PBS聯用對腫瘤生長的較差治療效果 突出了用作單一試劑的溶瘤腺病毒和過繼細胞轉移療法的主要缺點，支持本發明的目的， 以使用腺病毒增強過繼細胞療法的功效。
[0040] 圖3示出腺病毒注射誘導T細胞運輸進腫瘤和增加腫瘤中過繼轉移T細胞的增 殖。A)在治療后第1天引流Ad治療小鼠的淋巴結和脾，據稱由于淋巴細胞運輸，過繼轉 移CD8+CFSE+細胞的量在腫瘤中增加和在血液中減少。在整個實驗中，整體CD8+T細胞計 數在腺病毒處理的腫瘤中保持很高，表明這些細胞對有害腫瘤微環境的抗性和/或增加的 CD8+T細胞增殖。B)相較于PBS組，在第6和14天，在Ad治療的腫瘤中0Τ-Ι細胞增殖增 強，被視為已經經過細胞分裂的細胞（移向M7)比PBS組中的細胞占據更大的比例。因此， 用溶瘤腺病毒處理誘導了過繼轉移TIL的運輸和增殖。C)關于如何進行CFSE陽性細胞的 設門（gating)的實例已完成。M0表示還沒有分裂的細胞，M7表示已分裂的足以將CFSE稀 釋到可檢測極限以下（7倍以上）的細胞。
[0041] 圖4揭示了在箭頭指示的天數來自用溶瘤腺病毒治療的人的數據。病毒注射到腫 瘤中導致血液中的淋巴細胞減少，反映了它們到腫瘤的運輸。
[0042] 圖5揭示了溶瘤腺病毒注射到人癌癥患者的腫瘤中引起CD8+T細胞的流通 (influx)的數據。溶瘤腺病毒的瘤內注射引起腫瘤處CD8+T細胞的積聚，其在治療前和治 療后由針活檢評估。
[0043] 圖6示出了與T細胞的過繼轉移聯用的腺病毒注射的結果。用5 X ΙΟ5 0T1淋巴細 胞對患有皮下B16-〇va腫瘤的小鼠進行腹腔內（intraperitoneally)過繼轉移并且不處理 腫瘤，或者用PBS或Ad5/3注射（參見實施例材料和方法）。在類似于人黑色素瘤的免疫抑 制B16_0va模型中，抗Ova 0T1細胞的過繼轉移很少。添加病毒注射顯著提高了療效（a)。 ⑶8+T細胞增加（b)。這些細胞不是抗Ova T細胞（c)。
[0044] 圖7揭示了由于過繼轉移和病毒注射而使"天然"抗腫瘤T細胞的數量的急劇增 加。對患有皮下B16-〇va腫瘤的小鼠腹腔內過繼轉移5X 105 0T1淋巴細胞并且不處理腫 瘤，或者用PBS或Ad5/3注射（參見實施例材料和方法）。過繼轉移+病毒注射行為起到用 于腫瘤和局部淋巴結處"其他"T細胞的繁殖的催化劑作用。（a)腫瘤部位處的Trp2 CD8+ 細胞。（b)腫瘤部位處的抗gp100 CD8+細胞。
[0045] 圖8示出了第14天時腫瘤中的活化⑶8+細胞和腫瘤中的??Μ-3表達。對患有皮 下B16-〇va腫瘤的小鼠腹腔內過繼轉移5X ΙΟ5 0T1淋巴細胞并且不處理腫瘤，或者用PBS 或Ad5/3注射（參見實施例材料和方法）。免疫治療中的免疫抑制：如果未解除免疫抑制， 則T細胞數量的增加不足。在病毒處理的腫瘤中有更多的活化T細胞和較少的免疫抑制。
[0046] 圖9示出了抗腫瘤T細胞的增加和免疫抑制的減少導致針對腫瘤抗原的全身免疫 性。對患有皮下B16-〇va腫瘤的小鼠腹腔內過繼轉移5X105 OTl(a)或2X106(b)0Tl淋巴 細胞并且不處理腫瘤，或者用PBS或Ad5/3注射（參見實施例材料和方法）。通過病毒增強 抗原遞呈：T細胞工作更好。抵抗幾種腫瘤抗原表位的全身免疫導致：(a)第14天時腫瘤中 樹突狀細胞（⑶llc+⑶80+⑶86+)上共刺激分子的表達；(b)第14天時具有脾細胞的IFNg ELISPOT。
[0047] 圖10示出了病毒注射后的ΟΤΙ T細胞的分布：具有運輸趨勢，但不足以解釋療效。 (a)圖表，（b)動物模型，（c)腫瘤。
[0048] 圖11揭示了解除免疫抑制可誘導細胞的繁殖。腺病毒處理的腫瘤含有更多的腫 瘤特異性淋巴細胞（0Τ-Ι細胞）。在PBS處理的腫瘤中，0ΤΙ細胞己滯留在M5階段（左箭 頭），而在Ad組中，它們繼續增殖（右箭頭）。
[0049] 圖12示出了與0T1細胞聯用的重組細胞因子（無病毒）的功效。
[0050] 圖13示出了與過繼T細胞轉移聯用的武裝有細胞因子的腺病毒的抗腫瘤功效。 在第1天，用富集有1.5X10e6⑶8+的0T-1 T細胞對承受皮下B16-0VA黑素瘤腫瘤的 C57BL/6小鼠進行腹腔內治療。在第1天及此后每周將細胞因子編碼的腺病毒或對照病 毒Ad5-Lucl進行瘤內注射（每個腫瘤1 X 10e9病毒顆粒）。按之前所描述的計算腫瘤體 積（Bramante 等，Serotype chimeric oncolytic adenovirus coding for GM-CSF for treatment of sarcoma in rodents and humans (編碼用于治療嗤齒動物和人類中肉瘤的 GM-CSF的血清型嵌合溶瘤腺病毒），Int J Cancer (國際癌癥雜志），2013年12月24日）， 且腫瘤大小被表示為相對于設定為100%的第1天的百分比。風險圖中的數量：在給定時 間點各實驗組中剩余的動物的數量。當腫瘤已經超過最大可接受大小時，或者當疼痛或痛 苦的任何跡象很明顯時，將動物人道處死。
[0051] 圖14示出了不同病毒對腫瘤大小的影響。
[0052] 圖15示出了與ΟΤΙ T細胞聯用的包含mTNFa轉基因的腺病毒載體對減小腫瘤大 小的優異結果。
[0053] 圖16示出了與ΟΤΙ T細胞聯用的包含mIL3轉基因的腺病毒載體對減小腫瘤大小 的優異結果。
[0054] 圖17示出了表達C5a或TNF-α的溶瘤腺病毒的示意圖。示出了病毒的一些重要 特征，包括插入轉基因的位點。
[0055] 圖18示出了由A549細胞中溶瘤腺病毒進行的TNF- a表達。用10 VP/細胞感染 細胞，在指定時間點收集培養基，并使用ELISA來評估培養基中TNF-a的量。病毒誘導來 自感染細胞的TNF- a的表達和分泌。
[0056] 圖19示出了由溶瘤TNF- a武裝的溶瘤腺病毒產生的TNF- a的生物活性。在該 試驗中，使用來自感染細胞的上清液來挑戰TNF敏感型WEHI