旋-2，3-雙(正丁氧基)丁烷-1，4-二硫醇
[0199] 實施例7b:內消旋-2，3-雙(4-壬基苯基甲氧基)丁烷-1，4-二硫醇
[0200] 實施例7c:內消旋-2，3-雙(二苯基-4-甲氧基)丁烷-1，4-二硫醇
[0201 ] 實施例7d: 4，6_雙(癸氧基)苯-1，3-二甲硫醇
[0202] 實施例7e:4,5_雙(癸氧基)苯_1，2_二甲硫醇
[0203] 實施例7f: 3，4-雙(癸氧基)噻吩-2，5-二甲硫醇
[0204]實施例8A:取代的PEG琥珀酸酯
[0205]除了使用2-十二碳烯-1-基琥珀酸酐替代馬來酸酐外，遵照實施例1的方法。十二 碳烯基取代基提供了最終的聚合物中的懸垂的C鏈。
[0206] 通過這一方法，將下列取代的琥珀酸酐用PEG酯化：
[0207]實施例8Aa:異丁烯基琥珀酸酐 [0208] 實施例8Ab:2_辛烯-1-基琥珀酸酐
[0209]實施例8Ac:十八烯基琥珀酸酐 [0210] 實施例8Ad: 3-氧雜二環-己烷-2，4-二酮
[0211] 實施例8Ae:環己烷二羧酸酐
[0212] 實施例8Af:鄰苯二甲酸酐
[0213] 實施例8Ag: 4-癸基鄰苯二甲酸酐 [0214] 實施例8Ah:六氫甲基鄰苯二甲酸酐 [0215]實施例8Ai:四氫鄰苯二甲酸酐 [0216]實施例8Aj :降冰片烯二羧酸酐 [0217]實施例8Ak:斑蜜素
[0218]實施例8A1:二環辛烯二羧酸酐
[0219] 實施例8Am:外_3,6_環氧-1，2,3,6_四氫鄰苯二甲酸酐
[0220] 實施例8An: S-乙酰基巰基琥珀酸酐
[0221] 實施例8B:具有懸垂的烷基基團的PEG-二(烷基酰胺基琥珀酰)二硫醚
[0222] 通過實施例1的方法，將如實施例8A和8Aa至8An中的描述所得到的取代的PEG琥珀 酸酯與DTT反應。
[0223] 通過這一方法，將下列二硫醇與如實施例8A和8Aa至8An中的描述所得到的取代的 PEG琥珀酸酯的任何一種反應：
[0224] 實施例8Ba:乙烷_1，2_二硫醇
[0225] 實施例8Bb:丙烷-1，3-二硫醇
[0226] 實施例8Bc: 丁烷_1，4_二硫醇
[0227] 實施例8Bd:戊烷_1，5_二硫醇
[0228] 實施例8Be:己烷-1，6_二硫醇
[0229] 實施例8Bf:l，4_苯二硫醇
[0230] 實施例8Bg: 1，3-苯二硫醇
[0231] 實施例8Bh:l，4_苯二甲硫醇
[0232] 實施例8Bi:l，3_苯二甲硫醇
[0233] 實施例8Bj:l，2_苯二甲硫醇
[0234] 實施例8C:具有懸垂的烷基基團的PEG-二胺共聚物
[0235] 通過實施例6B的方法，將如實施例8A中的描述所得到的取代的PEG琥珀酸酯與1， 4_二氨基丁烷共聚。
[0236] 通過這一方法，將下列二胺與實施例8A和8Aa至8An中的取代的PEG琥珀酸酯的任 何一種共聚：
[0237] 實施例8Ca:2 0-B0C_l，3-二氨基-2-丙醇
[0238] 實施例803:1/，N〃_二(B0C)六亞乙基四胺
[0239] 實施例SCc:^，N"_二(B0C)精胺
[0240] 實施例SCcUY-BOC亞精胺
[0241 ] 實施例SCe:^，，，^/〃-三(B0C)六亞乙基六胺
[0242]實施例8Cf:胍基丁胺 [0243]實施例8Cg:賴氨酸叔丁酯
[0244] 實施例8Ch:l，6_二氨基己烷
[0245] 實施例8Ci:l，4_苯二胺
[0246] 實施例8Cj:l，3_苯二胺
[0247] 實施例8Ck: 1，4-二氨基丁烷-2，3-二醇丙酮化合物
[0248] 實施例9:使用取代的酸的PEG酯交換反應
[0249] PEG二甲苯磺酸酯：在氬氣下攪拌的同時向lmol的PEG(溶解于DMF或為熔化的）中 加入2. lmol的甲苯磺酰氯(5 %的摩爾過量）。向反應混合物中加入2.2mo 1的四甲基乙二胺 (TEMED)。之后將反應于45°C孵育2h。用乙酸乙酯、甲苯或乙醇作為TLC溶劑通過TLC分離產 物。可用甲苯從反應混合物中萃取PEG二甲苯磺酸酯。代替甲苯磺酰氯，也可使用其他的磺 酰化劑例如甲磺酰氯(參見實施例4)、三氟甲磺酸酐或三氟代乙烷磺酰氯(參見美國專利申 請 10/397332,公開第 20040006051號）。
[0250] PEG二甲苯磺酸酯的聚酯化:伴隨著氬氣下的攪拌，向lmol的熔化的PEG二甲苯磺 酸酯中加入lmo 1的S，S'-二癸基-內消旋-2，3-二巰基琥珀酸和2mo 1的TEMED。如維持流動性 所必需的加入DMF。將反應混合物加熱至80°C并攪拌24h或直到通過TLC監測完成。
[0251] 實施例10:PEG_二(琥珀酰基)_二-(0_酰化)硫醚中等分子量聚合物(C16-JI-聚合 物B)
[0252]
[0253] 將如實施例1中所制備的PEG-二馬來酸酯（10.248,6.1111111〇1)置于干燥的1251111燒 瓶中，并在氬氣下加熱至70 °C以熔化PEG-二馬來酸酯。在攪拌下，向熔化的材料中加入水 (10111〇和溶于水（311^)的01'1'(0.9618,6.168_〇1)和1￡]\^0(0.7238,6.166111111〇1)的溶液。將 溶液于70 °C攪拌約4h。在真空中除去水以約90 %的產率獲得固體聚合物。
[0254] 將干燥的聚合物（5g，2.7mmol)在氬氣下加熱至70_90°C以使其熔化，并且加入 TEMED(0.635g，5.5mmol)。伴隨攪拌加入棕櫚酰氯（1.689g，5.5mmol)并將混合物在氬氣下 攪拌過夜。（可改變聚合物與酰基氯的比例以獲得從0-100%的化學計量的取代度。）向反應 混合物加入水以分離"Cl6-JI-聚合物B"。
[0255] 通過這一方法將下列酸用二(琥珀酰基)PEG-DTT共聚物的羥基基團酯化：
[0256] 實施例10a:油酸
[0257] 實施例10b:膽固醇琥珀酸酯
[0258] 實施例10c:二苯基-4-羧酸
[0259] 實施例10d: 4-辛基苯乙酸
[0260] 實施例10e:十六碳-6-炔酸
[0261 ]作為使用酰基鹵的替代，Jr-聚合物的DTT來源的羥基基團也可被1，3-雙(2，2-二甲 基-1，3-二氧戊環-4-基甲基）碳二亞胺(BDDC)活化并直接與羧酸偶聯；參見Handbook of Reagents for Organic Synthesis?Reagents for Glycoside^Nucleotide?and Peptide synthes i s (用于有機合成的試劑、用于糖苷、核苷酸和肽的合成的試劑的手冊），David Crich編輯，Wiley，2005第107-108頁及其參考文獻）。
[0262] 實施例11 :C16-3t-聚合物A的羧基取代的酯.
[0263] 使用標準的肽鍵形成方法(例如通過碳二亞胺試劑），將羧酸取代的聚合物用于連 接具有反應性氨基基團的配體以將氨基基團連接至聚合物的羧酸官能度。通過以環酐酯化 聚合物羥基基團能容易地獲得這些材料。例如通過將馬來酸酐與C16-JI-聚合物A羥基基 團如下反應來制備C16-JI-聚合物A二馬來酸酯：
[0264] 將C16-JI-聚合物A(2g)和馬來酸酐(0.85g)在干燥研缽中研磨并轉移到50mL圓底 燒瓶。將燒瓶于90°C在氬氣下攪拌加熱2-3h。之后將固體反應混合物研磨并用水調成漿，并 將混合物轉移至透析袋(3.5kDa截留）。將混合物對水透析以除去過量的馬來酸和低分子量 的副產物，并將滲余物從透析袋中取出，于60°C干燥至恒重，以獲得C16-JI-聚合物A二馬來 酸酯（1.79g)。可改變聚合物A與馬來酸酐的比例以獲得從0-100%的全化學計量酯化變化 的取代。
[0265] 實施例1 la: C16-JI-聚合物A二甘醇酸酯
[0266] 將C16-JI-聚合物A(2g)和二甘醇酸酐（l.Og)通過上文實施例11的方法反應以得到 C16-JI-聚合物A二甘醇酸酯。如同馬來酸酐一樣，可改變聚合物A與酸酐的比例以獲得從0-100%的全化學計量酯化變化的取代。
[0267] 實施例1 lb: C16-JI-聚合物A雙(烏頭酸酯）
[0268] 將C16-JI-聚合物A(2g)和烏頭酸酐（1.35g)通過上文實施例11的方法反應以得到 C16-JI-聚合物A雙(烏頭酸酯）。
[0269] 以相似的方式，下列酸酐與C16-JI-聚合物A偶聯。當使用低溶解度的酸酐時，作為 對純化的輔助，可在透析之前將pH調至4.5和6.5之間。如果需要，對0.1 N HC1第二次透析提 供了聚合物的酸性形式。
[0270] 實施例11c:琥珀酸酐 [0271]實施例lid:戊二酸酐 [0272] 實施例lie:鄰苯二甲酸酐
[0273] 通過與馬來酸酐或順式烏頭酸酐的酯化引入的反應性雙鍵也可被用于將含硫醇 的配體加至聚合物，如下文實施例12中所描述的。
[0274] 實施例12:C16-3t-聚合物A二馬來酸酯的半胱氨酸加合物：
[0275]將粉末的C16-JI-聚合物A二馬來酸酯（實施例ll)(253mg)加至水(5mL)并且有力地 攪拌混合物。向反應混合物加入半胱氨酸(24mg)和TEMED(30.5ul)，并且于室溫在氬氣氣氛 下攪拌混合物。通過TLC(硅膠板，正丁醇-乙酸-水，3:1:1)使用茚三酮的檢測來監測反應的 過程。反應混合物顯示出與聚合物共迀移的陽性的茚三酮點。半胱氨酸也產生陽性的茚三 酮點，然而起始聚合物與茚三酮不產生任何顏色。
[0276] 使用具有多個羧基取代基的硫醇，上文所描述的方法被用于引入用作連接點的另 外的羧基基團。例如將巰基琥珀酸加至下列C16-JI-聚合物A二酯：
[0277] 實施例12a:C16-Ji-聚合物A二馬來酸酯
[0278] 實施例12b:C16-Ji-聚合物A二丙烯酸酯 [0279]實施例12c :C16-3t-聚合物A(雙)烏頭酸酯
[0280]
[0281] 實施例12c
[0282] 以相似的方式，3-巰基戊二酸被加至下列C16-JI-聚合物A二酯：
[0283] 實施例12d:C16-Ji-聚合物A馬來酸氫酯
[0284] 實施例12e:C16-Ji-聚合物A二丙烯酸酯
[0285] 實施例12f:C16-Ji-聚合物A(雙)烏頭酸酯
[0286] 3.靶向部分到31-聚合物的連接
[0287] 實施例1:葉酸到C16-JI-聚合物A的連接
[0288] 將葉酸(2mmol)溶于無水DMS0,并與二環己基碳二亞胺(DCC)于環境溫度反應以形 成內酐。之后向這一反應混合物加入等摩爾量的鹽酸半胱胺和TEMED，并將反應混合物在氬 氣下于環境溫度攪拌24h，通過TLC監測反應。反應完成后，將反應混合物在真空下過濾以除 去反應副產物。將濾出液用甲醇稀釋以沉淀橘黃色產物。將沉淀物用甲醇調成漿并過濾，以 除去殘留的二環己脲和DMS0。用El lman試劑，葉酸-半胱胺輒合物（S . Atkinson， J. Biol. Chem.，276(30): 27930-27935)產生自由巰基基團的陽性測試，并且TLC沒有顯示半 胱胺的存在。
[0289]之后將葉酸-半胱胺輒合物在氬氣下與C16-JI-聚合物A的二馬來酸酯（實施例11， 由具有約1500分子量的PEG制備）反應。為了保持聚合物聚集體的親水性，將足以消耗僅 50 %的可用的馬來酸酯基團的量的葉酸-半胱胺輒合物加至聚合物。用TEMED將反應混合物 的pH調至6.5-7.5，并且將混合物在氬氣氣氛下攪拌過夜。之后使用3.5kD截留膜將反應混 合物對水透析以除去任何小分子量副產物和雜質。取出滲余物并將其用于下文描述的藥物 包封和細胞培養測定。
[0290]實施例2:表皮生長因子(EGF)到C16-JI-聚合物A的連接
[0291] 將表皮生長因子(Sigma)用溶于pH 7.4的roS-EDTA緩沖液中的2個當量的2-亞氨 基硫烷(Sigma)硫醇化，并將硫醇化的EGF通過實施例1中描述的方法連接到C16-JI-聚合物A 的二馬來酸酯。將輒合EGF的聚合物通過超濾純化并用PBS清洗，并且滲余物被用于制備靶 向的包封聚合物。
[0292] 實施例3:抗-EGFR單克隆抗體到C16-JI-聚合物A的連接
[0293]將為腹水的鼠科的抗EGFR單克隆抗體（Sigma)根據制造商的說明書通過在 AffinityPak?固定蛋白A(Pierce)柱上層析來純化。在pH 7.4的PBS緩沖液中，通過實施例1 中描述的方法將純化的抗體硫醇化并輒合至C16-JI-聚合物A的二馬來酸酯，并通過超濾純 化。
[0294] 4.抗癌化合物的包封
[0295] 實施例1:將喜樹堿包封在C16-JI-聚合物A中：
[0296] 將喜樹堿（10mg，Sigma)溶解于DMS0中并與溶于DMS0的C16-JI-聚合物A(100mg，來 源于PEG 1.5kD)的溶液混合。將凝膠狀的混合物超聲波約10-30分鐘，用水稀釋，并離心以 除去任何固體。通過TLC測試澄清的上清液中包封的喜樹堿的存在為陽性。
[0297] 實施例2:將多柔比星包封在C16-JI-聚合物A中：
[0298] 將鹽酸多柔比星(5mg，Sigma)溶解于水中并用當量的TEMED處理以將鹽酸鹽轉化 為自由胺形式。之后向所得的自由胺形式加入溶于DMS0的C16-JI-聚合物A( 100mg，來源于 PEG 1.5kD)的溶液，并且如上文實施例1中所描述的將混合物加